抗瘧疾的初始/加強免疫疫苗的製作方法

2023-06-16 19:05:31

專利名稱：抗瘧疾的初始/加強免疫疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域。具體而言，本發明涉及採用重組方法產生的腺病毒載體和純化蛋白、並與佐劑相結合用於預防惡性瘧疾的新的初始/加強免疫(prime/boost)疫苗策略。
背景技術：
當前，瘧疾在全世界是熱帶和亞熱帶地區最為流行的感染疾病之一。每年，瘧疾感染在發展中國家造成大約兩百七十萬人死亡。瘧疾廣泛流行和發病率升高的原因在於耐藥寄生蟲和抗殺蟲劑的寄生蟲載體數量的增加。其他因素包括環境和氣候的改變、國家動蕩以及人口流動性增加。
瘧疾是由屬於瘧原蟲屬的、由蚊媒傳播的血液內原生動物寄生蟲引起的。對人類致病的有4種瘧原蟲(惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)和三日瘧原蟲(P.malariae))；其他多種則在動物中引起疾病，例如約氏瘧原蟲(P.yoelii)和柏格氏鼠瘧原蟲(P.berghei)。人類感染大多由惡性瘧原蟲導致，並且是致死率最高的類型。瘧原蟲的生命周期由4個不同的階段組成。這些階段中的每一個均能夠誘導針對這種寄生蟲以及相應出現的階段特異性抗原的特異性免疫應答，不過，自然發生的瘧疾不能產生抗再次感染的保護性。
瘧疾寄生蟲由若干種雌性按蚊傳播給人類。被感染的蚊子將來自瘧原蟲的子孢子注射到哺乳動物的血流中。子孢子在侵入肝細胞前在循環中停留幾分鐘。在這一階段，寄生蟲處於細胞外環境中，可以受到抗體的攻擊，這些抗體主要針對的是環子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白，後者是子孢子表面的主要成分。一旦進入肝臟，寄生蟲即可複製並成為裂殖體。在這一階段，侵入性寄生蟲將進行無性繁殖，在每個感染的細胞中產生多達20,000個姊妹裂殖子。在寄生蟲的這一細胞內階段，宿主免疫應答的主要角色是T-淋巴細胞，特別是CD8+T-淋巴細胞(Romeroet al.1989)。大約在感染肝臟一周後，數千裂殖子釋放至血流中並進入紅細胞(RBC)，成為抗體介導的免疫應答和T細胞分泌的細胞因子的靶位。侵入紅細胞後，裂殖子歷經若干階段的複製，轉變為滋養體和裂殖體，它們破裂後產生新一代的裂殖子，繼而感染新的RBC。紅細胞階段與明顯的臨床疾病相關。少量滋養體可成為雄性或者雌性配子母細胞，這是寄生蟲的有性階段。當易感的蚊子吞入配子母細胞時，這些配子發生受精，形成合子，隨後轉變為動合子，然後轉變為卵囊，且最終轉變為子孢子，子孢子遷移至唾液腺以完成周期。
寄生蟲進入體內後出現的病原體特異性免疫應答的兩個主要方面是細胞應答和體液應答，細胞應答這一方面涉及參與免疫應答的CD8+和CD4+T細胞。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表達CD8並能夠特異性殺傷表面表達病原體抗原的感染細胞。CD4+T細胞或T輔助細胞支持CTL的產生，產生各種細胞因子，並且還幫助誘導B細胞分裂並產生特異於抗原的抗體。在體液應答中，特異於具體抗原的B細胞被激活，複製、分化並產生抗原特異性抗體。
免疫應答的這兩方面均與抗瘧疾感染的保護作用相關。當感染性子孢子移至肝臟並進入肝細胞後，子孢子成為細胞內病原體，極少出現在感染細胞外。在這一階段，CD8+T細胞和CD4+T細胞是尤其重要的，這是由於T細胞及其細胞因子產物例如幹擾素-γ(IFN-γ)，可殺死感染的宿主肝細胞。在鼠科動物模型中發現，肝臟細胞內的寄生蟲的清除依賴於針對肝臟階段寄生蟲所表達的肽的CD8+T細胞應答(Hoffman andDoolan，2000)。去除CD8+T細胞可消除抗子孢子攻擊的不戶作用，而給未經過試驗的動物( animals)過繼性轉移CD8+T細胞則可使之得到保護。
當瘧疾感染達到裂殖子在RBC內複製的紅細胞階段時，裂殖子也隨血流到處循環。由於紅細胞不表達用於與T細胞發生同源相互作用(cognate interaction)的I類或II類MHC分子，因此認為在這一階段抗體應答最為重要。總之，如果能夠誘導強的細胞免疫應答以及強的體液免疫應答來對付寄生蟲在人體中的各個不同階段，那麼這樣的的瘧疾疫苗策略將是最為有益的。
根據如上所述的寄生蟲的不同發育階段可以對當前的開發瘧疾疫苗的方法進行分類。可以將可能的疫苗分為3種類型-前紅細胞疫苗(Pre-erythrocytic vaccines)，它們針對的是被子孢子和/或裂殖體感染的肝細胞。在歷史上，基於(CS)的策略一直佔據著這一方法的主導地位。由於前紅細胞階段的感染沒有症狀，因此理想地，前紅細胞疫苗應該產生由體液和細胞免疫應答介導的無菌免疫(sterile immunity)，並完全預防潛伏的瘧疾感染。
-無性血液階段疫苗，它們針對的是被感染的RBC或者裂殖子本身，其被設計為用於儘量減輕臨床症狀的嚴重程度。這些疫苗應該能夠降低發病率和死亡率，並可預防寄生蟲進入紅細胞和/或在其中繁殖。
-阻斷傳播疫苗，它們被設計用於妨礙寄生蟲在蚊子宿主內的發育。這一類型的疫苗應該有助於降低整個人群的瘧疾感染率。
最後，一直在所謂的多成分和/或多階段疫苗中尋求開發針對寄生蟲生命周期的多個階段的組合瘧疾疫苗的可行性。
儘管抗瘧疾疫苗的開發早在30多年前就開始了，但現在還沒有商品化的抗瘧疾疫苗。以輻照減毒的子孢子免疫齧齒動物、非人類靈長類動物和人類可產生抗隨後以活子孢子攻擊的保護作用(Nussenzweig et al.1967；Clyde et al.1973)。不過，費用問題以及缺乏用於生產經照射的子孢子的可行的大規模培養體系目前仍然妨礙此類疫苗的廣泛應用(Lukeet al.2003)。
迄今為止，在人類中測試的最為有前途的候選疫苗一直基於少數子孢子表面抗原。CS蛋白是已經被證實的當其在人類作為抗蚊媒感染的活性免疫基礎時能夠穩定預防瘧疾的唯一的惡性瘧原蟲抗原，儘管預防的水平經常是不充分的。理論分析指出，疫苗的覆蓋率以及疫苗的功效應該高於85％，否則，致病力更強的突變體會逃脫進入疫區(Gandon etal.2001)。
在哺乳動物誘導免疫應答的一種方式是通過施用感染性載體，在其基因組中載有編碼抗原的核酸。此類載體之一是重組腺病毒，該病毒已經通過去除基因組中通常是複製不可缺少的區域(例如E1區)而成為複製缺陷型。包含編碼抗原的基因的重組腺病毒的實例是本領域已知的(WO 96/39178)。例如，已經證實，如果通過重組腺病毒輸送來自HIV的抗原性成分，可產生免疫應答(WO 01/02607；WO 02/22080；US6,733,993)。對於瘧疾，已經開發出了基於重組腺病毒的疫苗。這些載體表達約氏瘧原蟲的完整CS蛋白，約氏瘧原蟲是小鼠瘧疾模型之一，且已經發現這些載體能夠應答於單一免疫劑量而在小鼠中誘導無菌免疫 et al.2001)。已經證實，CD8+T細胞主要介導這種腺病毒誘導的保護作用。
由於很高比例的個體對通常使用的腺病毒載體例如腺病毒血清型5(Ad5)存在已有的免疫力，因此本領域曾開發的新的技術，其中的重組複製缺陷型腺病毒是基於僅在一小部分健康個體中遇到以中和抗體形式存在的已有的免疫力的血清型。這些血清型通常被成為中和程度低的血清型(low-neutralized serotypes)或者少見血清型。已經發現Ad11，Ad24，Ad26，Ad34，Ad35，Ad48，Ad49和Ad50特別適用(WO 00/70071；WO02/40665；WO 2004/037294；WO 2004/083418；Vozels et al.2003)。
Vical，Inc.San Diego，CA，USA和Naval Medical Research Center(Horn et al.1995)開發了含有表達惡性瘧原蟲CS蛋白的質粒的基於DNA的疫苗。小鼠模型的研究證實以質粒DNA免疫之後誘導了抗原特異性CTL和抗體應答(Doolan et al.1998)。不過，目前唯一使用的DNA疫苗在人類誘導保護性免疫應答的作用並不理想。在使用DNA疫苗時發現被接種的志願者沒有出現抗CS蛋白的抗體，這是通過針對風乾的子孢子的間接螢光抗體測試(IFAT)以及通過抗重組及合成肽的ELISA而評估的(Wang et al.2001)，不過，這些志願者的CTL應答很明顯。
與此不同的是，RTS，S(純化蛋白)瘧疾疫苗方法(Gordon et al.1995；US 6,306,625；WO 93/10152)能夠誘導針對CS蛋白的強抗體應答(Kester et al.2001；Stoute et al.1997 and 1998)，不過其也是Th1型細胞免疫和體液免疫的強效誘導劑。最重要的是，該疫苗能夠可重複性地使大約半數接受疫苗者得到保護。不過，由RTS，S引發的保護作用持續時間較短(Stoute et al.1998)。以RTS，S免疫誘導抗CS抗體和CD4+T細胞依賴性IFN-γ誘導，但CD8+T細胞依賴性CTL或IFN-γ應答較弱(Lalvani et al.1999)。不過，已經證實所產生的此類最低限度的CD8+應答與人類試驗中的保護作用相關(Sun et al.2003)。因此，合理的改進應該是集中在增強誘導由RTS，S誘導的針對CS的CD8+T細胞應答。
迄今尚未達到開發具有至少85％的保護效力的惡性瘧疾疫苗這一目標。這一任務特別困難之處在於，不同於其他常見致命疾病例如麻疹和天花，先前感染過瘧疾以及所產生的天然免疫力對以後的瘧疾感染沒有保護作用。在迄今已經測試過的所有候選疫苗和疫苗輸送策略中，僅RTS，S一直穩定地產生了一定水平的保護作用。其他所測試的候選疫苗或者是免疫原性不足，或者是具有免疫原性但保護性不充分。本申請公開的策略在於組合疫苗製劑，其利用蛋白質/佐劑方法的最佳的血清學免疫原性並通過重組複製缺陷型腺病毒載體出色地誘導細胞應答。


圖1異源初始/加強免疫疫苗接種療法(Heterologous prime/boostvaccination regimens)，隨後通過IFN-γELISPOT分析測定與CS的C末端有關的T細胞應答。在末次加強免疫2周後測定應答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖2通過IFN-γELISPOT分析測定與CS的C末端有關的T細胞應答。在末次加強免疫3個月後測定應答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖3通過ELISA測定與CS的重複區有關的抗體應答，加強免疫後2周。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖4通過ELISA測定與CS的重複區有關的抗體應答，加強免疫後3個月。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖5T細胞應答，實驗中以重組Ad35-CS載體初始免疫並以RTS，S或Ad35-CS加強免疫，2周(左)或者3個月(右)後通過IFN-γELISpot進行測定。使用同源初始/加強/加強免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖6抗體應答，實驗中以重組Ad35-CS載體初始免疫並以RTS，S或Ad35-CS加強免疫，2周(左)或者3個月(右)後通過ELISA進行測定。使用同源初始/加強/加強免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖7T細胞應答，實驗中以重組Ad35-CS載體加強免疫並以RTS，S或Ad35-CS初始免疫，2周(左)或者3個月(右)後進行測定。使用同源初始/加強/加強免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖8抗體應答，實驗中以重組Ad35-CS載體加強免疫並以RTS，S或Ad5-CS初始免疫，2周(左)或者3個月(右)後進行測定。使用同源初始/加強/加強免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖9加強免疫後2周，通過IFN-γELISPOT分析測定與CS的N末端有關的T細胞應答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖10加強免疫後3個月，通過IFN-γELISPOT分析測定與CS的N末端有關的T細胞應答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖11針對N末端的T細胞應答，實驗中以重組Ad35-CS載體初始免疫並以RTS，S或Ad35-CS加強免疫，2周(左)或者3個月(右)後進行測定。使用同源初始/加強/加強免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖12針對N末端的T細胞應答，實驗中以重組Ad35-CS載體加強免疫並以RTS，S或Ad5-CS初始免疫，2周(左)或者3個月(右)後進行測定。使用同源初始/加強/加強免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。

發明內容
本發明涉及一種試劑盒，其包含存在於合適的賦形劑中的複製缺陷型重組腺病毒，所述腺病毒包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的環子孢子(CS)抗原的異源核酸；和佐劑化的蛋白質抗原，其優選地也來自引起瘧疾的寄生蟲；其中所述重組腺病毒選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。優選的蛋白質抗原包含RTS，S。優選的引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲。
在另一個實施方式中，本發明還涉及包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的CS抗原的異源核酸的複製缺陷型重組腺病毒以及佐劑化的蛋白質抗原(其優選地來自引起瘧疾的寄生蟲例如惡性瘧原蟲)在製備用於治療或預防瘧疾的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是猴腺病毒或人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49或50。
本發明公開了一些優選的初始-加強免疫療法，其中優選地將複製缺陷型重組腺病毒用作初始免疫組合物，而將佐劑化的蛋白質抗原用作加強免疫組合物。
本發明還涉及對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種的方法，其步驟包括以存在於合適的賦形劑中的複製缺陷型重組腺病毒對所述哺乳動物進行初始免疫，所述腺病毒包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的CS抗原的異源核酸；並以佐劑化的蛋白質抗原、優選地為RTS，S，對所述哺乳動物進行加強免疫。
發明詳述本發明涉及一種試劑盒，其包含存在於藥用可接受的賦形劑中的複製缺陷型重組腺病毒，所述腺病毒包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的環子孢子(CS)抗原的異源核酸；和佐劑化的蛋白質抗原；其中所述重組腺病毒選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。優選地，所述重組腺病毒是人類腺病毒血清型35。同樣優選的是本發明的一種試劑盒，其中所述蛋白質抗原包含來自引起瘧疾的寄生蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。所述蛋白質抗原優選地包含形式為與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白(hybrid protein)。在另一個優選的實施方式中，蛋白質抗原包含RTS，S。同樣優選的是所述蛋白質抗原以QS21和3D-MPL進行佐劑化，優選地與含有膽固醇的脂質體進行配製。
儘管本領域已知有不同的寄生蟲在人類引起瘧疾，本發明的一個實施方式是本發明的試劑盒，其中所述引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲。
為獲得適當的免疫應答，優選地所述異源核酸經過密碼子優化以提高所編碼的蛋白質在哺乳動物中、優選地在人類中的產生。重組腺病毒可與佐劑存在於混合物中。
本領域普通技術人員熟知猴腺病毒可用於人類基因治療和疫苗。除此之外，還發現其他一些非人類腺病毒例如犬腺病毒和牛腺病毒也能夠在體外感染人細胞，且由於它們在人的樣品中的血清學流行程度(seroprevalence)較低，因此也適合用於人類。因此，本發明還涉及一種試劑盒，其包含存在於藥用可接受的賦形劑中的複製缺陷型重組猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒，所述腺病毒包含編碼密碼子優化的來自惡性瘧原蟲的環子孢子(CS)抗原的異源核酸；和包含RTS，S的佐劑化的蛋白質抗原，其中優選地所述蛋白質抗原以QS21和3D-MPL進行佐劑化，優選地與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中。
根據本發明，如果將本發明的試劑盒的不同成分以特定的順序進行施用，則本發明的特定的初始-加強免疫療法在免疫應答方面可產生預料不到的顯著效果。因此，本發明還涉及本發明的一種試劑盒，其中所述複製缺陷型重組腺病毒是初始免疫組合物，而所述佐劑化的蛋白質抗原是加強免疫組合物。單次施用疫苗(初始免疫)所引發的免疫應答通常不足以有效地和/或持久地提供有效的保護，而重複施用(加強免疫)則能夠顯著增強針對疫苗抗原的體液和細胞應答(例如見Estcourt et al.2002)。
本發明還涉及包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的CS抗原的異源核酸的複製缺陷型重組腺病毒以及佐劑化的蛋白質抗原在製備用於治療或預防瘧疾的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒或者人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49或50，其中優選地將複製缺陷型重組腺病毒用作初始免疫組合物，而將佐劑化的蛋白質抗原用作加強免疫組合物。本發明的實施方式涉及本發明的用途，其中所述蛋白質抗原包含來自引起瘧疾的寄生蟲的CS蛋白或其免疫原性片段，優選地來惡性瘧原蟲。所述蛋白質抗原優選地包含形式為與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。RTS，S優選地是佐劑化的蛋白質抗原，而優選的佐劑是QS21和3D-MPL，優選地與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中。
為了在哺乳動物中、優選地在人類中實現最佳表達並隨後產生最佳的免疫應答，本發明所用的異源核酸經過密碼子優化以提高所編碼的蛋白質在哺乳動物中、優選地在人類中的產生。
在另一個實施方式中，對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種的方法以下步驟以存在於藥用可接受的賦形劑中的複製缺陷型重組腺病毒對所述哺乳動物進行初始免疫，所述腺病毒包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的CS抗原的異源核酸；並以佐劑化的蛋白質抗原對所述哺乳動物進行加強免疫，所述佐劑化的蛋白質抗原包含形式為與HBsAg形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。蛋白質抗原優選地包含RTS，S，其中優選的佐劑是QS21和3D-MPL，其優選地與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中，其中優選的引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲。
用於產生重組腺病毒以及本發明的方法中所用的優選的腺病毒可以是人類腺病毒或者非人類腺病毒，例如猴腺病毒、犬腺病毒和牛腺病毒，對於將要施用重組病毒的(人類)宿主，高度優選的腺病毒是不會在所述宿主中遭遇已經存在的免疫力的腺病毒。猴腺病毒和某些人腺病毒的血清型非常適合在此所述的這一目的。用於本發明的這些方法、用途以及試劑盒中的優選的人類腺病毒是人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。
本發明還涉及對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種的方法，其中使用本發明的試劑盒。如果使用本發明的試劑盒、採用本發明的優選的初始-加強免疫療法對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種，那麼優選地在加強免疫之後進行一或多次後續加強免疫。
本發明涉及重組腺病毒作為至少一種瘧疾抗原的載體並與一種佐劑蛋白異源組合使用在初始/加強免疫療法中的用途。就初期的T細胞應答(initial T cell response)和免疫應答的持續時間而言，將病毒載體與佐劑化的蛋白組合使用用於異源初始/加強免疫療法，可給靈長類提供優越的免疫應答，這一發現是令人驚異的。具體而言，已經發現，以攜帶編碼抗原的核酸的病毒載體對哺乳動物進行初始免疫，繼以單次或者多次注射佐劑化的蛋白質抗原的後續加強免疫，可在定量和/或定性免疫應答方面得到優越的結果。優選的病毒載體是腺病毒載體，更加優選的是人類腺病毒載體，且進一步更加優選的是那些施用於哺乳動物宿主後在宿主體內僅遭遇低水平中和活性(neutralizing activity)的人類腺病毒載體。特別優選的血清型是腺病毒11、24、26、34、35、48、49和50。
根據一個優選的實施方式，所述蛋白質抗原和由所述病毒載體編碼的抗原是瘧疾抗原，更加優選地是惡性瘧原蟲環孢子(CS)蛋白、或其免疫原性衍生物和/或片段。作為本發明的一個實例，由病毒載體編碼的多肽包含編碼惡性瘧原蟲CS蛋白的核酸，所述CS蛋白包括N端部分、中央部分重複區、以及C端部分(缺失了最C端的14個胺基酸GPI錨序列)，而所述蛋白質抗原包含構建體RTS，S，其缺乏N端區域。
用於本發明的任一或者所有方面的佐劑化的蛋白質抗原可包含來自惡性瘧原蟲的CS蛋白或其免疫原性片段，其形式可以是融合蛋白。例如，抗原可包含與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)融合的CS蛋白或免疫原性片段的雜合蛋白，該雜合蛋白可在原核或者真核宿主細胞中表達，並具有脂蛋白顆粒的形式。所述融合蛋白可包含例如CS蛋白的基本上整個C端部分、4個或者更多個串聯重複的免疫顯性區域(immunodominant region)、和B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。例如，雜合蛋白包含一序列，該序列含有至少160個胺基酸並與CS蛋白的C端部分基本同源，且可以缺乏CS蛋白的C端的末尾多個胺基酸，例如末尾的10個至12個胺基酸。該雜合蛋白的形式可以是混合的脂蛋白顆粒，例如與HbsAg形成的混合的脂蛋白顆粒。
具體而言，WO 93/10152公開了一種雜合蛋白，其在WO 93/10152中被稱為「RTS*」，但在本文中被稱為「RTS」，其形式可以是與HbsAg形成的混合的脂蛋白顆粒，在本文中稱為RTS，S。在這些混合顆粒中，雜合蛋白∶S抗原的比率例如是1∶4。
在此稱為「RTS」的雜合蛋白是使用來自惡性瘧原蟲NF54(克隆3D7；Caspers et al.1989)的CS蛋白基因序列產生的，並基本上包含來自惡性瘧原蟲NF54的CS蛋白的整個207至395區域。包括於RTS中的NF54(3D7)CS蛋白序列的部分是如下所示的189個胺基酸的序列
DPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANPNANPNANPNA NPNANPNANP NANPNKNNQG NGQGHNMPND PNRNVDENANANSAVKNNNN EEPSDKHIKE YLNKIQNSLS TEWSPCSVTC GNGIQVRIKPGSANKPKDEL DYANDIEKKI CKMEKCSSVF NVVNSSIGL (SEQ ID NO1)。
具體的RTS是●由來自釀酒酵母(Sacchromyces cerevisae)TDH3基因序列的第1059-1061位核苷酸編碼的甲硫氨酸殘基(該讀碼框的1-1058位核苷酸構成TDH3啟動子本身)(Musti et al.1983)●3個胺基酸Met Ala Pro，來自通過用於構建雜合基因(hybrid gene)的克隆過程而產生的核苷酸序列(1062-1070)。
●由1071-1637位編碼的一段189個胺基酸(見上，SEQ ID NO1)，其代表惡性瘧原蟲株NF54(克隆3D7；Caspers et al.1989)的CS蛋白的207至395位胺基酸。
●由1638至1640位核苷酸編碼的胺基酸(Gly)，通過用於構建雜合基因的克隆過程而產生。
●4個胺基酸，Pro Val Thr Asn，由1641至1652位核苷酸編碼，並代表B型肝炎病毒(adw血清型)preS2蛋白(Valenzuela et al.1979)的4個羧基端胺基酸。
●一段226個胺基酸，由1653至2330位核苷酸編碼，且具體為B型肝炎病毒(adw血清型)的S蛋白(Valenzuela et al.1979)。
RTS可以是混合顆粒的形式，即RTS，S，其中RTS∶S比率例如是1∶4。
儘管本發明決不限於瘧疾抗原，但在詳細講解本發明時使用的是編碼瘧疾抗原的病毒載體並結合佐劑化的蛋白質性瘧疾抗原。本領域普通技術人員能夠使用來自其他致病因素的不同的抗原性插入物和相應的蛋白質抗原對本發明的教導進行改動，所述致病因素包括寄生蟲、細菌、病毒、酵母、或者是自身抗原，後者包括但不限於腫瘤抗原(如PSA、gp100、CEA、MUC1、Her2/neu)等等。
本發明涉及複製缺陷型重組腺病毒載體，其包含編碼惡性瘧原蟲抗原的異源核酸。在優選的實施方式中，所述病毒載體是來自選自如下一組的血清型的腺病毒Ad11，Ad24，Ad26，Ad34，Ad35，Ad48，Ad49和Ad50。如此選擇人類腺病毒的原因在於將一般的腺病毒用作疫苗載體通常存在障礙，因為人類普遍感染過野生型腺病毒，後者可引起輕度的或者不明顯的疾病，例如普通感冒。當隨後使用重組腺病毒血清型作為重組疫苗載體時，例如使用採用腺病毒的抗瘧疾疫苗時，由親代野生型血清型感染引起的免疫應答可負面影響重組腺病毒血清型的效力。不同腺病毒血清型在全世界人群中的傳播隨地理區域的不同而不同。通常，優選的血清型應該在世界上的絕大多數地區的宿主中遭遇較低的中和活性，現有技術對此已經有若干概括性的報導。
本發明人現將重組腺病毒與純化蛋白的一種新的組合形式用於順序免疫接種方案，在此稱為異源初始/加強免疫，該方案利用的是由初始/加強免疫疫苗的不同組分所誘導的不同的免疫應答。重組載體的選擇會受到重組載體在一小部分需要接種疫苗的人群中遭遇中和活性的影響。出乎意料的是，腺病毒載體化的抗原和佐劑化的蛋白質抗原較單獨使用兩者中的任何一種疫苗可產生明顯增強的免疫應答。如本申請所公開的，通過對體內施用了疫苗的恆河猴的免疫應答進行體外測定可說明這種免疫力的增強。
在另一個實施方式中，重組複製缺陷型腺病毒是猴腺病毒，例如是自黑猩猩中分離的病毒。一些實例包括C68(也稱為Pan 9；US6,083,716)和Pan 5、6和7(WO 03/046124)。
在本發明的另一個具體方面，複製缺陷型重組病毒載體包含編碼CS蛋白或其免疫原性部分或者片段的核酸序列。優選地，所述異源核酸序列經過密碼子優化以增強在哺乳動物、優選地在人類中的表達。密碼子優化基於感興趣的哺乳動物的所需胺基酸含量、及其通常最佳的密碼子使用情況，並需要避免一些方面以確保適當的表達。這些方面可以是剪接供體或者受體位點、終止密碼子、Chi位點、poly(A)段、富含GC和AT序列、內部TATA盒、等等。哺乳動物宿主的密碼子優化方法是本領域人員熟知的，且可參見一些分子生物學文獻。
在優選的實施方式中，本發明涉及複製缺陷型重組腺病毒載體，其中所述異源核酸中腺嘌呤加胸腺嘧啶的含量與胞嘧啶加鳥嘌呤的含量相比低於87％，優選地低於80％，更加優選地低於59％，且最優選地等於大約45％。在一個實施方式中，本發明提供複製缺陷型重組腺病毒載體，其中CS蛋白是WO 2004/055 187中公開的任一CS蛋白，最優選地是來自惡性瘧原蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。
如何產生攜帶異源基因的重組腺病毒載體是本領域人員已知的，且通常包括使用包裝細胞系、適配構建體(adapter constructs)和粘粒，並自腺病毒基因組中缺失E1區域的至少一個功能性部分(包裝系統和優選的細胞系可參見下文)。
本發明還涉及試劑盒，作為其成分，試劑盒一方面包含在宿主中遭遇較低中和活性的重組腺病毒載體，另一方面包含純化的蛋白質，其中優選地所述純化的蛋白質的形式為與佐劑形成的混合物。優選的佐劑是QS21和3D-MPL，優選地與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中。在異源初始/加強免疫疫苗輸送策略的成分中，優選地將重組腺病毒載體作為初始免疫劑而首先施用，然後將純化蛋白作為加強免疫劑而施用，該加強免疫可重複一次以上。所述成分通常存在於藥用可接受的載體中。藥用可接受的載體是本領域熟知的且廣泛用於各種治療產品中。優選地，所述載體適合用於疫苗。更優選地，所述疫苗還包含佐劑。本領域熟知佐劑可進一步增強對所施用的抗原的免疫應答。本發明還涉及本發明的試劑盒在瘧疾的治療、預防或者診斷中的用途。
本發明涉及治療哺乳動物的瘧疾感染或者預防哺乳動物的瘧疾感染的方法，所述方法包含(按照任一順序或者同時)以下步驟施用攜帶惡性瘧原蟲抗原的重組腺病毒；並施用至少一種純化的惡性瘧原蟲蛋白，所述蛋白與佐劑混合。優選地，所述重組腺病毒選自Ad11，Ad24，Ad26，Ad34，Ad35，Ad48，Ad49和Ad50，而重組腺病毒攜帶編碼CS蛋白或其免疫原性片段的基因也是優選的。用於與重組腺病毒進行組合的優選的純化蛋白是RTS，S，而優選的佐劑是QS21和3D-MPL，其優選地與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中。
產生免疫應答背後的驅動力是細胞因子，後者是多種已知的蛋白質信使，其作用在於輔助免疫系統的細胞並將最終的免疫應答導向Th1或者Th2應答。因此，高水平的Th1型細胞因子傾向於誘導針對給定抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的Th2型細胞因子傾向於誘導針對抗原的體液免疫應答。重要的是，Th1和Th2型免疫應答的區別並非是絕對的。在實際情況中，個體將支持將免疫應答描述為是Th1佔主導的或者Th2佔主導的。不過，通常可方便地根據Mosmann和Coffman(1989)所述的鼠科CD4+T細胞克隆的細胞因子家族對其加以考慮。通常，Th1型應答與T-淋巴細胞產生INF-γ和IL-2細胞因子相關聯。其他通常與誘導Th1型免疫應答直接相關聯的細胞因子(例如IL-12)不是由T細胞產生的。相反，Th2型應答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-(TNF-β)的分泌相關聯。
用於本發明的合適的佐劑包括鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(alum)或者磷酸鋁，但也可以使鈣鹽、鐵鹽或者鋅鹽，或者可以是醯化的酪氨酸的不溶性懸液、或者醯化的糖、陽離子或陰離子衍生的多糖、含磷氮鏈聚合物(polyphosphazenes)、或Montanide脂質體。
在用於本發明的疫苗配製品中，就腺病毒載體方面而言，可施用或者不施用佐劑。就這一組合中的蛋白質成分而言，可選擇優先誘導Th1應答的佐劑組合物。此外，也可以誘導其他應答，包括其他體液應答。
某些疫苗佐劑特別適合於刺激Th1或Th2型細胞因子應答。通常，在接種疫苗或者感染之後，免疫應答的Th1∶Th2平衡的最佳指標包括在以抗原再次刺激後在體外直接測定T淋巴細胞產生的Th1 or Th2細胞因子，和/或測定抗原特異性抗體應答的IgG1∶IgG2a比率。因此，Th1型佐劑是這樣一種佐劑，當以抗原在體外再次刺激分離的T細胞群時，其刺激分離的T細胞群產生高水平的Th1型細胞因子，並誘導與Th1型同種型相關聯的抗原特異性免疫球蛋白應答。例如，那些可以配製為用於產生適合用於本發明的佐劑的Th1型免疫刺激劑可包括單磷醯基脂質A，特別是3-de-O-醯化的單磷醯基脂質A(3D-MPL)。3D-MPL是熟知的佐劑，生產商是Ribi Immunochem，Montana。在化學上，其通常是作為3-de-O-醯化的單磷醯基脂質A與4、5、或者6醯化的鏈的混合物而提供的。可採用GB 2122204B所公開的方法對其進行純化和製備，該文獻還公開了製備二磷醯基脂質A及其3-O-去醯化的變體。其他純化的或者合成的脂多糖已經被公開(US Pat.6,005,099，EP 0729473 B1，EP 0549074B1)。在一個實施方式中，3D-MPL的形式是微粒配製品，具有直徑小於0.2μm的小顆粒大小，其製備方法在EP 0689454中已經公開。
皂角苷是Th1免疫刺激劑的另一種實例，可用於本發明。皂角苷熟知的佐劑。例如，Quil A(來自南美洲的樹木Quillaja Saponaria Molina的樹皮)及其成分公開於US Pat.5,057,540和EP 0362279 B1。溶血性皂角苷QS21和QS17(Quil A的HPLC純化成分)已經被公開為強效的全身性佐劑，其生產方法公開於US Pat.5,057,540和EP 0362279 B1。這些文獻還公開了QS7(Quil-A的非溶血性成分)的用途，其作為強效的佐劑用於全身性疫苗。QS21與聚山梨醇酯或環糊精的組合也是已知的(WO99/10008)。包含QuilA的成分如QS21和QS7的微粒性佐劑系統公開於WO 96/33739和WO 96/11711。
免疫刺激劑的另一個實例是免疫刺激性寡核苷酸，其含有未甲基化的CpG二核苷酸(″CpG″)。CpG是DNA中的胞嘧啶-鳥嘌呤核苷二核苷酸基序的縮寫。已知CpG當通過全身途徑和黏膜途徑施用時均可作為佐劑(WO 96/02555，EP 0468520)。歷史上，曾發現卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)的DNA成分能夠產生抗腫瘤作用。在進一步的研究中，來自BCG基因序列的合成的寡核苷酸被發現能夠誘導免疫刺激作用(體外和體內均有)。這些研究的作者認為某些回文順序，包括中心CG基序，具有這種活性。詳細的分析已經發現，CG基序肯定存在於特定的序列關係中，且此類序列常見於細菌DNA，當罕見於脊椎動物DNA。免疫刺激序列通常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序是沒有甲基化的，但其他未甲基化的CpG序列已知具有免疫刺激性並可用於本發明。
在這6個核苷酸的特定組合中可以出現回文順序。這些基序中的一些，其或是一個基序的重複或是不同基序的組合，可出現於同一個寡核苷酸中。存在一或多種這些含有免疫刺激序列的寡核苷酸可激活各種免疫亞型，包括天然殺傷細胞(其產生幹擾素-γ並具有細胞毒活性)和巨噬細胞。其他含有未甲基化的CpG卻不具有這一共有序列的序列也已經被發現具有免疫調節作用。當配製到疫苗中時，CpG通常以游離溶液的形式與游離抗原一同施用(WO 96/02555，68)或者與抗原共價結合施用(WO 98/16247)，或者以載體例如氫氧化鋁配製(肝炎表面抗原)。
上述的此類免疫刺激劑可與載體一同配製，所述載體例如為脂質體、水包油乳液和/或金屬鹽類，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可與氫氧化鋁(EP 0689454)或水包油乳液(WO 95/17210)一起配製；QS21可方便地與含有膽固醇的脂質體(WO 96/33739)、水包油乳液(WO 95/17210)或者alum(WO 98/15287)一起配製；CpG可與alum或者其他陽離子載體一起配製。
還可以使用免疫刺激劑的組合，例如單磷醯基脂質A和皂角苷衍生物的組合(WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 98/05355；WO 99/12565；WO 99/11241)或QS21和3D-MPL的組合物，見WO 94/00153。或者，本發明也可以使用CpG加皂角苷(例如QS21)的組合。因此，合適的佐劑系統包括，例如，單磷醯基脂質A如3D-MPL與鋁鹽的組合。另一個實施方式是單磷醯基脂質A與皂角苷衍生物的組合，例如QS21和3D-MPL的組合，參見WO 94/00153，或者一種反應原性更低的組合物，其中QS21被淬滅於(quenched in)含有膽固醇的脂質體(DQ)，參見WO 96/33739。而另一種佐劑配製品包括QS21、3D-MPL和生育酚，存在於水包油乳液中，參見WO 95/17210。在另一個實施方式中，單獨使用CpG寡核苷酸或將其與鋁鹽一起使用。
用於本發明的合適的佐劑是傾向於刺激Th1的佐劑，例如包含皂角苷如QS21或單磷醯基脂質A衍生物如3D-MPL的佐劑，或同時包含上述兩者以及任選地與含有膽固醇的脂質體的佐劑。例如WO 96/33739公開了與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中的QS21和3D-MPL的組合。
本發明的優點是多方面的。重組病毒，例如重組腺病毒，可通過使用被認為是安全的細胞以很高的滴度進行製備，所述細胞能夠在懸液中生長達到很高的量，所使用的培養基不含有任何來自動物或者人的組分。此外，已知重組腺病毒可引發針對由腺病毒基因組中的異源核酸序列所編碼的蛋白質的顯著的免疫應答。本發明將這些特徵組合於一種攜帶惡性瘧原蟲的環子孢子基因的載體中並利用佐劑化的蛋白質來加強應答。此外，所述基因已經經過密碼子優化以使得表達水平適合於在人體產生合適的免疫應答。本發明提供抗瘧疾感染的疫苗，其利用的是不會遭遇高滴度的中和抗體的腺病毒。用於這一目的的高度優選的腺病毒是血清型11和35(Ad11和Ad35，見WO 00/70071和WO 02/40665)。
在引起瘧疾的病原體如惡性瘧原蟲與感興趣的宿主例如人類之間，其核酸含量是非常不同的。本發明提供密碼子優化的核酸，其能夠在哺乳動物例如人體內達到更高的表達水平。
利用不同的實體進行在此所述的初始/加強免疫療法提供了一種免疫方法，其能夠同時提供免疫系統的細胞免疫和體液免疫這兩方面的合適的免疫應答。其涉及CD8+T細胞、CD4+T細胞和抗體。這些疫苗這的任一種單獨應用均不能產生持久的、能夠激發最佳水平的抗原特異性CD8+T細胞、CD4+T細胞和抗體的免疫應答。此外，不同組分的施用順序可改變這些免疫應答，並可能造成抗將來感染的保護作用持續不同時間。本發明的方法和試劑盒能夠實現引發對付寄生蟲在人體中的生命周期的所有不同階段的免疫應答，從循環的子孢子和裂殖子到感染的肝細胞和RBC。此外，其能夠在一長段時期內提供抗瘧疾感染的持久的保護作用。
在一個優選的實施方式中，本發明涉及重組腺病毒的用途，通過使得腺病毒基因組的E1區的至少部分被缺失已經使得所述重組腺病毒成為複製缺陷型，該E1區對於新產生的腺病毒進行複製、轉錄、翻譯和包裝等過程來說是必需的。缺失E1的載體通常是在能夠對所缺失的E1功能進行互補的細胞系上產生的。關於此類細胞系及其在產生重組病毒中的用途已經有詳細的描述並且在現有技術中是熟知的。優選地，可使用由以保藏號ECACC no.96022940保藏於Centre for AppliedMicrob iology and Research(CAMR，UK)的European Collection of AnimalCell Cultures(ECACC)的細胞所代表的PER.C6細胞或其衍生細胞來防止產生能夠複製的腺病毒(rca)。在另一個優選的實施方式中，使用的細胞支持除來自腺病毒血清型5(Ad5)的重組腺病毒以外的重組腺病毒的生長。在此引用以下文件WO 97/00326、WO 01/05945、WO01/07571、WO 00/70071、WO 02/40665和WO 99/55132，其中公開了如何獲得Ad5的以及其他腺病毒血清型的無rca腺病毒原液的方法和手段，所述其他腺病毒血清型例如為重組複製缺陷型Ad35，後者能夠在通過來自Ad35的E1而達到永生的HER細胞上產生，或者在PER.C6細胞上產生，PER.C6細胞進一步包含來自Ad35的E1基因以便對B型腺病毒提供合適的互補。
需要注意的是，在下述公開的文獻中WO 00/03029、WO02/24730、WO 00/70071和WO 02/40665，Ad50被錯誤地稱為Ad51。在以上提及的文獻中，其中提到的Ad51血清型與De Jong et al.(1999)的一篇出版物中的血清型Ad50是相同的，在De Jong et al.(1999)的出版物中其被稱為B群腺病毒。為清楚起見，在此所用的Ad50是De Jonget al.(1999)所提到的B群Ad50血清型。
本發明的疫苗通常用於初始/加強免疫方案，例如Ad/蛋白質；蛋白質/Ad；蛋白質/Ad/Ad；Ad/蛋白質/Ad；Ad/Ad/蛋白質；Ad/蛋白質/蛋白質/蛋白質；Ad/蛋白質/病毒載體/蛋白質，等等。能夠預見的是，與另一種類型的疫苗(例如裸DNA或不同於腺病毒的重組病毒載體)的組合也可與本發明的初始/加強免疫藥劑組合使用。還可使用額外的瘧疾抗原或者(多)肽。
在此，如果一種核酸可通過對得自野生型病毒的野生型序列進行直接克隆而得到，則使用序列「來自」的表述，雖然它們也可例如利用不同段的DNA作為模板通過PCR而得到。這也意味著此類序列可以是野生型的形式以及改變的形式。達到同樣結果的另一種方法通過組合合成的DNA。應該理解的是，「來自」並不排他性地意味著對野生型DNA進行直接克隆。本領域普通技術人員還能意識到可利用分子生物學方法獲得特定的一段核酸的突變體形式。術語「其功能性部分、衍生物和/或類似物」應理解為等同於它們與之有關的核酸序列。本領域普通技術人員可以理解這一事實，即某些缺失、交換、(點)突變、添加等等，仍可得到具有與原始核酸序列相似的功能的核酸序列，且一旦翻譯後能夠產生相似的或者甚至是相同的多肽。因此應該理解的是，此類並不顯著改變核酸序列的功能性的變化落入本發明的範圍之內。如果特定的腺病毒載體來自所選擇的特定的腺病毒血清型，也應該理解最終的產品可通過間接途徑獲得，例如採用本領域已知的方法直接克隆和合成特定的基因組DNA段。不改變本發明的具體方面而對基因組的內容作出的特定缺失、突變或者其他變化仍被認為是本發明的一部分。此類變化的實例是例如病毒骨架內的缺失，以便能夠克隆更大的異源核酸段。此類突變的實例是例如E3缺失或者腺病毒的E2和/或E4蛋白的編碼區域的缺失和/或變化。對腺病毒骨架進行的此類變化是本領域已知的且經常採用的，因為空間對於待包裝的腺病毒來說是一個限制因素；這是要缺失腺病毒基因組的某些部分的主要原因。改變基因組的E2、E3和/或E4區域的其他原因可能涉及腺病毒載體的穩定性或者整體性，例如參見WO03/104467和WO 2004/001032)。這些申請涉及將來自一個亞群的血清型的E4orf6基因用於來自另一亞群的腺病毒的骨架內，以確保在包裝細胞系內進行複製和包裝的過程中，E4orf6活性與E1B-55K活性相適合。它們還涉及使用合適的功能性pIX啟動子來獲得更高的pIX表達水平和更穩定的重組腺病毒載體。
「複製缺陷型」在此意味著病毒載體在非互補細胞內不能複製。在互補細胞內，複製所需的功能且由此產生病毒載體所需的功能是由互補細胞提供的。本發明的複製缺陷型病毒載體沒有攜帶在除互補細胞之外的任何宿主細胞中進行複製所需的全部元件。
「異源」在此當與核酸有關時意味著核酸序列來自與該異源核酸所克隆入其中的野生型病毒載體不同的來源。例如就腺病毒而言，克隆入複製缺陷型腺病毒載體的異源核酸不是腺病毒的核酸序列，而是來自感興趣的某些其他致病因素。
「異源」在此當與初始-加強免疫疫苗策略有關時意味著施用兩種或者多種不同的組分，作為實例的是將一種重組非複製型腺病毒載體與一種佐劑化的蛋白質有意圖地組合使用，而不是如現有技術中所通常採用的那樣，將一種組分施用若干次。
「抗原」在此是指任何來自一原料的抗原，所述原料在被輸送(施用)了決定簇的宿主內引發免疫應答。抗原可以來自外來原料，如病原體、寄生蟲、或者甚至是自身抗原。可採用本發明的複製缺陷型重組病毒來輸送的瘧原蟲抗原的實例是環子孢子蛋白(CS)、SE36多肽、裂殖子表面蛋白-1 19kDa C端多肽(MSP-1p19)、MSP-1、MSP-1p42、ApicalMerozoite Antigen-1(AMA-1)、Liver Stage Antigen 1(LSA-1)或LiverStage Antigen-3(LSA-3)，或者上述任一的片段。在一個優選的方面，本發明涉及來自惡性瘧原蟲的環子孢子(CS)蛋白。
「密碼子優化」在此意味著序列的核酸內容已經被改變，以便在將編碼所述蛋白的基因輸送於其中的感興趣的宿主中使得感興趣的蛋白具有足夠高的表達水平。足夠高的表達水平在此是指蛋白質的水平應該高到足以在宿主中引發免疫應答以便保護宿主抵抗感染或者抵抗疾病。本領域人員已知某些疫苗在人體內產生免疫應答，由此大約60％的被接種個體可抵抗隨後由使用病原體(如子孢子)進行攻擊而誘導的疾病。因此，如果60％或者更多的被處理的個體能夠抵抗隨後的感染而得到保護，那麼可認為表達水平是足夠的。可以相信，通過將可施用的腺病毒方面與在此所公開的抗原選擇相組合，可以達到這些百分數。優選地，85％的個體得到保護，不過最優選的是超過90％的被接種宿主可抵抗隨後的攻擊而得到保護。本發明公開的核酸經密碼子優化用於在人類表達。根據Narum et al.(2001)，與胞嘧啶加鳥嘌呤(C+G)的百分數相比，人類DNA中腺嘌呤加胸腺嘧啶(A+T)的含量約為59％。惡性瘧原蟲的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量總體約為80％。惡性瘧原蟲的CS基因的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量約為87％。為得到足夠的保護作用，認為有必要提高宿主內的產生水平。實現這一目的的一個途徑是調整密碼子的使用以保持最終的胺基酸序列相同，不過使用的是哺乳動物進行表達時更通常使用的密碼子序列。為此，本發明的複製缺陷型重組病毒載體在本發明的異源核酸中具有的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量低於87％，優選地低於80％，且更加優選地低於或等於大約59％。基於人類的密碼子使用規則和惡性瘧原蟲和約氏瘧原蟲的CS基因的胺基酸含量，密碼子優化的基因的百分比甚至更低，大約達到本發明公開的胺基酸含量的45％。因此，就CS基因而言，它們優選地具有約45％的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量。應該理解的是，如果待治療的是不同於人的另一物種，該物種可具有不同的腺嘌呤加胸腺嘧啶濃度(低於或者高於59％)和/或不同的密碼子使用規則，可以調整本發明的編碼CS蛋白的基因以便適合所需的含量並產生適合於所述具體宿主的表達水平。當然，也不能排除的是，在世界上不同的地理區域內，含量的微小改變可造成表達水平的微小改變。也應該理解，蛋白質的胺基酸序列內重複序列數量出現微小改變，百分比會相應地不同。可對其他感興趣的抗原進行類似的修飾。所有這些調整的含量均為本發明的一部分。
稱為RTS，S的蛋白質是融合蛋白，由惡性瘧原蟲CS蛋白C端一半組成(中心41個NANP重複序列中的17個加C端部分的絕大部分)，表達為與B型肝炎病毒表面抗原形成的融合蛋白。
不能複製的腺病毒載體的顯著優點之一在於親代病毒具有較小的致病性，並有報導認為這些載體在任何個體、包括在具有免疫抑制的個體內不會引起明顯的疾病。在小鼠瘧疾(約氏瘧原蟲)模型中的研究提示，表達CS蛋白的重組腺病毒構建體不僅引起突出的細胞免疫應答，它們還提供出色的抗感染保護作用。因此，為了提高T細胞應答的強度和延長針對CS的總體免疫應答，本發明人決定將腺病毒方法與重組蛋白質方法進行組合，成為一種新的異源初始-加強免疫策略。
不過，小鼠並不是預測人類應答的理想模型，對於腺病毒35(Ad35)尤為如此。標準的複製缺陷型載體是腺病毒5(Ad5)，但其已經在載體能力優化方面表現出一些問題，原因在於該病毒具有廣泛的地區性流行，且在全球範圍內的人群中有相當大的比例對親代病毒已經具有了預先存在的免疫力。Ad35在作為疫苗方面顯示出具有更大的應用前景。攜帶Ad5和Ad35CSP的構建體均已能夠得到，這樣便能夠對利用具體誘導CS免疫力的不同構建體的兩種順序異源腺病毒免疫接種進行評價。
樹突狀細胞(DC)是體內最強的抗原呈遞細胞，而Ad5和Ad35兩者均既靶向人類DC又靶向恆河猴DC這一事實是使得它們成為出色的疫苗載體的多種生物學因素之一。不過，僅Ad5有效感染鼠科DC；Ad35僅可靠地感染靈長類動物的DC。因此，儘管有關Ad35構建體的基本效力的問題能夠在小動物模型中找到答案，但有關Ad35的真實的免疫原性只能在非人類靈長動物中進行研究。
本發明人決定檢測RTS，S與含有CS基因的腺病毒載體組成的初始-加強免疫組合，以確定其抗瘧疾細胞和/或體液應答是否較單獨應用RTS，S而言是一種提高。此外，對兩劑腺病毒疫苗單獨使用的療法進行了優化。
實施例使用重組腺病毒載體和純化的佐劑化蛋白質對恆河猴進行異源初始/加強免疫接種實驗的目的是評價RTS，S隨後Ad35，以及Ad35隨後RTS，S，與標準的3劑RTS，S免疫接種療法和標準的2劑Ad35療法進行直接對比。次要目的是優化所述的2劑腺病毒療法。研究了將這些構建體進行組合的幾種不同療法的過程中以及隨後的血清學和細胞免疫應答。
恆河猴(Macaca mulatta)是研究人類免疫應答的出色的模型，原因在於其與人類在系統發生上關係密切。特別仔細觀察了MHC II類等位基因；共有等位基因的產生估計在兩千五百萬年前，早於人和恆河猴達到物種形成。因此，在將抗原呈遞給Th細胞時使用的是相似的表位，這極大地增強了該模型的預測價值。更重要的是以往已經證實恆河猴模型在針對瘧疾抗原和HIV的人類免疫原性應答方面均具有很高的預測性，HIV是另一種因免疫應答的複雜性而妨礙疫苗開發的人類疾病。
已經使用小鼠瘧疾約氏瘧原蟲的腺病毒CS構建體在小鼠中進行了初步的實驗，證實其具有出色的免疫原性和保護效力。不過，在尋求開發抗惡性瘧疾疫苗的過程中長期以來一直無法成功地自小鼠瘧疾模型的結果直接推斷出在人類的情況，這一點要求在非人類靈長動物模型中進行過渡實驗。恆河猴代表了最佳的候選物種，原因在於這些疫苗在這一物種中有廣泛深入的已有資料庫，在於其與人類在系統發生上的近親關係，在於其大小允許取得足量的血液樣品以保證對免疫應答進行充分的分析，還在於已有的試劑和方法都已經非常適合這一物種且因此不需要輔助的方案以及多年的摸索。此外，腺病毒35構建體只有在非人類靈長動物中才能進行合適的測試，因為這種病毒不能有效侵入其他哺乳動物的樹突狀細胞。
有關構建和產生用於本實驗研究的攜帶惡性瘧原蟲CS編碼基因(Ad5CS和Ad35CS)的重組複製缺陷型腺病毒，在WO 2004/055187(克隆02-659；見其圖2)的實施例中已經進行了詳細的闡述。簡言之，腺病毒載體包含編碼CS蛋白的異源基因，所述CS蛋白的胺基酸序列類似於NF54株3D7克隆的CS蛋白，並具有N端信號序列、27個NANP重複、一簇3個NVDP重複和一個單獨的NVDP重複、通用表位(Lockyeret al.1989；Zevering et al.1994；Nardin et al.2001)、以及缺失了最後14個胺基酸(位於C末端)，等等。RTS，S蛋白質的不同之處在於RTS，S缺乏N端信號序列和大部分的重複區以及位於C端的GPI錨信號序列的絕大部分，後者也不存在於腺病毒構建體中。
本實驗對為了優化RTS，S與攜帶Ad5和Ad35CS的構建體(Ad5CS和Ad35CS)的初始-加強免疫策略、以及為了優化Ad5CS和Ad35CS單獨的使用策略而進行的各種組合和時程策略進行了隨機化、盲化的安全性和免疫原性研究。作為與新策略進行對比的對象，以往的最佳療法是肌肉注射3劑50μg的RTS，S和佐劑，分別在第0、1和3個月注射。這是組1，即陽性對照組。表1A概括了所有的組。在所有的情況中，佐劑均是50μg的3D-MPL、50μg的QS21，與含有膽固醇的脂質體存在於一配製品中，參見WO 96/33739。
組2在第0和1個月接受2劑RTS，S/佐劑，隨後在第3個月接受1劑Ad35CS。組3在第0個月接受1劑Ad35CS，隨後在第1和3個月接受2劑RTS，S/佐劑。
組4、5和6僅接受腺病毒構建體。以往在不同疾病中使用2劑腺病毒5構建體的經驗提示，當免疫接種之間的間隔是至少6個月時，可得到最佳的血清學和細胞免疫應答。由於必須在人體或者非人類靈長動物中評價Ad35構建體，對該載體而言，兩劑之間的最佳時間還未確定。因此，組4在第0和3個月接受2劑Ad35CS(用於蛋白質組的直接對照)，而組5在第0和6個月接受2劑。為了評價是否2劑相同的腺病毒構建體的效果不如對CS蛋白進行改變的構建體，將組5與組6進行比較，組6在第0和6個月接受Ad5CS，隨後是Ad35CS。
最後，對照組7在第0和3個月接受2劑空白(無瘧疾基因插入物)Ad35，作為評價免疫原性的免疫接種對照組。
將注射部位剃毛並清楚地標記以便於觀察疫苗的反應原性。此外，在注射後24、48、72小時和第7和14天，給動物施用鎮靜劑並直接檢查注射部位是否有硬化、腫脹、發熱、發紅或者其他異常等表現。儘管預期不會出現全身性毒性表現，但仍然在上述時間點給動物施用鎮靜劑並檢查淋巴結病變、蜂窩組織炎、化膿、關節炎、食慾減退以及體重下降，並監測其血液學和臨床生化指標的變化。
在每次注射後24、48、72小時和第7和14天取血進行全血計數(CBC)和一組臨床生化分析，其包括(但不必限於)確定BUN、肌酐、AST、ALT、GGT、和CK。
為了確定排洩物中沒有非複製型載體，在每次注射腺病毒的第0至10天每日收集排洩物樣品並保存於-70℃，用於隨後檢測腺病毒。
在每次注射後的1、2和4周以及至少其後每月一次收集1-3ml血清，用於通過ELISA確定針對CS R32(用於對CS蛋白進行標準化ELISA分析所使用的CS蛋白的重複區，見下文)的抗體應答的性質和程度。血清樣品存放於-70℃直至使用，在臨近實驗結束時對樣品進行批處理以儘量縮小內部分析可變性。收集的血清的量要足夠，以便對於每次腺病毒注射可在第0、1、7和14天以及其後每4周使用0.5-1.0ml血清用於確定抗腺病毒抗體的滴度。在首次免疫接種之前、第二次免疫接種之後4周(如果量的要求允許)、第三次免疫接種之後4周、以及第三次免疫接種6個月之後收集大量(20-40ml)的EDTA或者肝素抗凝血用於採集細胞。採用密度離心分離的標準方法自這些樣品中濃縮外周血單個核細胞(PBMC)。儘管不同動物個體的細胞產率可明顯不同，但總體而言樣品量越大，採集的細胞的數量越大。由於無法預測確切的細胞回收率，因此優選地儘可能取得更大的樣品，這樣便得到了足夠的細胞，以便進行重複測定以滿足統計學分析的有效性。將細胞冷凍以便在以後的時間點進行批處理並由此提高質量控制。將細胞在含有10％DMSO的自體血清中進行冷凍，採用控制降溫速度技術，並在蒸氣相液氮中存放至少1周後使用。
在初始免疫之後，但在加強免疫之前，自那些CBC數據提示其可能耐受良好的較大的動物收集額外的樣品以便採集細胞。由於在第8周前，接受2劑RTS，S/佐劑的猴子為14隻(兩組)，接受單劑Ad35CS的猴子為14隻，因此預期至少對一半動物進行採樣並由此保持統計學的顯著性。注射後不超過4周就會有細胞採集物。由於僅接受腺病毒構建體的組僅接受2次注射，且因此與接受3次注射的猴子相比其採血計劃並不苛刻，因此在兩次注射中間進行細胞收集應該不會造成任何困難。
細胞免疫應答分析包括用於對抗原特異性的產生IFN-γ的細胞進行定量的短期ELISPOT測定。對經抗原刺激的細胞進行流式細胞儀分析不能確定在ELISPOT分析中所採集的數據，但提供了與發生應答的抗原特異性細胞的表型有關的額外信息。因此，還通過細胞內染色和流式細胞儀研究了抗原特異性CD8+的分泌IFN-γ的亞群。
進行的其他的分析包括針對其他細胞因子的大批ELISPOT分析、其他細胞因子的細胞內染色T細胞亞群計數、定量抗原特異性T細胞亞群細胞因子產生的其他基於流式細胞儀的分析、以及用於與其他方法相印證的定量RT-PCR。
將猴子分成年齡、性別、體重和地理來源均勻匹配的組，然後將各組進行隨機化。所有臨床評估和安全性終點的確定均是在不了解猴子的分組情況的條件下確定的。類似地，所有免疫學測定均是在不了解各個樣品屬於哪些組的情況下進行的。這一盲化原則的例外是相對於0、1、和3個月的時間表，有些動物按照0和6個月的時間表還是接受免疫接種；不過，就給予的具體注射而言，仍然維持盲化原則。
基於已有的、來自類似的但並不明顯相關的實驗數據，每個測試組7隻動物(對照組4隻)是理想的，這可使得組的規模最小但仍然能夠準確檢測到組間的差異。
使用標準的分析法對ELISA分析結果的幾何平均值進行參數比較，例如Student t-檢驗，假定等方差和雙側，和ANOVA。ELISPOT測定結果表示為每200,000個細胞的點，對結果進行類似的處理並使用非參數分析例如Kruskal-Wallis檢驗進行檢測。需要進行組間比較時，使用Student t-檢驗，利用原始數據或者對數轉化的數據，確定任何兩組之間的差異。
注射之前剪除毛髮並以70％的酒精擦拭清潔，以不退色的墨水在皮膚上畫出2.5-3cm的圓圈，以便定位注射部位用於隨後進行觸診和評估反應原性。在即將進入猴舍前將RTS，S的注射劑與佐劑混合。注射劑的終體積是0.5ml，並通過25-29號針頭輸送至前肢的肌肉組織內。如前所述(WO 2004/055187)在緩衝液中製備腺病毒構建體並以0.5ml的終體積肌肉內施用至同樣的部位。
無論對於血清還是細胞，最初的生物樣品是血液。表1B給出了採血時間表。監測動物的血液學狀態，其提示個體維持重複取樣的能力或者表明需要減少原計劃的取樣時間表。每次取血均以Coulter自動化血細胞計數器(需要＜50μl的不凝集血液)進行全血計數(CBC)。採用生產商推薦的GLP樣指導進行保養和維護。密切隨診血細胞比容、血紅蛋白、平均血球體積(MCV)、紅細胞(RBC)計數、以及網織紅細胞百分比，以確保動物不出現貧血。
使用20-24號針和注射器或者真空管自股靜脈、隱靜脈或者頭靜脈採集靜脈血。通常，對於抽取少於10ml的血液而言，隱靜脈或者頭靜脈是優選的，而在抽取10ml以上的體積時為避免溶血並縮短靜脈穿刺的時間則股靜脈是優選的。
在免疫接種前、末次免疫接種後2周、以及末次免疫接種後3個月，自動物收集外周血單個核細胞(PBMC)。在這一方案中，採用密度離心的標準方法分離PBMC，並凍存於45％自體血清(45％的鹽水和10％DMSO)。簡言之，將全血平鋪於Lymphoprep(Axis-Shield，Oslo，Norway)ficoll-hypaque細胞分離介質上，並在650g離心20分鐘。取出細胞層並以dPBS(Bio Whittaker，Walkersville，MD)洗滌2次，每次400g洗滌15分鐘。使用Coulter ACT*10血球計計數活細胞。將細胞沉澱以1×107/ml重懸於50％dPBS、50％鹽水中。滴加DMSO至終體積的10％。將細胞冷凍於0.55ml的小瓶中，每瓶準確為5百萬個細胞，置於-70℃冰箱的控制降溫isoropanol溶液中過夜，並存在於液氮蒸氣相備用。
末次疫苗接種後，在以全抗原和C端和N端特異性混合肽刺激後(詳見下文)，採用ELISpot分析來鑑定來自不同猴子的血液樣品中的分泌幹擾素γ(IFN-γ)的T細胞。結果示於圖1(末次疫苗接種後2周)和圖2(末次疫苗接種後3個月)，並以每百萬細胞的中位數點形成單位(median spot forming unit(SFU))分別表示於表2和表4；在對數轉換後的數據上使用方差分析(ANOVA)進行統計學比較。比較了所有的組。在檢測到統計學顯著性的情況下，可對組-組比較進行post-hoc分析(結果未顯示)。
為比較不同處理策略之間的ELISpot結果，計算出了以Ad35作為初始處理的策略的滴度幾何平均值的比率。在這些比率中，將單獨使用RTS，S(第0，2，3個月)所得到的滴度幾何平均值作為參照處理(圖5和圖6，以及表10)。類似地，計算出了以Ad35作為加強處理的策略的比率(圖7和圖8，以及表11)。
對N末端特異性刺激T細胞ELISpots的結果進行了類似的分析。結果分別示於圖9和圖10以及分別表12和14。最後，計算出結果並分別顯示於圖11(Ad35初始免疫策略)和圖12(Ad35加強免疫策略)以及表16和表17。
採用標準方法，在底部裝有PVDF的MultiScreen-IP ELISpot板(Millipore，Bedford，MA)中，以解凍的凍存PBMC進行了ELISpots。嚴格遵循無菌操作，直至在第二天取出細胞用於最後的斑點顯色(spotdevelopment)。
使用的培養基自RPMI-1640(Bio Whittaker，Walkersvile，MD)新鮮製備完全培養基(cRPMI)，加入了1∶100青黴素/鏈黴素、1∶100L-穀氨醯胺、1∶200NaHCO3(Sigma，St.Louis，MO)、1∶100非必需胺基酸、1∶100丙酮酸鹽、和1∶300 2-ME(Gibco)。使用的該批次的胎牛血清(FCS，HyClone，Logan，UT)以前已經通過非特異性增殖測定進行分析，可對猴的細胞的生長提供良好的支持但幾乎不產生刺激背景，cRPMI-10為加入了10％，cRPMI-20為加入了20％，等等。培養基+(M+)額外補充了1∶500的抗猴CD28和抗猴CD49D抗體(BD Pharmingen，San Jose，CA)。
新鮮製備以下刺激物，其濃度為在未添加血清的M+中所欲使用的終濃度的2倍Con A伴刀豆球蛋白A(Sigma)，2.5μg/ml(終濃度1.25μg/ml)，作為所有病毒的陽性對照。
CS-C混合15-聚體多肽，具有11個胺基酸的重疊，覆蓋PfCS分子的C端部分(由GSK，Rixensart，Belgium提供)，各種肽的濃度2.5μg/ml(終濃度1.35μg/ml)。
CS-N類似的混合15聚體肽，具有11個胺基酸的重疊，覆蓋PfCS分子的N末端。
RTS，S純化的全蛋白複合物RTS，S抗原，適合於細胞培養(GSK)，濃度為2μg/ml(終濃度1μg/ml)。
HEF純化的B型肝炎表面抗原(HbS)全蛋白(RTS，S的「S」組分)，同樣適合細胞培養(GSK)，濃度23.2μg/ml(終濃度11.6μg/ml)。
HbS-P混合HbS 15聚體肽(GSK)，各種肽的濃度為2.5μg/ml(終濃度1.25μg/ml)。
陰性對照為無進一步補充的M+。
如下製備板。以每孔50μl的1∶100稀釋於無菌dPBS的初級抗猴IFN-γ單克隆抗體(UcyTech#21-43-09，Utrecht，the Netherlands)包被板，並在塑膠袋中於4℃溫育5-6小時。使用前1小時去除包被抗體，並在37℃，5％CO2溼度控制型細胞培養箱中以cRPMI-10對板進行封閉。臨用前去除封閉培養基。
解凍凍存的PBMC將冷凍的小瓶在溫水(37-40℃)中旋轉直至幾乎不再融化，將0.55ml內容物立即轉移至8ml RPMI-20中。將細胞在350g洗滌13分鐘，將沉澱物仔細地重懸於2.0ml cRPMI-20。取無菌的40μl樣品以活細胞數量，必要時調整體積以產生2×106細胞/ml的單細胞懸液。
預刺激將等體積的cRPMI-20的細胞懸液與M+中的刺激物混合於聚丙烯細胞培養管中產生具有所需終濃度的各種試劑。將細胞在培養箱中放置至少5小時，蓋子擰松並保持傾斜狀態依賴於氣體交換。
終刺激溫育5-6小時後，將細胞在400g離心10分鐘，棄上清。然後將細胞立即重懸於半量的cRPMI-20和半量的刺激物中。再將它們放回培養箱放置10-20分鐘以使得pH達到穩定。然後輕柔地混合細胞並小心地200μl(200,000個細胞)移至已經封閉的空板的合適的孔中。所有步驟都需要小心以保證孔不會幹燥。將板靜置溫育過夜(＞16小時)。
斑點顯色(Spot development)將1∶100稀釋於dPBS(含2％FCS)中的多克隆抗猴IFN-γ抗體(UCyTech)作為第二抗體。將細胞和培養基自板中輕輕移去；用dPBS-0.5％Tween 20(Sigma)將孔洗滌8次，加入50μl稀釋的第二抗體。將板置於塑膠袋中在搖床上室溫溫育3小時。再次以dPBS-0.5％Tween 20洗滌板8次，並加入50μl/孔1∶1000稀釋的鏈黴抗生物素鹼性磷酸酶綴合物(Southern Biotech#7100-04，Birmingham，AL)。然後將板置於塑膠袋中在搖床上再室溫溫育2小時。最後，如前面一樣將板洗滌8次，隨後以蒸餾水洗滌1次，加入100μl/孔的發色NBT-BCIP底物(Pierce Biotech，Rockford，IL)。顯色10-20分鐘，直至背景變為黑色。然後將板以300μl蒸餾水衝洗至少兩次，空氣中乾燥過夜後讀取數值。
讀板使用AID ELISpot Reader v3.1.1，在AID ELHR01 Elispot讀取儀上讀板。對所有孔進行肉眼檢查，手工排除不合適的點(有細纖維或者其他雜質)。數據保存於Excel表中。取雙份或者三份孔進行平均，將該數值乘以5以得到最後的原始數據，單位是點/百萬個細胞。
質量控制凍融後的活細胞回收率平均值超過95％。如果培養基對照孔的平均值大於20點/百萬個細胞，或者如果ConA孔小於500點/百萬個細胞，則重複進行操作。此外，CD4+和CD8+細胞的總體活力經流式細胞儀以7-AAD染料排斥法和表面染色法評估，均超過90％，否則重複進行操作(數據未顯示)。
表1A.在恆河猴中進行的初始/加強免疫療法的實驗性療法，使用基於血清型5和35的重組腺病毒載體(其包含編碼惡性瘧原蟲CS蛋白的基因)和作為蛋白質抗原組分的佐劑化的RTS，S。

表1B.採血時間表。採集CBC和細胞需要全血；化學分析和ELISA需要血清。估計1ml血清代表2ml全血。僅給出了全血的量。範圍表示可能需要自猴子採集更多的樣品。CBC/化學分析欄中的「0.5」表示在那些天中僅進行CBC。*表示不是所有的猴子都在該時間點取血。


在下文的表中，將RTS，S簡稱為″RTS″。
表2.加強後2周的PfCS C端特異性T細胞免疫IFN-γELISpot(SFU/百萬個細胞)的中位數和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了不同的初始/加強免疫療法(左側)。

表3.Student T-檢驗。如表2所示的加強(末次疫苗接種)後2周的PfCS C端特異性IFN-γELIspot比較的p值。

表4.加強後3個月的C端特異性IFN-γT細胞免疫ELISpot(SFU/百萬個細胞)的中位數和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了初始/加強免疫療法(左側)。

表5.Student T-檢驗。如表4所示的加強(末次疫苗接種)後3個月ELIspot比較的p值。

表6.末次加強後2周的B細胞免疫(抗重複片段的抗體滴度)ELISA的中位數和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了不同的初始/加強免疫療法(左側)。

表7.Student T-檢驗。如表6所示的末次加強(末次疫苗接種)後2周抗體比較的p值。

表8.加強後3個月的與惡性瘧原蟲CS有關的B細胞免疫(抗體滴度)ELISA(SFU)的中位數和幾何平均值和ANOVA比較。給出了不同的初始/加強免疫療法(左側)。

表9.Student T-檢驗。如表8所示的加強(末次疫苗接種)後3個月抗體比較的p值。

表10.幾何平均值的比率*。T細胞應答和B細胞應答。Ad35用作初始疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照表11.幾何平均值的比率*。T細胞應答和B細胞應答。Ad35用作加強疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照表12.末次疫苗接種後2周的PfCS N端特異性IFN-γT細胞免疫ELISpot(SFU/百萬個細胞)的中位數和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了初始/加強免疫療法(左側)。

表13.Student T-檢驗。如表12所示的末次加強(末次疫苗接種)後2周的ELISpot比較的p值。

表14.加強後3個月的PfCS N端特異性IFN-γT細胞免疫ELISpot(SFU/百萬個細胞)的中位數和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了不同初始/加強免疫療法(左側)。

表15.Student T-檢驗。如表14所示的加強(末次疫苗接種)後3個月的ELISpot比較的p值。

表16.抗PfCS的N末端的T細胞應答的幾何平均值的比率*。Ad35CS用作初始疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照表17.抗CS的N末端的T細胞應答的幾何平均值的比率*。Ad35CS用作加強疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照參考文獻 O et al.(2001)Complete，long-lasting protection againstmalaria of mice primed and boosted with two distinct viral vectors expressingthe same plasmodial antigen.Proc Natl Acad Sci USA 9811491-11496Caspers P et al.(1989)The circumsporozoite protein gene from NF54，aPlasmodium falciparum isolate used in malaria vaccine trials.Mol BiochemParasitol 35185-189Clyde DF et al.(1973)Immunization of men against sporozoite-inducedfalciparum malaria.Am J Med Sci 266169-177De Jong JC et al.(1999)Adenoviruses from human immunodeficiency virus-infected individuals，including two strains that represent new candidateserotypes Ad50 and Ad51 of species B1 and D，respectively.J Clin Microbiol373940-3945Doolan DL et al.(1998)DNA vaccination as an approach to malaria controlcurrent status and strategies.Curr Topic Microbiol Immunol 22637-56Estcourt MJ et al.(2002)Prime-boost immunization generates a highfrequency，high-avidity CD8+cytotoxic T lymphocyte population.IntImmunol 1431-37Gandon S et al.(2001)Imperfect vaccines and the evolution of pathogenvirulence.Nature 414751-756Gordon DM et al.(1995)Safety，immunogenicity，and efficacy of arecombinantly produced Plasmodinm falciparum circumsporozoite protein-hepatitis B surface antigen subunit vaccine.J Infect Dis 1711576-1585Hoffmann SL and Doolan DL.(2000)Malaria vaccines-targeting infectedhepatocytes.Nature Med 61218-1219Horn NA et al.(1995)Cancer Gene Therapy using plasmid DNApurificationofDNA for human clinical trials.Human Gene Therapy 6565-573
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權利要求
1.一種試劑盒，其包含-存在於藥用可接受的賦形劑中的複製缺陷型重組腺病毒，所述腺病毒包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的環子孢子(CS)抗原的異源核酸；和-佐劑化的蛋白質抗原；其中所述重組腺病毒選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。
2.權利要求1的試劑盒，其中所述重組腺病毒是人類腺病毒血清型。
3.權利要求1或2的試劑盒，其中所述蛋白質抗原包含來自引起瘧疾的寄生蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。
4.權利要求3的試劑盒，其中所述蛋白質抗原包含形式為與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。
5.權利要求4的試劑盒，其中所述蛋白質抗原包含RTS，S。
6.權利要求1-5中任一項的試劑盒，其中所述蛋白質抗原以包含QS21和3D-MPL的佐劑進行佐劑化。
7.權利要求6的試劑盒，其中所述佐劑還包含含有膽固醇的脂質體。
8.權利要求1-7中任一項的試劑盒，其中所述引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲。
9.權利要求1-8中任一項的試劑盒，其中所述異源核酸經過密碼子優化以提高所編碼的蛋白質在哺乳動物中、優選地在人類中的產生。
10.權利要求1-9中任一項的試劑盒，其中所述重組腺病毒與佐劑存在於一混合物中。
11.一種試劑盒，其包含-存在於藥用可接受的賦形劑中的複製缺陷型重組猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒，所述腺病毒包含編碼經密碼子優化的來自惡性瘧原蟲的環子孢子(CS)抗原的異源核酸；和-包含RTS，S的佐劑化的蛋白質抗原。
12.權利要求11的試劑盒，其中所述蛋白質抗原以包含QS21和3D-MPL的佐劑進行佐劑化。
13.權利要求12的試劑盒，其中所述佐劑還包含含有膽固醇的脂質體。
14.權利要求1-13中任一項的試劑盒，其中所述複製缺陷型重組腺病毒是初始免疫組合物，且所述佐劑化的蛋白質抗原是加強免疫組合物。
15.包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的CS抗原的異源核酸的複製缺陷型重組腺病毒以及佐劑化的蛋白質抗原在製備用於治療或預防瘧疾的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒或人類腺病毒血清型11，24，26，34，35，48，49或50。
16.權利要求15的用途，其中所述複製缺陷型重組腺病毒用作初始免疫組合物，且所述佐劑化的蛋白質抗原用作加強免疫組合物。
17.權利要求15或16的用途，其中所述蛋白質抗原包含來自引起瘧疾的寄生蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。
18.權利要求15-17中任一項的用途，其中所述引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲。
19.權利要求15-18中任一項的用途，其中所述蛋白質抗原包含形式為與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。
20.權利要求19的用途，其中所述佐劑化的蛋白質抗原包含RTS，S。
21.權利要求15-20中任一項的用途，其中所述蛋白質抗原以QS21和3D-MPL進行佐劑化。
22.權利要求15-21中任一項的用途，其中所述異源核酸經過密碼子優化以提高所編碼的蛋白質在哺乳動物中、優選地在人類中的產生。
23.對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種的方法，包括以下步驟-以存在於藥用可接受的賦形劑中的複製缺陷型重組腺病毒對所述哺乳動物進行初始免疫，所述腺病毒包含編碼來自引起瘧疾的寄生蟲的CS抗原的異源核酸；和-以佐劑化的蛋白質抗原對所述哺乳動物進行加強免疫，所述蛋白質抗原包含形式為與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。
24.權利要求23的方法，其中所述蛋白質抗原包含RTS，S。
25.權利要求23或24的方法，其中所述重組腺病毒是人類腺病毒、猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒。
26.權利要求25的方法，其中所述重組腺病毒是選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50中的人類腺病毒。
27.權利要求23-26中任一項的方法，其中所述蛋白質抗原以QS21和3D-MPL進行佐劑化。
28.權利要求23-27中任一項的方法，其中所述引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲。
29.權利要求23-28中任一項的方法，其中所述異源核酸經過密碼子優化以提高所編碼的蛋白質在哺乳動物中、優選地在人類中的產生。
30.使用權利要求1-14中任一項的試劑盒對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種的方法。
31.使用權利要求14的試劑盒對哺乳動物進行抗瘧疾感染免疫接種的方法，其中所述加強免疫之後再進行一或多次後續加強免疫。
全文摘要
本發明涉及新的疫苗療法，其中實施的特異性初始/加強免疫療法使用了攜帶編碼惡性瘧原蟲抗原的核酸的中和程度低的重組腺病毒載體和純化的重組蛋白質疫苗例如RTS，S，以及合適的佐劑。
文檔編號A61K39/015GK101068568SQ200580034802
公開日2007年11月7日 申請日期2005年10月13日 優先權日2004年10月14日
發明者馬裡亞·格拉西亞·帕烏, 傑普·古德斯米特, 約瑟夫·D·科恩, 帕特裡斯·M·杜波依斯, V·安·斯圖爾特, 唐納德·海普納爾 申請人:克魯塞爾荷蘭公司, 葛蘭素史克生物製品股份公司, 以沃爾特裡德軍事研究所的名義，由陸軍部部長代表的美國政府