促進雜種優勢或雜種劣勢的基因及其產物的鑑定及其用途的製作方法

2023-12-04 03:12:26 1

專利名稱：：促進雜種優勢或雜種劣勢的基因及其產物的鑑定及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及鑑定用於誘導雜種優勢、雜種劣勢和/或診斷、預後和治療疾病的候選基因及其編碼的蛋白質的方法。特別地，本發明涉及鑑定導致雜種優勢或雜種劣勢的因子的方法，包括鑑定由候選基因的等位基因編碼的多個mRNA或蛋白質種類的存在或不存在，其中多個mRNA或蛋白質種類的存在表示雜種優勢或雜種劣勢。
背景技術：
：數百年來已經認識到一些遺傳因子具有影響作物、蔬菜、水果和動物如牛、綿羊和豬的生長、生活力、抗蟲性或健壯性的能力，例如在遺傳無關的生物正常親本的後代中更有影響。該生物現象稱為雜種優勢(HV)或混種盛勢(heterosis)。遺傳無關親本的後代稱為雜合生物體。再一公知的HV形式，其中幾乎正常的生物表型在生物缺陷親本的後代中恢復，其中各自攜帶相同基因的不同突變形式，稱為基因內或基因間互補(IC)。難以過高估計HV的商業重要性和將來的效用。例如，單在農業領域中，HV的應用產生數十億美元的收益並反映出遺傳領域中最大的應用成就之一(參見，例如，Alam"fl/.(2004)，Z/^7a"gUm'.5W.5，406)。國際糧食政策研究所已經預測與1995年的消費水平相比較，到2020年發展中世界的肉需求量將增加100%(Pinstmp-Anderson等，在2020VisionFoodPolicyReport,國際糧食政策研究所，華盛頓特區)。關於糧食作物，僅在印度，預測到2025年的糧食產量將需要被加倍，甚至到2050年為三倍，以支持預測的人口增長(Sengupta"a/.，(2001)，CwrGe朋m/c^2，181)。儘管已經估算了未來全球糧食需求，糧食作物生產的增長速率在近些年已經降低，特別是在20世紀90年代，每年大約降低1%(Conway&Toennissen，(1999)，A^m",402，C55)。因此，促進HV的新技術的發展和應用是必要的，以確保滿足未來糧食作物和動物全球生產速率的增加的需求。長期以來持有這樣的觀點通過雜合或雜交生物體中獨特合成的新蛋白質(如激素、酶或生長因子)來驅動HV(參見，例如，Gill，(1977)，/w:GeneticsandWheatImprovement,A.K.Gupta，(OxfordandIBHPublishingCo.NewDelhi,pp204-207;Scandaliosda/.,(1972)，所0c/2綴5/—,153，p695;Romagnolia/.，(1990)，TTzeoKj///.Gewe/.80，p769;Chengefa/.，(1996)，C7z/"ese.Sm〃.41，p40)。因為通常難以了解在雜合後代中怎樣能形成新的蛋白質，提出許多可替換模型來解釋HV。近來，提出了類似電路的模型(Milborrow(1998)，五平組49，p1063)和另一種基於數學的模型(Gordon(1999)，7/置#，83，p757)。然而，如Birchlered(2003)，77zeP/aw/Ce〃，15，p2236和更近地由Syed&Chen，(2005)，T/ew^Xy，94，p295所述的，驅動HV或混種盛勢的基礎分子遺傳機理仍然是未知的。在2003年，Birchler和同事還預測了"混種盛勢的最終分子解釋將決定是否可以將其操縱用於農業和生物技術的益處"。早在1960年就已顯示了可以在雜合後代中形成雜交蛋白質(Schwartz,(1960)，Prac.iVa".JcadU&4，46，p1210)。禾目同的工作者還假設了通過這些雜交蛋白質來驅動HV。在之後的十年，當證實HV與新的或雜交蛋白質的形成相關時，證明了這種假設是正確的(Wills&Nichols(1972)，屍艦淑"ca"c/.園，69，p323;Singh"a/.，(1975)，G置acs，80，p637)。在更近的時間裡，已經在呈現出不同形式的雜種優勢的雜合小雞中清楚地鑑定了產生新的蛋白質並且在任一親本中都不存在的獨特mRNA禾中類(Sune/a/.，(2005)AnimalGenetics,36，p210)。與HV相反，在雜合後代中形成的一些雜交蛋白質，與其任一親本相比較，可能降低後代的健壯性、生活力或健康狀況，或引起後代的疾病。這種現象稱為雜種劣勢(HD@)(參見我們的共同未決國際專利申請No.PCT/AU2005/000141)。一些形式的HD可能由雜合後代中雜交蛋白質的與野生型親本蛋白質的活性相比不當或異常的活性直接引起。這類人疾病的實例包括2型糖尿病以及患有全身性紅斑狼瘡的患者的血栓性疾病。對於2型糖尿病，許多研究的結果已經表明被基因(C^PWM)編碼的稱為新鈣蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶的酶涉及疾病過程。Cox(2001)評價了這些關於C4/W川遺傳變異性研究的共同結果並推斷"形成高風險組合的兩個不同(C4WW0)單模標本雜合的個體相對於單模標本的所有其它組合具有提高3倍的風險，相對於最低風險的單模標本組合提高7倍的風險。高風險組合中任一單模標本純合的個體沒有處於提高的產生2型糖尿病的風險中"(/^肌ikfo/.10，p2301)。另一方面，一些形式的HD是間接引起的，作為宿主免疫系統識別為免疫外源物質的雜交蛋白質的結果。這類疾病的實例包括1型糖尿病和自體免疫肝病。一些患有1型糖尿病的患者在他們的血液中含有自體抗體，其對抗胰島細胞的組分，胰島細胞是胰腺中產生胰島素的細胞。這些自體抗體的目標是穀氨酸脫羧酶(GAD65)。與HD的免疫誘導模式相一致，BoutinWa/.，(2003)(屍丄oS5Zo/.1，p68)的研究證實了1型糖尿病目標自體抗原GAD65的免疫性在不同遺傳形式的OiD65雜合的患者中得到了提高。儘管HV在農業、園藝和水產養殖中應用的主要商業重要性和廣泛國際研究努力針對了解HV和HD的基礎分子遺傳基礎，但迄今沒有鑑定出植物或動物或魚中驅動這兩個表型中任一個的基因。其主要原因是因為目前可用的鑑定或定位引起優勢或劣勢表型包括疾病的基因的方法依賴於使用一系列分布於被研究的生物體整個基因組的遺傳標記。通常這些遺傳標記包括一組單核苷酸多態性或SNP。然後通過測定哪個SNP最緊密分離或與研究的生物性狀或疾病共同遺傳來定位相關的基因。將SNP分析應用於儘可能多代的系譜時，共分離研究是最有效的，系譜中家族的一些成員患有研究的疾病或表型。當疾病或表型根據孟德爾遺傳模式通過每一代傳遞時，這種鑑定相關基因的方法高度成功。然而，因為HV和HD的遺傳性沒有遵照孟德爾遺傳模式，因此這些技術不能鑑定HD或HV涉及的基因。因此，存在鑑定涉及促進HV和HD的基因的方法的需要。此外，存在測定哪個雜交蛋白負責HV或HD誘導的方法的需要。
發明內容為了合成新的多肽或蛋白質，發明人假定在剪接過程中，能夠通過主要的RNA剪接機理在體內產生雜交mRNA分子，該機理允許來自一個親本的遺傳基因的外顯子的3'端連接從另一個親本的同一遺傳基因的下一個下遊外顯子的5'端。重要的是認識到本文產生雜交基因產物的機理不同於迄今已經知道的其它機理(參見，例如，Mongelard(2002)，Ge""/o，160，p1481)，其中可以通過融合來自相同染色體上不同DNA鏈的第一RNA種類或來自相同親本來源的不同轉錄單位形成複合蛋白質。因此，Mongelard等描述了不同DNA鏈的兩個分離轉錄單位的連接。相反地，本發明人顯示了通過生物化學途徑產生新的或雜交mRNA分子，可以從這些mRNA分子合成新的雜交蛋白質，該途徑將來自兩個不同親本等位基因轉錄單位每一個的外顯子或其部分引入相同的成熟mRNA分子中。因此，最廣泛方面而言，本發明的描述了解釋怎樣在雜合後代中產生HV和HD生物表型的分子遺傳機理。通過參照其親本的可遺傳遺傳密碼，雜合後代中形成的並且產生HV和HD的新遺傳結構不明顯。相應地，第一方面，本發明提供了鑑定能夠在動物或植物中產生雜種優勢或雜種劣勢的候選基因的方法，包括以下步驟(0比較從呈現出雜種優勢或雜種劣勢的動物或植物分離的候選基因的等位基因的mRNA序列和從所述動物或植物的親本分離的相應等位基因的核苷酸序列；(ii)鑑定來自呈現出雜種優勢或雜種劣勢的所述動物或植物的等位基因中編碼胺基酸序列變化的mRNA序列差異；和(iii)鑑定由位於候選基因內兩個或多個不同外顯子內的mRNA序列編碼的所述動物或植物中候選基因的等位基因之間的胺基酸序列的變化。第二方面，本發明提供了鑑定引起雜種優勢或雜種劣勢的因子的方法，包括以下步驟(i)鑑定由候選基因的等位基因編碼的多個mRNA或蛋白質種類種類的存在或不存在；和(ii)如果存在多個mRNA或蛋白質種類，那麼分析所述的mRNA或蛋白質種類來測定所述的種類是否具有核苷酸或胺基酸序列的變化，各自對應於兩個或多個外顯子中的變化；其中步驟(ii)中多個mRNA或蛋白質種類的存在表示雜種優勢或雜種劣勢。第三個方面，其提供了在動物或植物中產生雜種優勢或雜種劣勢的方法，包括以下步驟(i)鑑定由候選基因的等位基因編碼的多個mRNA或蛋白質種類的存在或不存在；和(ii)如果存在多個mRNA或蛋白質種類，那麼分析所述的mRNA或蛋白質種類來測定所述的種類是否具有核苷酸或胺基酸序列的變化，各自對應於兩個或多個外顯子中的變化；其中步驟(ii)中多個mRNA或蛋白質種類的存在表示雜種優勢或雜種劣勢；(iii)測定與野生型蛋白對照的功能相比較的多個蛋白質種類的功能來測定哪個種類促進了所述植物或動物中的HV或HD;(iv)製備包括編碼步驟(iii)中所述蛋白質種類的核苷酸序列的構建體；(v)將所述構建體轉化至受體植物或動物細胞中；和(vi)使植物或動物再生，其從所述細胞表達所述構建體。在第四個方面中，本發明提供了檢測植物或動物中雜交mRNA的存在或不存在的方法，包括從植物或動物分離mRNA的步驟，並將所述mRNA的核苷酸序列與植物或動物的等位基因的相應編碼序列相比較。第五個方面，本發明提供了包括合成基因的構建體，該基因包括來自基因不同等位基因的外顯子，其中所述等位基因編碼胺基酸序列的變化，其中該變化發生在不同等位基因之間。本發明進一步涉及體內產生的雜交mRNA分子或由其翻譯的雜交蛋白質的用途，用來克服植物或動物中的疾病和/或誘導植物或動物中的雜種優勢。儘管優選了所有農業上重要的植物物種，但可以從任何高等植物分離植物細胞，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。優選地，從選自大麥、黑麥、高粱、玉米(maize)、大豆、小麥、燕麥(com)、馬鈴薯、棉花、水稻、油菜(包括canola)、向日葵、紫苜蓿、甘蔗、香蕉、黑莓、藍莓、草莓和樹莓、香瓜、胡蘿蔔、花椰菜、咖啡、黃瓜、茄子、葡萄、香蜜瓜、生菜、芒果、甜瓜、洋蔥、番木瓜、豌豆、胡椒、菠蘿、菠菜、南瓜、甜玉米、菸草、番茄、西瓜、薔薇科水果(如蘋果、桃、梨、櫻桃和李子)和蔬菜芸苔(如花莖甘藍、巻心菜、花椰菜、抱子甘藍和球莖甘藍)的植物分離植物細胞。其表型可能被改變的其它作物、水果和蔬菜包括大麥、醋慄、鱷梨、柑橘類水果如桔子、檸檬、葡萄柚和紅橘、朝鮮薊、櫻桃、堅果類如胡桃和花生、菊苣、韭蔥，根類如竹芋、甜菜、木薯、芫菁、蘿蔔、山藥、甘薯和豆類。可能用於本發明的其它植物細胞包括從木本物種如松樹、白楊和桉樹分離的細胞。更優選地，所述植物細胞是大米細胞、小麥細胞、大麥細胞、黑麥細胞、高粱細胞或玉米細胞。轉化植物細胞的步驟包括本領域己知的能夠穩定轉化植物細胞的任何方法。獲得用於豆科(紫苜蓿、大豆、苜蓿等)、傘形科(胡蘿蔔、芹菜、歐洲防風草)、十字花科(巻心菜、蘿蔔、油菜、花莖甘藍等)、葫蘆科(甜瓜和黃瓜)、禾本科(小麥、玉米、水稻、大麥、黍米等)、茄科(馬鈴薯、番茄、菸草、胡椒等)和其他各種作物的合適操作方案。參見Ammirato"a/.(1984)HandbookofPlantCellCulture—CropSpecies,MacmillanPubl.Co.Shimamotoa/.(1989)Nature338:274-276;Fromma/.(1990)Bio/Technology8:833-839和Vasil"a/.(1990)Bio/Technology8:429-434中所述的操作方案。優選地，用選自同源重組如使用基於大範圍核酸酶I-Scel的使用的技術、微粒轟擊、PEG介導的原生質體轉化、電穿孔、碳化矽纖維介導的轉化或農桿菌介導轉化的方法轉化植物細胞。在本發明的優選實施方案中，轉化步驟包括微粒轟擊，其中通過用含有構建體的DNA包覆微粒並使受體細胞接觸微粒來進行微粒轟擊。在第六個方面中，本發明提供了體外或體內產生的雜交蛋白分子的用途來克服植物或動物中雜種劣勢和/或誘導植物或動物中雜種優勢，包括將所述雜交蛋白引入所述動物或植物的步驟。雖然對哺乳動物和魚特別有用，但可以從任何動物分離動物細胞。合適的哺乳動物來源包括靈長目、齧齒目、兔形目、鯨目、食肉目、奇蹄目和偶蹄目的成員。因為它們相似的生物學和經濟重要性，特別優選奇蹄目和偶蹄目的成員。例如，偶蹄目包括分布在九個科的大約150種活物種豬(豬科)、野豬(西端科)、河馬(河馬科)、駱駝(駱駝科)、麝香鹿(鼷鹿科)、長頸鹿和霍加被(長頸鹿科)、鹿(鹿科)、麋鹿(叉角羚科)，和牛、綿羊、山羊和羚羊(牛科)。在許多國家中，這些動物中的許多被用作飼養動物。更重要地，對於本發明，許多經濟上重要的動物，例如山羊、綿羊、牛和豬具有非常相似的生物學並共享高度的基因同源性。奇蹄目包括馬和驢，兩者在經濟上都是重要的而且密切相關。實際上，公知馬和驢可以異種交配。在一個實施方案中，從有蹄動物獲得動物細胞。優選地，有蹄動物選自牛科、羊科、鹿科、豬科、馬科和駱駝科的馴養或野生代表。這樣的代表的實例是奶牛或公牛、野牛、水牛、綿羊、大角綿羊、馬、矮種馬、驢、騾、鹿、麋鹿、馴鹿、山羊、水牛、駱駝、美洲駝、羊駝和豬。牛科物種中尤其優選的是黃牛、瘤牛和水牛奶牛或公牛。在一個實施方案中，從水生生物分離動物細胞，如脊椎海洋動物和無脊椎海洋動物。更優選地，水生生物選自魚、兩棲動物和軟體動物。魚包括但不限於斑馬魚、歐洲鯉魚、鮭魚、食紋魚、丁鯛，七鰓鰻、圓蝦虎魚、羅非魚和鱒魚。兩棲動物包括但不限於蟾蜍和青蛙。軟體動物包括但不限於太平洋牡蠣、斑馬貽貝、條紋貽貝、紐西蘭螺旋貝、福壽螺、非洲大蝸牛、雙臍螺屬和泡螺屬中傳播疾病的蝸牛。優選通過同源重組將本發明的構建體轉化至細胞中。優選通過將工程化的構建體加入細胞如生長於含有目標基因的組織培養物中的胚胎幹細胞中來誘導同源重組(參見MolcularGenetics,U.Melcher(1998)。更優選地，將轉化的幹細胞注射至新的胚泡中，使新構建體固定於成熟動物中。具體實施方式本發明優選實施方案的描述本文提及的所有出版物的引用是為了描述和公開操作方案和試劑的目的，這些在出版物中報導過的方案和試劑可以結合本發明使用。在此，不能認為由於在先發明早於這些公開內容而使本發明不被授權。除非另外指出，本發明實施中使用了本
技術領域：
內的傳統分子生物學、植物和動物生物學和重組DNA技術。這些技術是技術人員公知的，並在文獻中有充分解釋。參見，例如，Maniatis，Fritsch&Sambrook，"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(1982);"DNACloning:APracticalApproach"VolumesIandII(D.N.Glover編輯，1985);"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait編輯，1984);"NucleicAcidHybridization"(B.D.Hames&S.J.Higgins編輯，1985);"TranscriptionandTranslation"(B.D.Hames&S.J.Higgins編輯，1984);B.Perbal，"APracticalGuidetoMolecularCloning"(1984)和Sambrook等，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",第12版(1989)。可以理解，本發明不限於所述的特定材料和方法，因為這些可以改變。還應當理解，本文所用的術語只是用於描述特定實施方案的目的，並不是意味著限制本發明的範圍，本發明的範圍只是由所附權利要求來限定。必須注意，如本文和所附權利要求所用的單數形式"a"、"an"和"the"包括複數指代物，除非文中清楚地表明有其他含義。因此，例如，參照"一種植物細胞"包括多種這樣的植物細胞，參照"一種動物細胞"是指一種或多種動物細胞。儘管與本文所述的那些相似或等價的任何材料和方法可以用來實施或測試本發明，但目前所述的是優選的材料和方法。在本發明最寬的一個方面中，描述了雜交mRNA和/或雜交蛋白質形成的新機理。更重要地，如本文所述的，本發明描述了解釋雜種優勢(HV)和雜種劣勢(HD)現象的機理。與任一親本中相同生物表型的表達相比較時，後代呈現出任何特定生物表型的提高形式時，產生了HV。與其親本相比較時，後代呈現出任何特定生物表型的降低形式或疾病時，產生了HD@。可以通過雜交蛋白如酶活性的降低來直接引起HD的生物表型。另一方面，一些雜交蛋白可能被認作是免疫外源的並通過誘導自體免疫過程引起一些形式的HD的產生。如本文所用，術語"雜交mRNA"和"雜交蛋白"指的是單個基因的等位基因的轉錄和/或翻譯過程中產生的不同或多個種類的mRNA和/或蛋白。圖1中顯示了可能通過如本文所述的雜交mRNA分子的反外顯子(trans-exonic)裝配機理形成的雜交蛋白的範圍實例。已經從(Corre"a/.，(2002)，jWo/.說o/.五w/.19，P1261)中所述的可替換7^/等{立基因的基因組結構推導出與擬南芥雜交的i^/編碼的雜交蛋白。被與擬南芥株系CYR和JEA相關的7^/等位基因的外顯子1、2和3編碼的野生型和可能的雜交一級肽。tableseeoriginaldocumentpage15來自擬南芥株系cYR和JEA中FRI等位基因的可替換前mRNA分子(參見,Correetal.，Mol.Biol.Evol.19:1261(2002))根據中心法則,預期的被FRI的外顯子l、2和3編碼的野生型肽。tableseeoriginaldocumentpage15根據在此本文鑑定的新生化途徑，預期的通過被CYKXJEA雜交中形成的mRNA分子產生的雜交多肽El、E2和E3各自指的是擬南芥基因Fr/gWa內的外顯子1、2和3。數字55、368和474各自指的是外顯子1、2和3內編碼的變體胺基酸的位置。通過常規的三字母密碼來表示每個外顯子編碼並包括的在胺基酸位置55、368和474的胺基酸變體。通過參照上述實驗證實的生化途徑來預測CYRXJEAF1雜交體中產生的雜交一級肽的結構。如以下進一步所述的，一旦本領域技術人員認識並了解上述現象，將容易理解可以治療各種病態和改進植物/動物。以下的描述使用了重組DNA技術中使用的大量術語。除非另外指出，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域技術人員通常理解的意思。以下的參考文獻給本領域技術人員提供了本發明中所用的許多術語的一般定義Singleton"a/.，"DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology"(第2片反，1994);"TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology"(Walker編輯，1988);"TheGlossaryofGenetics"第5版，Rieger，R.Wa/.(編輯)，SpringerVerlag(1991);禾口Hale&Marham，"TheHarperCollinsDictionaryofBiology"(1991)。通常，本文描述的植物和動物培養和育種以及重組DNA技術中的術語和實驗室方法是公知的並且是本領域中常用的。定義術語"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核酸序列"和"核酸片段"/"分離的核酸片段"在本文可交換使用。這些術語包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，任選地含有合成的、非天然或改變的核苷酸鹼基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由一個或多個cDNA、基因組DNA、合成DNA或其混合物的片段構成。RNA可以是mRNA。"mRNA"或"信使RNA"是單鏈RNA分子，其從DNA轉錄得到並作為模板和編碼蛋白質的胺基酸序列。術語"分離的"多核苷酸指的是基本上沒有其他核酸序列的多核苷酸，其他核苷酸序列如但不限於通常伴隨或與分離的多核苷酸相互作用的其他染色體和染色體外DNA和RNA，如其天然產生環境中發現的。可以從天然產生它們的宿主細胞中純化分離的多核苷酸。本領域技術人員已知的常規核酸純化方法可以用來獲得分離的多核苷酸。該術語還包括重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。術語"重組"意思是，例如，由兩個另外分開的序列片段的人工組合製得的核酸序列，例如，通過化學合成或通過遺傳工程技術的分離核酸的操作。如本文所用的，"基本上相似"指的是其中一個或多個核苷酸鹼基的改變沒有導致所編碼的胺基酸序列改變或一個或多個胺基酸的置換沒有影響核苷酸序列所編碼多肽的功能特徵的核酸分子。還可以通過雜交的能力來表徵基本上相似的核酸分子。通過在本領域技術人員公知的嚴謹條件下的DNA-DNA或DNA-RNA雜交來提供該同源性的估算(HamesandHiggins，Eds.(1985)NucleicAcidHybridisation,IRLPress,英國牛津)。雜交後洗滌決定了嚴謹條件。一組優選的條件使用一系列洗滌開始在室溫用6XSSC、0.5%SDS15分鐘，然後用2XSSC、0.5。/。SDS在45"C重複30分鐘，然後用0.2XSSC、0.5。/。SDS在50。C30分鐘重複兩次。更優選的一組嚴謹條件使用更高的溫度，其中洗滌與上述那些洗滌相同，除了最後在0.2XSSC、0.5%SDS中兩次30分鐘洗滌的溫度升高至6(TC。另一組優選的高嚴謹條件使用在0.1XSSC、0.1%SDS中65"兩次最終的洗滌。可以從使用本領域技術人員公知方法化學合成的寡核苷酸結構單元(buildingblock)裝配"合成基因"或"合成核酸片段"。將這些結構單元連接並退火來形成更大的核酸分子，然後可以通過酶學裝配來構建完整的所需核酸分子。同核酸片段相關的"化學合成"意思是在體外裝配成分核苷酸。可以使用很成熟的方法來完成核酸片段的手工化學合成，或可以使用多種商業可得的儀器中的一種來進行自動化化學合成。相應地，可以基於核苷酸序列的最佳化定製核酸片段來反映宿主細胞的密碼子偏好，用於最佳的基因表達。如果密碼子使用偏好宿主偏好的那些密碼子，本領域技術人員將鑑別出成功的基因表達的可能性。優選密碼子的測定可以基於源自可獲得序列信息的宿主細胞的基因概況。"候選基因等位基因"指的是候選基因序列的正常等位基因以及攜帶使個體傾向於發展成雜種優勢或雜種劣勢變化的等位基因。相應地，如本文使用的，術語"候選基因序列"和"候選基因等位基因"指的是包括基因序列、等位基因或片段的雙鏈DNA，以及包括基因序列、等位基因或片段的任一單鏈DNA(即，編碼和非編碼鏈中的任一個)。"候選基因"或"基因"指的是表達特定蛋白質的核酸片段，如mRNA片段，並包括編碼序列之前(5'非-編碼序列)、之間和之後(3'-非編碼序列)的調控序列，其具有產生雜種優勢或雜種劣勢的潛能。"天然基因"指的是天然發現的具有其自身的調控序列的基因。"嵌合基因"或"外源基因"在本文可交替使用並指的是不是天然基因的任何基因，包括不是在天然中一起發現的調控序列和編碼序列。相應地，嵌合基因或外源基因可以包括源自不同來源的調控序列和編碼序列，或源自相同來源的調控序列和編碼序列，但以不同於天然發現的方式排列。"內源基因"指的是在生物體基因組中天然位置的天然基因。"外來基因"指的是不是在宿主生物體中正常發現的基因，而是通過基因轉移引入宿主生物體的基因。外來基因可以包括插入非天然生物體的天然基因或嵌合基因。"轉基因"指的是已經通過轉化程序引入基因組的基因。"編碼序列"指的是編碼特定胺基酸序列的核苷酸序列。術語"胺基酸序列同源物"或"同一物"指的是具有相似胺基酸序列的蛋白質。技術人員將認識到關鍵的胺基酸序列在蛋白質的功能性結構域內。因此，對於同源蛋白質，在整個胺基酸序列的長度可以具有低於40%同源性，但是在一個功能性結構域中具有高於90%的同源性。在本文可以通過它們的公知的三字母符號或IUPAC-IUB生化術語委員會推薦的一字母符號來表示胺基酸。同樣，可以通過它們的普遍接受的單字母編碼來表示核苷酸。"保守修飾的變體"同時適用於胺基酸和核酸序列。對於特定的核酸序列，保守修飾的變體指的是編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸，或在核酸沒有編碼胺基酸序列的情況中，指的是基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全部編碼胺基酸丙氨酸。因此，在每個由密碼子表示丙氨酸的位置，密碼子可以改變成所述相應密碼子中的任一個而沒有改變所編碼的多肽。這樣的核酸變化是"沉默變化"，其保守修飾變化中的一種。本文編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每個可能的沉默變化。技術人員將認識到可以修飾核酸中的每個密碼子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)來產生功能上相同的分子。相應地，編碼多肽的核酸的每個沉默變化都隱含在每個所述的序列中。對於胺基酸序列，技術人員將認識到"保守修飾的變體"將來自編碼序列的改變，其導致胺基酸用化學相似的胺基酸的置換。提供功能相似胺基酸的保守置換表是本領域公知的。以下六組每組含有相互保守置換的胺基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(參見，例如，Creighton，Proteins(1984))。術語"非保守修飾的變化"指的是不涉及保守置換的胺基酸變化。例如，丙氨酸置換成苯丙氨酸將構成非保守修飾的變化。"調控序列"指的是位於編碼序列的上遊(5'-非編碼序列、其內或下遊(3'-非編碼序列)的核苷酸序列，並且其影響轉錄、RNA加工或穩定性或相關編碼序列的翻譯。調控序列可以包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列和影響剪接位點選擇的序列。"啟動子"指的是能夠控制編碼序列或功能RNA表達的核苷酸序列。通常，編碼序列位於啟動子序列的3'端。啟動子序列由前端和更遠端上遊要素組成，後一要素通常稱為增強子。相應地，"增強子"是可以刺激啟動子活性的核苷酸序列並可以是啟動子的固有要素或是插入的異種要素，來增強啟動子的水平或組織特異性。啟動子可以完全源自天然基因，或可以由源自自然發現的不同啟動子的不同要素構成，或甚至可以包括合成的核苷酸片段。本領域技術人員理解，不同啟動子可以指導不同組織或細胞類型中的基因表達，或處於不同發育階段的基因表達，或應答不同環境條件的基因表達。引起核酸片段在大多數細胞類型中在大多數時間表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。"翻譯前導序列"指的是位於基因的啟動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。翻譯前導序列存在於翻譯起始序列的完全加工的mRNA上遊中。翻譯前導序列可以影響初級轉錄產物到mRNA的加工、mRNA穩定性或翻譯效率。已經描述了翻譯前導序列的實例(TurnerandFoster(1995)Mol.Biotechnol.3:225-236)。"3，-非編碼序列"指的是位於編碼序列下遊的核苷酸序列並包括多腺苷酸化識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調控信號的其他序列。多腺苷酸化信號的特徵通常在於影響多腺苷酸鏈添加至mRNA前體的3'端。Ingelbrecht"a/.(1989)PlantCell1:671-680舉例說明了不同3，非-編碼序列的用途。"RNA轉錄產物"指的是從RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄獲得的產物。當RNA轉錄產物是DNA序列的完全互補拷貝時，其稱為初級轉錄產物，或其可以是源自初級轉錄產物轉錄後加工的RNA序列並稱為成熟RNA。"信使RNA(mRNA)"指的是沒有內含子並能被細胞翻譯成多肽的RNA。"cDNA"指的是與mRNA模板互補並源自mRNA模板的DNA。cDNA可以是單鏈的或轉化成雙鏈形式，使用，例如，DNA聚合酶I的Klenow片段。"正義RNA"指的是包括mRNA並因此能被細胞翻譯成多肽的RNA轉錄產物。"功能性RNA"指的是正義RNA、反義RNA、核酶RNA或其他未被翻譯但仍然對細胞過程具有影響的RNA。術語"可操作的連接"指的是單條多核苷酸上兩個或多個核酸片段的連接，使得一個的功能受到另一個的影響。例如，當其能夠影響該編碼序列的表達時，將啟動子可操作地連接編碼序列(即，該編碼序列在啟動子的轉錄控制下)。可以以正義或反義方向將編碼序列可操作地連接調控序列。如本文所用，術語"表達"指的是源自本發明核酸片段的正義(mRNA)的轉錄和穩定累積。表達也可以指mRNA翻譯成多肽。"蛋白質"或"多肽"是通過編碼多肽的多核苷酸中編碼序列決定的特定次序排列的胺基酸鏈。每個蛋白質或多肽均具有獨特的功能。"改變的水平"或"改變的表達"指的是轉基因生物體中基因產物產生的量和比例不同於正常或非轉化生物體的。當"成熟蛋白質"或術語"成熟"用於描述蛋白質時，指的是翻譯後加工的多肽；g卩，已經從其除去了初級翻譯產物中存在的前肽或前導肽的多肽。當"前體蛋白質"或術語"前體"用於描述蛋白質時，指的是mRNA翻譯的初級產物；即，仍然存在前肽和前導肽。前肽和前導肽可以是但不限於胞內定位信號。"轉化"指的是核酸片段轉移至宿主生物體的基因組中，導致遺傳上穩定的遺傳。含有轉化的核酸片段的宿主生物體稱為"轉基因"生物體。植物轉化方法的實例包括農桿菌介導的轉化(DeBlaere"W.(1987)Meth.Enzymol.143:277)、同源重組和加速的顆粒或"基因槍"轉化技術(Klein(1987)Nature(London)327:70-73;美國專利NO.4,945,050，引入本文作為參考)。因此，可以將本發明的分離的多核苷酸引入能引入宿主細胞中並在宿主細胞中複製的重組構建體，典型地，DNA構建體。這樣的構建體可以是包括複製系統和能夠在給定宿主細胞中轉錄和翻譯編碼多肽的序列的序列的載體。大量適用於穩定轉染植物細胞或建立轉基因植物的載體已經描述於，例如，Pouwelsa/.，CloningVectors:ALaboratoryManual，1985，supp.1987;WeissbachandWeissbach,MethodforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989;禾卩Flevina/.，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers,1990。典型地，植物表達載體包括，例如，一個或多個在5'和3'調控序列的轉錄控制下克隆的植物基因和顯性選擇標記。這樣的植物表達載體還可以含有啟動子調控片段(例如，控制誘導型或組成型、環境或發育調控的或細胞或組織特異性表達的調控片段)、轉錄啟動起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。"PCR"或"聚合酶鏈反應"作為用於特定DNA片段擴增的技術是本領域技術人員公知的(美國專利No.4,683,195和4,800,159)。術語"子代"指任何後代，包括種子和來自其的植物，其源自特定的親本植物或一組親本植物。"再生"是從植物細胞(例如，植物原生質體或外植體)生長成植物的過程。"選定的DNA"是已經引入宿主基因組中的DNA片段。優選的選定DNA將包括一種或多種外源基因和用於在宿主細胞中表達外源基因的要素，例如，啟動子和終止子。通過包括一個或多個增強子要素和選定的DNA將實現一些益處。"轉化的細胞"是已經通過將外源DNA分子引入該細胞中而改變其DNA的細胞。"轉基因植物"是轉化的植物細胞或原生質體的植物或源自其的任何後代的子代，其中植物DNA含有引入的最初沒有存在於相同株的天然非轉基因植物中的外源DNA分子。轉基因植物可以另外含有待轉化植物天然的序列，但是其中"外源"基因已經通過基因技術方法改變，以便改變最初或野生型基因產物的結構或基因表達的水平或模式。"載體"是能夠在宿主細胞中複製和/或可以與其可操作地連接另一個DNA片段以使得產生所連接片段複製的DNA分子。質粒是用於將新基因攜帶至細胞中的實例性載體或DNA分子。質粒是獨立的、穩定的、自我複製的DNA片段的實例性載體。如本文所用，術語"基因型"意思是單個細胞、細胞培養物、植物或動物的遺傳構成。如本文所用，術語"雜合子"意思是在至少一個基因座具有不同等位基因(給定基因的多個形式)的二倍體的或多倍體的單個細胞或植物或動物。如本文所用，術語"雜合的"意思是在特定的基因座存在不同等位基因(給定基因的多種形式)。如本文所用，術語"純合子"意思是在一個或多個基因座具有相同等位基因的單個細胞或植物。如本文所用，術語"純合的"意思是在同源染色體片段中的一個或多個基因座存在相同的等位基因。在整個說明書中，詞語"包括"和該詞語的變化，如"包括"和"包括"，意思是"包括但不限於"並且不是用來排除其他添加劑、成分、整體或步驟。"由……組成"意思是包括並限於短語"由……組成"後面的任何物質。因此，短語"由……組成"表示列出的要素是需要的或必須遵循的，並且沒有其他要素可能存在。"基本上由……組成"意思是包括短語後面所列的任何要素，並限於其他沒有影響或促進所列要素公開內容中指定的活性或作用的要素。因此，短語"基本上由……組成"表示所列的要素是需要的或必須遵循的，但沒有其他要素是任選的並且可以存在或不存在，這取決於它們是否影響所列要素的活性或作用。實驗操作規程在本發明最寬的一個方面中，提供了鑑定導致雜種優勢或雜種劣勢的因素的方法。如本文所用，術語"因素"指的是如本文定義的候選基因等位基因編碼的多個mRNA或蛋白質種類的存在，其直接或間接導致雜種優勢或雜種劣勢。所述因素可以是一個或多個mRNA或蛋白質種類直接存在的結果。可選地，所述因素可以是多個mRNA或蛋白質種類的間接結果。如別處所討論的，發明人認為，雜種優勢或雜種劣勢由一個或多個"雜交"mRNA或蛋白質種類的存在產生。可以使用標準技術鑑定這些雜交mRNA種類或雜交蛋白質種類。例如，可以使用技術如SSCP(單鏈構象多態性)或DHPLC(變性高效液相色譜)鑑定不同的mRNA種類。參見，例如，美國專利號5,795,976和6,453,224。可以通過等電聚焦鑑定多個蛋白質種類的存在。還可以克隆每個單個mRNA種類並使用標準測序來測序。還可以測序單個蛋白質。所有這些方法將使用標準技術。一旦鑑定出多個mRNA或蛋白質種類存在於動物或植物中，就可以鑑定引起雜交mRNA和/或雜交蛋白質的候選基因。術語"候選基因"，如之前所定義的，指的是具有產生雜種優勢或雜種劣勢潛能的核酸片段，如mRNA片段。如本文所用，術語"雜種優勢(hybridvigour)"或"混種盛勢(heterosis)"可交替使用，並且其意思是雜種優於純種的性能提高，最值得注意的性狀是如生長速率、生育力和抗病力。特別地，候選基因是那些基因，其在一個動物或植物中是雜合的和有功能的，並且其導致雜種優勢。在一個實施方案中，每個基因的等位基因將包括編碼序列的不同外顯子中的核苷酸序列變化，其中該變化導致胺基酸序列變化。例如，如果植物或動物包括基因X的兩個等位基因，即對於基因X是雜合的，其滿足作為本發明候選基因的第一個要求。第二個標準將是核苷酸序列中的序列變化，該變化導致任何表達蛋白中的胺基酸序列變化。第三個標準將是每個等位基因含有序列變化，其中沒有在每個等位基因中的相同位置發現該序列變化。例如，在以上的基因X中，每個等位基因可以含有序列變化，其中在等位基因1中，變化在位置1，而在等位基因2中，變化在位置20。如果該變化導致胺基酸序列的改變，這將符合第二個和第三個標準。第四個標準將是不同外顯子中出現的變化，而不僅是在相同外顯子內的不同位置。在一個實施方案中，所述候選基因將具有一個或多個核苷酸序列變化，其編碼胺基酸變化，其中在不同等位基因上的不同外顯子中發現該變化。候選基因將優選產生至少三個種類的mRNA:與一個等位基因相同的一種mRNA分子，與第二個等位基因的編碼序列相同的mRNA和包括來自兩個等位基因的外顯子組合的雜交mRNA分子。顯然地，根據外顯子的數目，不同雜交mRNA分子種類的數量將是無數的。鑑定候選基因的方法將是相對簡單的。可以通過候選基因PCR擴增片段的常規序列分析或Southern印跡分析(參見，例如Gieselmanne/a/.(1989，Proc.Natl.Acsd.Sci.U.S.A.86:9436-9440)。本領域技術人員還將認識到，可以使用本領域中的各種方法來進行同源和/或閉合管中的擴增檢測，例如，一旦進行了充足的擴增，就可在PCR反應和目標核酸特異性的螢光測量中使用TaqMan雜交探針。然而，由於RocheLightcyclei^的性質和速度，優選的方法是在RocheLightcyclei上使用實時PCR和熔解曲線分析並使用螢光標記的雜交寡核苷酸。儘管本領域技術人員將知道，存在其他相似的定量"實時"和同源核酸擴增/檢測系統，如那些基於TaqMan方法的(美國專利No.5,538,848和5,691,146)、螢光偏振分析(例如，Gibsone/a/.，ClinChem，1997;43:1336-1341)和Invader分析(例如，AgarwalP，DiagnMolPathol2000Sep;9(3):158-164;RyanDd"/.，MolDiagn1999Jun;4(2):135-144)。如果合適地設計，這樣的系統也將適用於所述的本發明，使能夠實時監控核酸擴增和等位基因的差別，以檢測基因突變和多態性。一旦鑑定出候選基因，然後可以將其分離或合成產生來用於本發明的其他方面中。例如，可以將懷疑產生雜種優勢的候選基因轉化至宿主細胞(植物或動物)和再生的轉基因植物或動物中。產生轉基因動物細胞的方法典型地包括步驟(1)裝配合適的用於將特定的DNA序列插入細胞的核染色體中的DNA構建體；(2)將所述DNA構建體轉染至細胞中；(3)使隨機插入和/或同源重組發生。由該過程產生的修飾可以是合適的DNA構建體插入目標基因組；從目標基因組刪除DNA;和/或目標基因組的突變。DNA構建體可以包括目標基因，例如，合成基因，其包括取自不同等位基因的外顯子，其中不同的外顯子包括不同的序列以及各種要素，包括調控啟動子、絕緣子、增強子和遏制子以及用於核糖體結合從DNA構建體轉錄的RNA的要素。這些實例是本領域普通技術人員公知的，並且不意味著是限制。由於可獲得有效的重組DNA技術，結合在資料庫和商業部門容易獲得的用於調控要素和基因的DNA序列，本領域普通技術人員可以使用本文所述的材料和方法容易地產生適於建立轉基因動物細胞的DNA構建體。例如，如果在單個cDNA、基因組DNA或其他DNA中沒有獲得用於候選基因的完整核苷酸編碼序列，例如，通過DNA測序或限制性核酸內切酶分析所測定的，那麼可以從幾個DNA收集合適的DNA片段(例如，限制性片段或PCR擴增產物)並相互共價連接來構建完整的編碼序列。共價連接DNA片段的優選方式是使用DNA連接酶的連接，如T4DNA連接酶。然後將分離的候選基因引入質粒或表達載體中。用於動物細胞的轉染技術是本領域普通技術人員公知的，並且用於進行將DNA構建體轉染至動物細胞中的材料和方法是可購得的。典型地用DNA構建體轉染動物細胞的材料是親脂性化合物，如LipofectinTM。可以促使特定的親脂性化合物形成脂質體，用於介導所述DNA構建體轉染至細胞中。通過所述DNA構建體的合理設計，可以將來自所述DNA構建體的目標序列插入核基因組的特定片段中。這些設計技術和方法是本領域普通技術人員公知的。參見，例如，美國專利5,633,067;美國專利5,612,205和PCT公開W093/22432，將所有文獻以其整體引入作為參考。一旦將所需的DNA序列插入核基因組中，就可以通過本領域技術人員公知的方法鑑定插入區域的位置以及所需DNA序列插入核染色體中的頻率。一旦將轉基因插入供體細胞的核基因組中，該細胞，和本發明的其他供體細胞一樣，可以用作核轉移方法中的核供體。將細胞的核轉移至卵母細胞中的方法優選地涉及細胞融合來形成重建的細胞。典型地通過施加橫跨接觸/融合平面的DC電脈衝來誘導融合，但附加的AC電流可以用來幫助供體和受體細胞的排列。電融合產生足以引起原生質膜短暫擊穿的電脈衝，該電脈衝足夠短，以使得膜快速地重新形成。因此，如果誘導兩個鄰接的膜擊穿並在重新形成時脂雙層混合，將在兩個細胞之間打開小的通道。由於這種小孔隙的熱不穩定性，它將擴大直至兩個細胞變成一個。參考Prather等的美國專利No.4,997,384(以其整體引入本文作為參考)，用於進一步討論該方法。可以使用各種電融合介質，包括例如，蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和磷酸鹽緩衝溶液。還可以使用仙臺病毒作為基因融合劑來實現融合(Graham，WisterInot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。還可以通過將細胞暴露於促融合化學物質如聚乙二醇來誘導融合。優選地，將供體動物細胞和卵母細胞置於500um融合室中並覆蓋4ml26。C-27"C的融合介質(0.3M甘露醇、O.lmMMgS04、0.05mMCaCl2)。然後通過施加70-100V的雙直流(DC)電脈衝約15us使細胞電融合，大約ls間隔。融合後，然後將所得到的融合重建細胞置於合適的介質中直至激活，例如，TCM-199介質。在優選的細胞融合方法中，首先將供體動物細胞連接去核的卵母細胞。例如，選擇化合物來連接所述動物細胞和去核的卵母細胞，使動物細胞和去核的卵母細胞膜融合。所述化合物可以是任何能夠粘著細胞的化合物。所述化合物可以是能夠結合或粘著碳水化合物的蛋白質或糖蛋白。更優選地，所述化合物是凝集素。所述凝集素可以選自包括刀豆素A、刀豆抗菌素A、蓖麻素、大豆凝集素、蓮子凝集素和植物凝集素(PHA)的組。優選化合物是PHA。在一個優選的實施方案中，上述的電融合方法還包括再一融合步驟，或上述的融合步驟包括一個供體動物細胞和兩個或多個去核的卵母細胞。雙融合方法具有提高重建細胞的細胞質體積的有利效果。通常在有核供體和受體卵母細胞融合之前、之中和/或之後，通過電和/或非電方式激活重建的動物細胞(參見，例如，Susko-Parrish等，美國專利No.5,496,720)。激活方法包括1)電脈衝；2)化學誘導的休克；3)精子穿透；4)通過將二價陽離子引入卵母細胞細胞質中提高卵母細胞中二價陽離子的水平，例如，鎂、鍶、鋇或鈣，例如，以離子載體形式。提高二價陽離子水平的其它方法包括使用電休克、用乙醇處理和用籠蔽螯合齊lj(cagedchelators)處理；禾口5).通過已知的方法降低卵母細胞中細胞蛋白質的磷酸化，例如，通過加入激酶抑制劑，例如，絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基-氨基-嘌呤、十字孢鹼、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。或者，可以通過將磷酸酶，例如磷酸酶2A和磷酸酶2B引入卵母細胞中抑制細胞蛋白質的磷酸化。通常通過在本領域普通技術人員公知的培養基中培養激活的重建動物細胞或胚胎，培養基包括但不限於加10%FSC、Tyrodes-白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)的TCM陽199、加腦FCS的Ham，sF-10、合成的輸卵管液體("SOF")、B2、CRlaa培養基和高鉀簡單培養基("KSOM")。還可以通過已知的方法激活重建的細胞。這樣的方法包括，例如，在亞生理溫度下培養重建的細胞，實質上是通過給重建的細胞施加冷的或實際上涼爽的溫度衝擊。最常見的是通過在室溫培養重建的細胞來進行這個操作，室溫相對於通常胚胎暴露的生理溫度條件是冷的。合適的卵母細胞激活方法是Susko-Parrish等的美國專利No.5,496,720的主題，在此以其整體引入作為參考。然後可以在合適的體外培養基中培養激活的重建動物細胞直至細胞和細胞集落的產生。適於動物胚胎的培養和成熟的培養基是本領域公知的。可以用於牛胚胎培養和維持的已知培養基實例包括加10%FCS的Ham，sF-10、加10%FCS的TCM-199、Tyrodes隱白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)、Dulbecco，s磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、Eagle，s和Whitten's培養基。最常用於卵母細胞收集和成熟的培養基之一是TCM-199和1至20%血清補充劑，包括胎牛血清、新生牛血清、發情奶牛血清、羊血清或食用牛血清。優選的維持培養基包括含有Earl鹽、10%FSC、0.2mM丙酮酸鈉和50ug/ml硫酸慶大黴素的TCM-199。上述任一種還可以涉及與各種細胞類型的共培養，如顆粒細胞、輸卵管細胞、BRL細胞、子宮細胞和STO細胞。此後，優選洗滌培養的重建動物細胞或胚胎，然後置於孔平板中所含的合適培養基中，例如，含有10%FCS的TCM-199培養基，孔平板優選含有合適的匯合滋養層。合適的滋養層包括，例如，成纖維細胞和上皮細胞，例如，源自有蹄動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞、雞成纖維細胞、鼠(例如，小鼠或大鼠)成纖維細胞、STO和SI-m220滋養細胞系和BRL細胞。在一個實施方案中，滋養細胞包括小鼠胚胎成纖維細胞。合適的成纖維細胞滋養層的製備是本領域公知的。在滋養層上培養重建的動物細胞直至重建的細胞達到適於轉移至受體雌性或獲得用於產生細胞或細胞集落的細胞的大小。優選地，培養這些重建的細胞直至至少約2至400個細胞，更優選地約4至128個細胞，最優選地至少約50個細胞。在合適的條件下實現培養，艮P，約39。C和5。/。C02，並為了最佳化生長改換培養基，通常約每2-5天，優選約每3天。用於本發明中胚胎轉移和受體動物操縱的方法是胚胎轉移工業中所用的標準方法。同步轉移對於本發明的成功是重要的，即，核轉移胚胎的階段與雌性受體的發情周期同步。Siedd，G.E.,Jr.("Criticalreviewofembryotransferprocedureswithcattle"inFertilizationandEmbryonicdevelopmentinVitro(1981)L.Mastroianni,Jr.禾口J.D.Biggers編輯，PleumPress，紐約市，紐約州，323頁)中綜述了該方法的優點和怎樣維持受體，在此將其內容引入作為參考。簡而言之，可以通過非外科手術或外科手術將胚泡轉移至同步受體的子宮中。也可以通過使用本領域普通技術人員公知的技術和培養基使用其它培養基。在一種方法中，用新鮮的KSOM將克隆的胚胎洗滌三次並在含有0.1%BSA的KSOM中培養4天，隨後用含有1%BSA的KSOM培養另外3天，在5%(302、5。/。02和90。/。N239。C條件下。通過本領域已知的標準方法檢測和分級胚胎發育。在第2天記錄分裂速率，並將分裂的胚胎再培養7天。在第七天，記錄胚泡發育，並通過非外科手術將待定的可能發育成胚胎和/或動物的一個或兩個胚胎轉移至每個同步代孕母體的子宮內。優選通過直腸觸診或定期的超聲波檢査來檢查代孕母體的懷孕狀態，例如在妊娠40、60、90和120天。優選在整個妊娠期進行仔細的觀察和連續超聲波監控(每月)，以評估妊娠各階段的胚胎損失。應收集任何流產胎兒，如果可能，用於DNA定型來證實克隆狀態以及常規病理檢查。本發明的實施方案也要求在這種方法的各步驟期間產生的重建動物細胞、激活的重建動物細胞、胎兒和動物，以及從它們中收穫的細胞、細胞核以及其它細胞組分。特別優選的是產生的足月動物是能存活的動物。也可以用本發明來產生例如在細胞、組織和器官移植中使用的胚胎、胎兒或子代。通過從動物中取出胎兒或成年細胞並在克隆方法中使用這種細胞，當多種細胞、組織和可能的器官通過器官發生發育時，從克隆的胎兒中可以獲得多種細胞、組織和可能的器官。也可以從克隆的子代分離細胞、組織和器官。這一過程可以為包括細胞和基因治療的許多醫學和獸醫治療提供"原料"來源。如果所述細胞被轉移回到獲取該細胞的動物中，就可以避免免疫排斥。而且，因為可以從這些克隆中分離許多細胞類型，因此也可以利用其它的方法，例如造血細胞嵌合來避免同種動物之間和不同物種之間的免疫排斥。在一個實施方案中，候選基因將是能夠產生上文所述的雜種優勢的植物基因。傳統上，一般通過將一個良種近交植物與一個或多個其它遺傳上不同且多樣的近交植物雜交時出現的隨機事件來製備雜種植物。所述雜交由從一個近交優良植株取花粉和將花粉轉移至另一個良種近交植物組成。從兩個近交植物雜交獲得的種子是第一代雜種，稱作Fp與任何一個親代相比而言，商業上有價值的近交系F1具有較好的產量、穩定性以及其他重要特性的改進。在本發明中，一旦鑑定出候選基因，將其分離或合成並亞克隆至表達載體中或直接轉化至受體植物中。存在用於將DNA片段轉化至細胞中的許多方法，但不是全部適用於將DNA傳送至植物細胞中。認為適用於本發明的方法實際上包括任何方法，只要通過其可以將DNA引入細胞中，如通過DNA的直接傳送，如通過PEG介導的原生質體轉化(Omimlleh等，1993)，使用meganuclease-輔助的基因轉移(參見http:〃www.cellectis.com)，如使用meganucleasel-Scel，脫水/抑審lj(desiccation/inhibition)介導的DNA攝取(Potrykus等，1985)，電穿孔(美國專利No.5,384,253，在此特地以其整體引入作為參考)，碳化矽纖維攪動(Ka印pler等，1990;美國專利No.5,302,523，在此特地以其整體引入作為參考，和美國專利No.5,464,765，在此特地以其整體引入作為參考)，農桿菌介導的轉化(美國專利No.5,591,616和美國專利NO.5,563,055;在此特地以其整體引入作為參考)和DNA包被的顆粒的加速作用(美國專利NO.5,550,318;美國專利NO.5,538,877;和美國專利NO.5,538,880;在此特地將每篇引入作為參考)，等。通過應用這樣的技術，可以穩定地轉化植物細胞，並且這些細胞發育成轉基因植物。在特定的實施方案中，優選加速作用方法並包括，例如，微粒轟擊等。希望通過電穿孔引入候選基因DNA時，考慮到Krzyzek等的方法(美國專利NO.5,384,253)將特別有利。在該方法中，使用特定的細胞壁降解酶，如果膠降解酶，來使目標受體細胞比未處理的細胞更易於通過電穿孔來轉化。或者，使受體細胞更易於通過機械創傷來轉化。為了實現通過電穿孔的轉化，可以使用脆弱的組織，如細胞或胚胎發生的愈傷組織的懸浮培養物，或者可以直接轉化不成熟的胚胎或其他形式組織的組織。在該技術中，通過暴露細胞於果膠降解酶(果膠溶解酶)或以受控方式暴露於機械創傷，將所選細胞的細胞壁部分降解。通過完整細胞的電穿孔轉化的一些物種實例包括玉米(美國專利NO.5,384,253;D，Halluin等，1992;Rhodes等，1995)、小麥(Zhou等，1993)、番茄(Hou和Lin，1996)、大豆(Christou等，1987)和菸草(Lee等，1989)。還可以使用原生質體進行植物的電穿孔轉化(Bates，1994;Lazzeri，1995)。例如，Dhir和Widholm在國際專利申請公開No.WO9217598(在此特意引入作為參考)中描述了通過子葉產生的原生質體的電穿孔產生轉基因大豆植物。已經描述的原生質體轉化的其他物種實例包括大麥(Lazerri，1995)、高粱(Battraw等，1991)、玉米(Bhattacharjee等，1997)、小麥(He等，1994)、番茄(Tsukada等，1989)和大豆(Dhir等，1992)。根據本發明，用於傳送轉化候選基因DNA片段至植物細胞的優選方法是微粒轟擊(美國專利NO.5,550,318;美國專利NO.5,538,880;美國專利NO.5,610,042;和PCT申請WO94/09699;在此特意將每篇以其整體引入作為參考)。在該方法中，可以將顆粒用核酸包覆並通過推進力傳送至細胞中。示例顆粒包括由鎢、鉑和優選地由金構成的顆粒。考慮到在一些情況中，候選基因DNA沉澱至金屬顆粒上對於使用微粒轟擊的DNA傳送至受體細胞中將不是必需的。然而，考慮到顆粒可以含有DNA而不是包覆DNA。因此，提出DNA包覆的顆粒可以提高通過顆粒轟擊的DNA傳送水平，但是在其中或其本身不是必需的。通過加速作用將DNA傳送至植物細胞中的方法的說明性實例是Biolistics顆粒傳送系統，其可以用於推動包覆DNA的顆粒或細胞通過篩網，如不鏽鋼或Nytex篩網，至覆蓋培養在懸浮液中的植物細胞的濾器表面上。篩網分散所述顆粒，使得其不會以大的聚集物傳送至受體細胞。據認為，在拋射裝置和待轟擊細胞之間的篩網幹預降低了拋射體聚集物的大小並可能通過降低由太大的拋射體對受體細胞造成的損害而有助於較高的轉化頻率。微粒轟擊技術廣泛適用，並實質上可以用來轉化任何植物物種。已經通過微粒轟擊轉化的物種實例包括單子葉物種，如玉米(PCT申請WO95/06128)、大麥(Ritala等，1994;Hensgens等，1993)、小麥(美國專利NO.5，563，055，在此特意以其整體引入作為參考)、水稻(Hensgens等，1993)、燕麥(Torbet等，1995;Torbet等，1998)、黑麥(Hensgens等，1993)、甘蔗(Bower等，1992)和高粱(Casa等，1993;Hagio等，1991);以及多種雙子葉植物，包括菸草(Tomes等，1990;Buising和Benbow，1994)、大豆(美國專利NO.5322783，在此特意以其整體引入作為參考)、向日葵(Knittel等，1994)、花生(Singsit等，1997)、棉花(McCabe和Martinell，1993)、番茄(VanEck等，1995)和一般的豆科植物(美國專利NO.5,563,055，在此特意以其整體引入作為參考)。為了轟擊，將懸浮液中的細胞在濾器或固體培養基上濃縮。或者，可以將未成熟的胚胎或其他目標細胞排列在固體培養基上。將待轟擊的細胞置於低於大拋射體停止板以下的適當距離處。如果需要，可以在加速裝置和待轟擊細胞之間放置一個或多個篩網。農桿菌介導的轉移是用於將基因引入植物細胞中的廣泛應用的系統，因為可以將DNA引入整個植物組織中，因此繞過了從原生質體再生完整植物的需要。使用農桿菌介導的植物整合載體將DNA引入植物細胞中是本領域公知的。參見，例如，Fmley等(1985)、Rogers等(1987)和美國專利NO.5,563,055中所述的方法，在此特意以其整體引入作為參考。農桿菌介導的轉化在雙子葉植物中是最有效的，並且是單子葉植物轉化的優選方法，包括擬南芥、菸草、番茄和馬鈴薯。實際上，儘管農桿菌介導的轉化已經常規用於雙子葉植物中很多年，其只是最近才適用於單子葉植物。農桿菌介導的轉化技術的發展現在已經使得該技術幾乎適用於所有單子葉植物。例如，農桿菌介導的轉化技術現在已經用於水稻(Hiei等，1997;Zhang等，1997;美國專利NO.5，591,616，在此特意以其整體引入作為參考)、小麥(McCormac等，1998)、大麥(Tingay等，1997;McCo謹c等，1998)和玉米(Ishidia等，1996)。現代的農桿菌轉化載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌中複製，這允許了如所述的方便的操作(Klee等，1985)。此外，用於農桿菌介導的基因轉移的載體的最新技術發展已經提高了載體中的基因和限制性位點排列，來促進能夠表達各種多肽編碼基因的載體的構建。所述的載體(Rogers等，1987)具有方便的多接頭區域，兩側為啟動子和多腺苷酸化位點，用於插入的多肽編碼基因的直接表達並適用於本發明目的。此外，含有分支和非分支Ti基因的農桿菌可以用於轉化。在農桿菌介導的轉化有效的那些植物株系中，由於容易的和明確的基因轉移特性，這是優選的方法。使用基於磷酸鈣沉澱、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法可以實現植物原生質體的轉化(參見，例如，Potrykus等，1985;Lorz等，1985;Omirulleh等，1993;Fromm等，1986;Uchimiya等，1986;Callis等，1987;Marcotte等，1988)。這些系統於不同的植株的應用依賴於從原生質體再生該特定植株的能力。已經描述了從原生質體再生穀類的說明性方法(Fujimara等，1985;Toriyama等，1986;Yamada等，1986;Abdullah等，1986;Omimlleh等，1993和美國專利NO.5,508，184;在此特意將每篇以其整體引入作為參考)。使用穀類原生質體直接吸收轉化的實例包括水稻(Ghosh-Biswas等，1994)、高粱(Battraw和Hall，1991)、大麥(Lazerri，1995)、燕麥(Zheng和Edwards,1990)和玉米(Omirulleh等，1993)的轉化。為了轉化不能從原生質體成功再生的植株，可以使用將DNA引入完整細胞或組織的其他方式。例如，如所述的，可以實現從未成熟胚胎或外植體再生穀類(Vasil，1989)。此外，可以使用有或沒有原生質體化的碳化矽纖維介導的轉化(Kaeppler，1990;Kaeppler等，1992;美國專利No.5,563,055，在此特意以其整體引入作為參考)。通過一起攪動DNA溶液中的碳化矽纖維和細胞來實現使用該技術的轉化。隨著細胞被刺穿，DNA被動進入。該技術已經成功用於，例如，單子葉穀類玉米(PCT申請WO95/06128，在此特意以其整體引入作為參考；Thompson,1995)和水稻(Nagatani，1997)。微粒轟擊的最佳化根據本發明，為了微粒轟擊轉化，可以最佳化物理和生物參數。物理因素是那些涉及操縱DNA/微粒沉澱的或影響大拋射體或微粒的飛行和速度的因素。生物因素包括涉及轟擊之前和就在轟擊之後的細胞操作的所有步驟，如目標細胞的滲透壓調節來幫助緩解與轟擊相關的損傷、未成熟胚胎或其他目標組織相對於粒子軌道的方向以及轉化DNA的性質，如線性化的DNA或完整的超螺旋質粒。據認為，轟擊前操作對未成熟胚胎的成功轉化尤為重要。相應地，考慮到人們可能希望在小規模研究中調節各種轟擊參數來全面最佳化條件。人們可能特別希望調節物理參數如DNA濃度、間隙距離、飛行距離、組織距離和氦壓力。更進一步考慮到氦的等級可能影響轉化效率。例如，可以證明利用工業純(99.99%純)或超高純的氦(99.999%純)進行的轟擊之間存在轉化效率的差異，儘管現在還不清楚在轟擊中使用哪一種氦更有利。通過改變影響受體細胞生理狀態並可能因此影響轉化和整合效率的條件，也可以優化損傷減縮係數(TRF)。例如，為了實現最優轉化可以調整受體細胞的滲透性狀態、組織水合以及繼代培養階段或細胞周期。為了更進一步地優選轟擊轉化，可以尋找進行轟擊的物理和生物參數。物理因素是那些涉及操縱DNA/微粒沉澱物或那些影響大微粒或小微粒的飛行和速度的因素。生物因素包括涉及就在轟擊前後操縱細胞的所有步驟。己經調整轟擊前的培養條件，例如滲透環境、轟擊參數和質粒構型，來產生最大數目的穩定轉化體。(i)物理參數K間隙距離可以調節可變的嵌套(大的支持物)以改變可裂圓片和微粒之間的距離，即間隙距離。該距離可以為0cm至2cm。較短的間隙的預計影響是大微粒和小微粒的速度都增加/衝擊波增加(導致組織飛濺和增加的組織損傷)和微粒穿透加深。較長的間隙距離將具有相反的影響，但可以增加成活力，並因此能增加回收的穩定轉化體的總數。2、飛行距離通過放置間隔圈調整微粒穿過的飛行路徑，可以以預先設定的0.5cm增量使固定的嵌套(包含在可變嵌套內部)在0.5和2.25cm之間變化。短的飛行路徑允許飛行微粒具有更大的穩定性，但會降低微粒的總速度。飛行的增加的穩定性增加了，例如，位於中心的GUS聚焦點的數目。更大的飛行距離(高達一些點)增加速度但也會增加飛行的不穩定性。根據觀測結果，推薦用大約l.Ocm至1.5cm的飛行路徑長度來典型地完成轟擊。3、組織距離組織在電子槍室內的放置對微粒穿透具有明顯的影響。增加微粒的飛行路徑將降低與衝擊波有關的速度和損傷。速度的下降也將導致微粒穿透較淺。4、氦壓通過操縱可裂圓片的類型和數量，可以使氣體加速管內的壓力在400和2000psi之間變動。已經確定的穩定轉化的最適壓力在1000和1200psi之間。5、微粒的包覆為了進行微粒轟擊，可以將DNA附著(即"包覆")在微粒上，使DNA能夠以適於其轉化的形式傳送至受體細胞。在這方面中，為了發生轉化，至少一些轉化DNA必須是耙細胞可以獲得的，然而同時在傳遞的過程中DNA必須附於微粒上。因此，來源於所述微粒的轉化DNA的可用性可能包括所述微粒傳遞至靶細胞之後，轉化DNA和微粒之間的連接的物理逆轉。然而，不必如此，因為粑細胞的可用性可能是DNA的非結合片段或包含附著到微粒上的物理附著物的其他分子斷裂的結果。可用性可以更進一步是轉化DNA和其他分子之間的連接斷裂的結果，其中其他分子直接或間接附著於微粒上。更進一歩考慮到可以通過轉化DNA和受體細胞的基因組DNA之間的直接重組來進行靶細胞的轉化。因此，如本文所用，"包覆的"微粒將是能夠用於轉化靶細胞的微粒，因為轉化DNA將傳遞至靶細胞，然而將是能接近靶細胞的，因此發生轉化。可以使用允許將轉化DNA傳遞至耙細胞的任何包覆微粒的技術。本文具體公開了已經證明能很好地用於本發明的包覆微粒的方法。但是，可以利用其他可選擇的方法將DNA連接到微粒上。例如，可以用抗生蛋白鏈菌素和末端用長鏈硫醇可切割生物素化的核苷酸鏈標記的DNA包覆微粒。通過抗生蛋白鏈菌素-生物素相互作用將DNA附著於微粒上，但是通過存在於細胞中的還原劑還原硫鍵，將DNA在細胞中釋放。或者，可以通過功能化氧化金顆粒的表面以提供游離胺基來製備顆粒。具有強負電荷的DNA結合到功能性顆粒上。而且，以可控制的排列可以將帶電粒子沉積在PDS-1000Biolistics裝置使用的聚酯薄膜飛行器圓盤的表面上，因此促進傳遞至耙組織的微粒的可控分布。如上所述，更進一步提出，用來包覆微粒的DNA的濃度可以影響包含單個轉基因拷貝的轉化體的回收率。例如，較低的DNA濃度並不必然改變轉化的效率，但可能增加單拷貝插入事件的比例。在這一點上，每1.8mg起始微粒可以使用大約lng到2000ng的轉化DNA。在本發明的其他實施例中，每1.8mg起始微粒可以使用大約2.5ng到lOOOng、2.5ng到750ng、2.5ng到500ng、2.5ng到250ng、2.5ng至l」lOOng或者2.5ng到50ng的轉化DNA。也可以使用各種其他方法增加轉化效率和/或增加低拷貝轉化事件的相對比例。例如，本發明人考慮用鹼性磷酸酶或在轉化之前將使DNA末端鈍化的試劑末端修飾轉化DNA。更進一步地，轉化DNA可以包括惰性載體DNA，因此在不降低使用的DNA總量的情況下，可降低有效的轉化DNA的濃度。在1997年12月22日申請的美國專利申請系列No.08/995,451中進一步描述了這些方法，在此特意以其公開內容的整體引入作為參考。(ii)生物參數培養條件和其他因素可以影響靶細胞的生理狀態，而且對轉化和整合效率可能也具有深刻的影響。首先，轟擊作用可以刺激產生能導致組織衰老的乙烯。添加抗乙烯化合物能增加轉化效率。其次，提出細胞周期中的某些點可能更適於導入的DNA的整合。因此，細胞培養物的同歩化可以增強產生轉化體的頻率。例如，利用冷處理、胺基酸飢餓或其他細胞周期延滯劑可以實現同步化。第三，組織水合程度也可以促進與轟擊有關的損傷的量以及微粒穿透細胞壁的能力。胚胎或其他耙組織相對於粒子軌道的定位與定向也可能很重要。例如，PDS-1000biolistics裝置在耙石皿(targetpetridish)的表面上方不產生均一的微粒散布。在平皿中心的粒子速度比離石皿中心更遠距離處的粒子速度高。因此，使靶組織位於石皿上以避開被一些人稱為"死亡區"的石皿中心是有利的。而且，與靶軌道有關的靶組織的定向也可能很重要。已經想到使最可能再生植物的組織朝著粒子流定向是合乎需要的。例如，未成熟胚胎的盾片包含胚胎發生潛力最大的細胞，因此它應該朝著粒子流定向。也已經報導說輕微質壁分離的酵母細胞使轉化效率增加(Armaleo等，1990)。假設改變的所述細胞滲透狀態有助於降低與微粒穿透有關的損傷。另外，生長和細胞周期階段對轉化可能很重要。1、滲透壓調節已經提出，滲透性預處理可以作為降低質壁分離細胞的膨脹壓的結果潛在地降低轟擊相關的損傷。在以前的研究中，在新鮮培養基和滲透性調整培養基中進行傳代培養後，短暫表達GUS的細胞數目增加了(PCT申請WO95/06128，在此特意引入其全文作為參考)。90分鐘的預處理時間比更短的時間顯示出更高數量的表達GUS的聚焦區。在500mOSM/kg的培養基中孵育卯分鐘的細胞的短暫GUS聚焦區與對照相比顯示出大約3.5倍的增加。優選地，在轟擊之前，在包含12%蔗糖的培養基上預培養未成熟胚胎4-5小時。轟擊後，在12%的蔗糖上完成16-24小時的第二次培養。或者，在轟擊之前，在0.2M甘露醇上預處理II型細胞3-4小時。考慮到用其他的滲透性活性溶質預處理細胞1-6小時的時間也可能是合乎需要的。2、質粒構型在有些情況下，將候選基因DNA傳遞至那些不包含在細菌宿主如大腸桿菌中維持質粒載體所必需的DNA序列，例如，抗生素抗性基因，包括但不限於氨苄青黴素、卡那青黴素和四環素抗性基因，以及原核生物的DNA複製起點的細胞中可能是合乎需要的。在這種情況下，可以在轉化之前純化包含所述轉化DNA的DNA片段。示例性的純化方法是在1.2%的低熔化溫度瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳，然後通過在6-10倍過量的Tris-EDTA緩衝液(10mMTris-HClpH8.0，lmMEDTA，70°C-72°C)中融化凝膠條而從瓊脂糖凝膠進行回收；冷凍並融化(37°C);通過離心將瓊脂糖沉澱。然後可以用QiagenQ-100柱純化DNA。為了有效回收DNA，柱的流速可以調節為40ml/hr。可以使用各種電洗脫技術、瓊脂糖的酶消化或將DNA結合到玻璃珠(例如GeneClean)上從瓊脂糖凝膠中回收分離的DNA片段。另夕卜，可以用HPLC和/或磁顆粒的使用來分離DNA片段。作為DNA片段分離的替代方法，可以用限制性內切酶消化質粒載體，然後不進行表達盒片段的預先純化而將該DNA傳遞給玉米細胞。組織培養需要培養基和可控的環境。"培養基"指用來在體外，即在完整活體生物外生長細胞的無數營養素的混合物。培養基通常是大多數細胞類型生長所需要的各類成分(鹽、胺基酸、生長調節劑、糖、緩衝液)的懸浮液。但是，每個具體的細胞類型為了生長需要特定範圍內的成分比例，並且為了最佳生長需要更特定範圍內的配方。用允許該細胞類型生長的培養基陣列啟動的培養基中，細胞生長的速度也會改變。可以以液體形式製備營養培養基，但是將液體添加至能夠提供固相支持的原料裡可以使其凝固。為了這一目的，最普遍使用的是瓊脂。Bactoagar、Hazelton瓊脂、Gelrite和Gelgro是適於組織培養中植物細胞生長的特定種類的固體支持。一些細胞類型將在液體懸浮液或者固體培養基上生長和分裂。如本文公開的，玉米細胞將在懸浮液或者固體培養基上生長，但是從懸浮液培養物再生植物需要在發育的某些點從液體培養基轉移到固體培養基上。在培養物中細胞分化的類型和程度將不僅受使用的培養基的種類和環境，例如pH的影響，而且也受培養基是固體還是液體的影響。目標受體細胞包括但不限於分生組織細胞，包括苗端(美國專利NO.5,736,369)、I類、II類和III類愈傷組織、未成熟胚胎和配子細胞，例如小孢子、花粉、精子和卵細胞。考慮到，用可以再生可增殖植物的任何細胞作為受體細胞是有用的。可以從包括但不限於未成熟胚胎、苗頂端分生組織、小孢子等的組織來源來啟動I類、n類和m類愈傷組織。能夠如愈傷組織一樣增殖的細胞也是用於遺傳轉化的受體細胞。本發明提供了轉化未成熟胚胎和隨後再生可增殖轉基因植物的方法。未成熟細胞的轉化排除了受體細胞培養物長期發育的需要。花粉及其前體細胞，小孢子可能能作為遺傳轉化的受體細胞或受精過程中攜帶外來DNA進行整合的載體。直接的花粉轉化將排除細胞培養的必要。分生組織細胞(即，能夠進行持續不斷的細胞分裂，並以未分化的細胞學形態為特徵的植物細胞，通常在植物的生長點或組織，例如根尖、莖尖、側芽等中發現)可以代表另一類植物受體細胞。因為分生細胞具有未分化生長、器官分化能力和全能性，因此可以將單個轉化的分生細胞作為整體轉化的植物來回收。實際上，具指出，胚胎產生懸浮培養物可能是受培養基環境控制的體外分生細胞系統，保留了以未分化狀態繼續進行細胞分裂的能力。可以作為轉化目的DNA片段的受體細胞的培養的植物細胞可以是任何植物細胞，包括玉米細胞，更具體地，來自玉米L的細胞。體細胞具有多種類型。胚胎發生細胞是通過胚胎形成可以誘導再生植物的體細胞實例。非胚胎發生細胞是那些通常不會以這種方式應答的細胞。非胚胎發生細胞的實例是某些黑色墨西哥甜(BMS)玉米細胞。在美國專利NO.5,134,074和美國專利NO.5,489,520中描述了在本發明的內容中有用的胚胎發生愈傷組織和懸浮培養物的發育，如作為用於轉化的受體細胞，在此將上述每篇文獻全文引入作為參考。可以使用特定的技術在細胞群內富集受體細胞。例如，II型愈傷組織發育，接著人工選擇和脆弱的胚胎發生組織的培養通常產生用於微粒轉化中的受體細胞富集。懸浮培養，尤其是使用本文公開的培養基進行的培養可以改進任何給定群體中受體細胞與非受體細胞的比率。可以用來選擇受體細胞的人工選擇方法包括，例如，評價細胞形態和分化，或者可以利用各種物理或生物學選擇方法。深低溫保藏也是選擇受體細胞的可能方法。受體細胞的人工選擇，例如，通過從II型愈傷組織的表面選擇胚胎發生細胞，是可用於在培養之前(不論在固體培養基上還是懸浮液中培養)嘗試富集受體細胞的一種方法。優選的細胞可以是那些位於細胞簇表面的細胞，而且通過其缺少分化、其大小和稠密細胞質可以進一步識別這些細胞。優選的細胞將通常是那些較少分化的，或者尚未分化的細胞。因此，可能希望鑑定和選擇那些細胞質稠密、有高的核質比的相對未空泡化(例如，通過細胞學觀察確定的)、尺寸小(例如，10-20um)、能夠持續分裂和形成軀體原胚的細胞。有人提出，也可以使用鑑定這樣的細胞的其他方法。例如，通過使用被具有相對不可滲透膜的細胞如胚胎發生細胞排斥並被相對分化的細胞如根樣細胞和蛇細胞(因為外觀像蛇而得名)吸收的染料，如Evan，s藍o鑑定受體細胞的其他可能的方法包括利用胚胎發生細胞的同功酶標記，例如，通過細胞化學染色可以檢測的穀氨酸脫氫酶(Fransz等，1989)。但是，應注意利用包括穀氨酸脫氫酶的同功酶標記可以由於非胚胎發生細胞，例如仍具有相對高代謝活性的根樣細胞而導致一定程度的假陽性。在一個實施方案中，源自候選基因的雜交mRNA分子，或源自雜交mRNA分子的雜交蛋白質，不產生雜種優勢，而是將克服、治療或至少緩解疾病的症狀。本領域技術人員將認識到上述實驗方案概要可以用來產生這個結果。通常，本文所用的術語"治療中"、"治療"等的意思是影響個體或患者及其組織或細胞，來獲得所需的藥理學和/或生理效果。效果可能是完全或部分預防疾病或其信號或症狀形式的預防，和/或可能是部分或完全治癒疾病形式的治療。本文所用的"治療中"涵蓋了植物或動物中疾病的任何治療或預防，並包括(a)預防可能易患該疾病但還沒有診斷為患該病的植物或動物中產生該疾病；(b)抑制該疾病，即，阻止其發展；或(c)減輕或緩解該疾病的症狀，S卩，使該疾病的症狀衰退；或(d)提高動物或植物的良好狀態、健康或壽命。一旦診斷出植物或動物患有疾病和鑑定出候選基因或基因的組合，然後可以將這些基因或基因產物給予植物或動物，通過使用上述關於雜種優勢的技術或使用標準醫療或農業技術。術語"給予"、"給予中"和"已給予"在此可交替使用。例如，可以以含有常規無毒藥物學上可接受載體、佐劑和賦形劑的劑量單位配方通過口服，包括舌下、局部或非腸道途徑給予候選基因產物。如本文所用，術語非腸道途徑，包括皮下注射、氣溶膠、靜脈內、肌內、鞘內、顱內注射或輸液技術或通過直腸或陰道給予。在本發明的另一個方面中，可以分離雜交蛋白並進一步研究來測定它們是否對HV或HD具有影響。例如，通過將雜交蛋白的胺基酸序列接受一系列蛋白水解和物理化學分析來測定雜交蛋白免疫原性的改變。已經編譯了許多不同的分析和計算機化的程序。ePitopesInformatics提供了一套可以用於比較雜交蛋白和每個親本野生型的免疫原性的程序實例。為了參考，參見http:〃www.epitope-information/References.htm#ModernAb。儘管不是排他的，使用以下研究程序來測定物理化學特性i/蛋白抗原性預測算法。ii/蛋白疏水性算法。m/蛋白親水性算法。iv/蛋白可塑性預測算法。w蛋白二級結構算法。這些蛋白質物理化學特性的價值是本領域任何技術人員公知的。通過使用一系列可免費獲得的分析程序探尋它們的胺基酸序列來在體外測定雜交蛋白和野生型蛋白之間的結構和功能差異。使用各種蛋白水解分析軟體中的任何一種來評價雜交蛋白相比於野生型蛋白的可能結構或功能特徵，這些軟體包括那些通過NCBI資料庫、EMBOSS資料庫可獲得的或那些通過Weizmann科學研究院的GeneCards網址http:〃bioinfo.weizmann.ac.il/cards/index.stml可獲得的。現在將只通過參照以下的非限制性實施例來進一步描述本發明。然而，應該理解，以下的實施例只是說明性的，並且不應當以任何方式作為上述本發明的通用性的限制。特別地，儘管上面已經使用DWMr2等位基因詳細描述了本發明關於鑑定候選基因的內容，但人們將清楚地理解，本文的發現不限於該基因或等位基因。實施例1在雜合子代中形成雜交mRNA分子的新生化途徑的鑑定已經描述了Z)7VM72的兩個等位基因形式(Fmnchinaefa/.，(2001)/fww./feA52，p210)。D7VMJ2編碼與DNA甲基化過程有關的酶。其中一種等位基因DMW72/在外顯子2的104位包括核苷酸G，而且在外顯子4的50位包括核苷酸C。另一種等位基因D7VMT2//在這些位點分別包括核苷酸A和T。因此，DWMT2的兩個等位基因形式之間在外顯子2禾口4內的DNA序列差異允許待確定的最終mRNA分子中的外顯子2和4的等位基因起源。已經利用這些發現來測試是否可以通過將來自每個等位基因的外顯子整合至相同的成熟mRNA分子中而在雜合子代中形成雜交形式的mRNA，從而產生對雜合子代獨特的新多肽或蛋白質分子。為了確定在剪接初級轉錄產物後，是否能夠和如何將來自每個D7VM:T2等位基因的外顯子或其部分整合至相同的成熟mRNA分子中，從兩個患者III1和III2的外周血白細胞(PBL)中分離mRNA，已經通過分離研究確認這兩名患者是兩個"A^T72等位基因形式的雜合體(參見，Franchina等，上文)。使用引物對mRNA進行RT-PCR，其擴增包括來自DtVMT2的外顯子2禾Q4的大約480bp的cDNA片段。克隆來自患者III1和III2的大約480bp長的RT-PCR產物並將一些列來自每個RT-PCR產物的克隆測序。如表l中所示的，來自患者III1的已測序的15個克隆中的13個插入片段反映出DA^m的雙等位基因表達，而且正如所料的，成熟mRNA分子中外顯子2和4是順式裝配的。然而，其中一個克隆包括包含來自DiVMT2/等位基因的外顯子2和來自DiVMT2//等位基因的外顯子4的剪接產物。另外的克隆包含來自￡>7\^/72//等位基因的外顯子2以及來自DA^f77/等位基因的外顯子4。為了評價這些發現的重現性並排除在患者ni1中發現的兩個顯性雜交mRNA分子是有絲分裂重組事件的某種形式的結果的可能性，對來自患者III2的PBL的mRNA種類進行了相似的檢測。如表1中所示的，14個克隆中的11個包含反映DWM72雙等位基因表達和順式裝配的插入片段。然而，另外3個克隆的結構表明雜交mRNA分子已經得到裝配。它們中的兩個包含來自DMVf727/等位基因的外顯子2和來自Z)7VMT2/等位基因的外顯子4。而另外的克隆的序列揭示剪接的mRNA分子已經通過來自Z)A^T:T2/等位基因的外顯子2和來自D7VM"/J等位基因的外顯子4進行了裝配。然後從另外兩名患者II3禾DII4的PBL分離mRNA(Franchina等，上文)，已經證實他們對兩個可替換等位基因形式中的每一個是雜合的。用處理來自患者IIIl和III2的mRNA的相同方法處理體外製備的來自患者II3和II4的等量mRNA混合物，該方法用來排除在患者III1和III2的PBL中發現的雜交mRNAZ)7VMT2可能由於截斷的反向轉錄產物的形成導致RT-PCR的PCR階段的模板開關而已經在體外產生的可能性。如表l中所示，參考來自13個克隆的插入片段的序列沒有發現雜交mRNA分子。總之，這些發現確定所有的剪接D7WkmmRNA分子中幾乎20%包含雜交形式。表l依據存在於外顯子2和4內的多態性位點的核苷酸得到的外周血白細胞中剪接的D7VAf77mRNA分子的分布。ZWM"轉錄產物SS外顯子2的n細外顯子4的nt50III1III2混合:GC558AT865GT110AC120標註通過譜系分析各自證實了患者mi、in2中的基因型da^tj21/11，以及患者II3和II4中的￡^^72///和￡WMZ2/////(參見，FranchinaandKay，Hum.Hered.52，210(2001))。*將來自患者III1、III2、(II3禾卩II4)的雜合DTVikf"/和//親本的mRNA混合物也接受RT-PCR，並將產物進行了克隆和測序。沒有發現說明混合的mRNA樣品中G-T或A-C剪接的D7VMr2mRNA分子的插入片段。這些結果證實了涉及mRNA分子的反-外顯子，雙等位基因裝配的體內初級轉錄產物剪接系統的存在。實施例2骨質疏鬆症作為人HV的模型骨質疏鬆症是幾乎40%絕經後婦女患有的骨病。它由導致降低的骨密度和增加的骨折易感性的破骨細胞引起的骨吸收增加引起。降鈣素用來治療骨質疏鬆症，因為它結合破骨細胞上的降鈣素受體並因此降低它們引起骨衰退的能力。TabouletWa/"(1998)，i/ww.Mo/.7，p2129已經表明對野生型降鈣素受體等位基因雜合的患者與相同野生型等位基因純合的患者相比較，具有更髙的骨密度和降低的骨折風險，如表2中所示的。表2顯示了編碼不同降鈣素受體等位基因形式中不同胺基酸的核苷酸改變的外顯子位置。從NCBI資料庫檢索到這些編碼序列變化。如表2中所示的，外顯子1可以在胺基酸位置126編碼亮氨酸或精氨酸，而通過外顯子9內胺基酸位置447的核苷酸差異編碼脯氨酸或亮氨酸。編碼降鈣素受體位置126和447的可替換胺基酸的核苷酸序列差異的分布滿足所需的結構標準，該結構標準能夠在降鈣素受體基因的不同等位基因形式雜合的患者中形成新或雜交形式的降鈣素受體。2編碼可選擇的降鈣素受體等位基因中胺基酸差異的核苷酸改變的外顯子位置126126447447外顯子1199可替換的胺基酸(L)亮氨酸(R)精氨酸(P)脯氨酸(L)亮氨酸根據本文所述的本發明，允許的降鈣素受體內位置126和447的胺基酸的組合包括(a)亮氨酸/脯氨酸，(b)亮氨酸/亮氨酸，(c)精氨酸/脯氨酸和(d)精氨酸/亮氨酸，其中兩個包括野生型等位基因，而另外兩個包括降鈣素受體的雜交形式，其影響骨密度和骨折易感性。實施例3精氨琥珀酸尿作為新生化途徑的HV哺乳動物模型在人類中，已經鑑定了編碼酶精氨琥珀酸裂解酶(ASL)基因的至少5種不同等位基因形式。其中的一些，例如，ASL(D87G)、ASL(Q286R)和ASL(A398D)，編碼ASL的突變形式。對這些ASL突變形式中的每一種純合的患者產生無活性形式的該酶，導致稱為精氨琥珀酸尿的疾病的發作。公知從任一他們受影響的親本遺傳ASL突變等位基因形式如雜合形式ASL(Q286R)和ASL(D87G)的子代中，觀察到HV的形式，因此恢復了ASL的活性(參見Walker"a/.，(1997)，j:腸/.C/2纖.272，p6777，在此引入作為參考)。編碼ASL(D87G)禾QASL(Q286R)的等位基因的特徵在於位於不同ASL外顯子內的核苷酸差異。在胺基酸位置87產生天冬氨酸或甘氨酸的核苷酸改變位於外顯子3中，而編碼穀氨醯胺或精氨酸的核苷酸改變位於外顯子11中。外顯子3和11中各自編碼位置87和286的可替換胺基酸的核苷酸序列差異的位置滿足所需的結構標準，該結構標準允許在ASL基因的兩個不同突變形式雜合的患者中正常合成ASL酶。實施例4:酸尿作為新生化途徑的HV模型胱氨酸尿是特徵在於受損的胱氨酸和其他胺基酸的腎吸收的人類疾病。已經表明一種形式的胱氨酸尿(稱為非l-型胱氨酸尿)是由稱為SLC7A9的基因的突變引起。SLC7A9突變形式如G105R、V170M和A354T的純合導致胱氨酸重吸收的顯著降低。如Font"W.，(2001)，//wm.Afo/.10，305中所示的，SLC7A9的這些突變形式中每一種的雜合導致胱氨酸重吸收的引人注目的恢復。與該模型相一致，SLC7A9內導致突變等位基因G105R、V170M和A354T產生的核苷酸改變各自位於外顯子4、5和10中。編碼SLC7A9三個突變形式的每一種的核苷酸改變的位置滿足所需的結構要求，需要該結構要求來合成對上述三種SLC7A9突變形式中任兩種雜合的患者中正常活性的SLC7A9。實施例5長壽作為新生化途徑的哺乳動物HV模型《/oAo基因(Ai)編碼推定的1型膜蛋白以及分泌的形式。儘管在許多不同的組織如大腦、胎盤、腎臟、前列腺和小腸中表達分泌的形式，其精確的功能仍然是不確定的。然而，認為虹影響長壽，因為具有缺陷形式純合基因的小鼠顯示出類似人老化的症狀，包括動脈粥樣硬化、氣腫和不育。證據還表明Klotho降低血壓，一種已知影響死亡率的因素(參見，Arkingefa/.，(2002)，戶raciVa".^cad,5W.UiSJ99，p856)。與人HV模型相一致，近期的研究已經表明雜合K/oAo患者與純合患者相比較，處於較低的早死風險中(Arking"a/.，(2005)，C!>c.Wes.96，p412)。表3詳述了編碼基因產物的可替換等位基因形式中不同胺基酸的核苷酸改變的外顯子位置。從NCBI資料庫檢索到編碼片段序列變化。如表3中所示的，外顯子1編碼胺基酸位置15的穀氨醯胺或脯氨酸和位置45的纈氨酸或苯丙氨酸。外顯子2編碼位置352的纈氨酸或苯丙氨酸和位置370的絲氨酸或胱氨酸。由外顯子3內的核苷酸改變編碼的絲氨酸或脯氨酸可以佔據胺基酸位置514。表3中所示的不同K/Wb外顯子內非同義核苷酸改變的分布表明，根據本文所述的新生化途徑，它們可能編碼至少2個野生型蛋白質和最少6個雜交蛋白質,表3編碼可替換A7oAo等位基因中胺基酸差異的核苷酸改變的外顯子外顯子可替換的胺基酸151545453523523703705145141111222233(Q)Gln(P)Pro(V)Val(F)Phe(V)Val(F)Phe(C)Cys(S)Ser(S)Ser(P)Pro實施例6囊腫性纖維化作為化合物CFTR突變雜種中的HV模型囊腫性纖維化是全世界最常見的遺傳病之一。它在性質上是常染色體隱性的並由大量CFTR基因突變形式中兩種的遺傳引起。反映出以下說明的HV形式的疾病表現形式是高度可變的並難以從任何特定個體遺傳的突變單模標本預測。所述疾病影響多個器官，包括肺和胰腺，並可以引起出生時的嚴重腸阻塞。在1992年，並且與我們的技術相一致，Hamosh和同事(Hamoshe/a/.，(1992)Am.J.Hum.Genet.，51，p245)發現，與具有遺傳的雜合形式的相同的兩個突變等位基因的患者相比較，兩個不同的CFTR突變，SF508和G551D純合的患者具有更嚴重的胰腺損害和腸功能障礙。我們的技術顯示出，通過在雜合而不是純合患者中完全正常的CFTR分子的合成使得疾病減弱，因為編碼SF508和G551D致病突變的核苷酸改變各自位於外顯子10和11內。實施例7糖尿病作為新生化途徑的哺乳動物HD模型糖尿病是一種常見的重病，其中由於受損的胰島素分泌或對其作用的抗性不能適當地控制血糖水平。存在許多不同機理形式的糖尿病。在1型糖尿病(青年糖尿病)中，由於對胰島細胞的免疫攻擊損害了胰島素釋放，胰島細胞是胰腺內分泌胰島素的細胞。穀氨酸脫羧酶(04D65)編碼1型糖尿病中免疫系統耙向的主要胰島細胞自體抗原。表4詳述了編碼酶穀氨酸脫羧酶的可替換等位基因形式中不同胺基酸的核苷酸改變的外顯子位置。從NCBI資料庫檢索到編碼區序列變化。如表4中所示的，外顯子1包括編碼胺基酸位置12的精氨酸或甘氨酸的核苷酸差異。另一方面，外顯子4包括編碼胺基酸位置124的天冬醯胺或賴氨酸以及位置153的穀氨醯胺或脯氨酸的核苷酸改變。表3還顯示了由外顯子6內的核苷酸差異編碼的位置232的可替換胺基酸穀氨酸或甘氨酸、由外顯子8內的核苷酸改變編碼的位置286的精氨酸或賴氨酸和外顯子10內的核苷酸改變編碼的位置326的丙氨酸或甘氨酸。編碼可替換的胺基酸並包括於外顯子1、4、6、8或10中的核苷酸序列差異的分布滿足所需要的結構標準，該結構標準符合在表4中所述任兩種酶的不同等位基因形式雜合的患者中產生雜交形式的穀氨酸脫羧酶。例如，參照可以由只位於外顯子6和8中的核苷酸差異編碼的可替換胺基酸，根據新的生化途徑，在胺基酸位置232和286形成(a)穀氨酸/精氨酸(b)穀氨酸/賴氨酸(c)甘氨酸/精氨酸和(d)甘氨酸/賴氨酸的組合。這些組合中的兩種包括野生型酶，而另兩種包括雜交形式。表4編碼可替換穀氨酸脫羧酶(GAD65)等位基因中胺基酸差異的核苷酸改變的外顯子位置胺基酸位置外顯子可替換的胺基酸121(R)精氨酸121(G)甘氨酸1244(N)天冬醯胺1.244(K)賴氨酸1534(Q)穀氨醯胺1534(P)脯氨酸2326(E)天冬氨酸2326(G)甘氨酸2868(R)精氨酸2868(K)賴氨酸32610(A)丙氨酸32610(G)甘氨酸實施例8GAD65雜合性在自體抗體誘導中的作用雖然水平較低，可以在疾病發作之前在患有I型糖尿病患者的血清中以及他們無症狀親屬的血清中檢測到GAD65自體抗體。與發明人的發現和假設相一致，滿足結構標準的GAD65等位基因的雜合性允許產生增強對抗GAD65的免疫應答的雜交形式的GAD65，自體抗體水平應當根據GAD65基因型而改變，即使在非I型糖尿病患者中也是如此。近來Boutin"a/.(2003)，P丄oS所o/.1，p68的綜合研究結果證實了與相同GAD65等位基因純合的相同患者組相比較，GAD65等位基因雜合患者中的GAD65自體抗體水平顯著更高。這些發現強烈支持發明人要求的新多肽或蛋白質，其通過不同形式等位基因雜合患者中的新生化途徑形成，滿足發明人的結構標準，比相同GAD65等位基因純合的患者更容易合成自體抗體。另一方面，在生命後期發生的糖尿病類型，其中一些與肥胖相關，不是由自體免疫過程引起的。這些形式的糖尿病稱為2型糖尿病。位於染色體2上的最一貫識別的2型糖尿病候選基因是calpain-10(CALP-IO)。沒有發現突變形式的CALP-10來解釋該基因和2型糖尿病產生之間的關係，儘管它與2型糖尿病發展最高風險相關。GALP-10與2型糖尿病發展易感性相關的HD模型得到已經鑑定的許多不同CALP-10等位基因形式發現的強烈支持，如L34V、T504A、R555C和V666I(E窗s自/.，Am.J.Genet.69，544(2001))，這些等位基因形式滿足所需的結構標準，以在雜合子代中通過新的生化途徑形成雜交酶。與模型相一致，已經表明提高的2型糖尿病發展的易感性與CALP-10的不同等位基因形式的雜合性而不是純合性相關(參見，Cox，(2001)，//畫.M/.G麼/.10，p2301;Coxe"/.，(2004)，D勵勿，53，p19)。胰島素降解酶(IDE)是通過基因組掃描發現的位於染色體10上的另一種強有力的候選2型糖尿病易感性基因。IDE涉及胰島素的蛋白水解降解，最可能是作為胰島素應答終止的部分。和CALP-10—樣，沒有發現IDE的致病突變形式。在表5中顯示了IDE內編碼不同胺基酸的核苷酸改變的外顯子位置。從NCBI資料庫檢索編碼序列變化。如表中所示的，外顯子3含有編碼位置298的可替換胺基酸苯丙氨酸或亮氨酸的核苷酸序列差異。此外，由位於外顯子5內的核苷酸改變編碼胺基酸位置582的胺基酸亮氨酸或苯丙氨酸，由外顯子ll內的核苷酸差異編碼胺基酸位置854的絲氨酸或甘氨酸。由外顯子20中包括的序列改變編碼胺基酸位置947的天冬醯胺或天冬氨酸。編碼位置298、582、845和947的可替換胺基酸並各自位於外顯子3、5、11和20中的核苷酸序列差異的分布滿足所需的結構標準，以在表4中所示的任兩種可替換等位基因雜合的患者中合成雜交形式的IDE。例如，參照只由外顯子11和20編碼的等位基因，位置845和947的胺基酸組合包括(a)絲氨酸/天冬醯胺(b)絲氨酸/天冬氨酸(c)甘氨酸/天冬醯胺和(d)甘氨酸/天冬氨酸。這些組合中的兩種反映出野生型酶，而另外兩種包括所述酶的雜交形式。編碼可替換IDE等位基因中胺基酸差異的核苷酸改變的外顯子位置胺基酸位置外顯子可替換的胺基酸2983(F)苯丙氨酸2983(L)亮氨酸5825(L)亮氨酸5825(F)苯丙氨酸84511(S)絲氨酸84511(G)甘氨酸94720(N)天冬醯胺94720(D)天冬氨酸實施例9血栓栓塞作為新生化途徑的哺乳動物HD模型患有產生狼瘡抗凝血劑的全身性紅斑狼瘡(SLE)的患者易患血栓栓塞疾病。據認為，血栓栓塞疾病的產生是由血小板不適當的激活引起的，血小板是凝血系統的組成部分。在SLE患者中，通過循環結合血小板表面上的FcyIIa受體的免疫複合物或通過對抗它們的自體抗體激活血小板。近期的研究結果(Schallmoser&a/.，(2005)，T7zraw6ow》//^mwtos"93，p544)已經表明具有狼瘡抗凝血劑的患者更易於產生血栓栓塞疾病，如果他們對於FcyIIa可替換等位基因形式是雜合的。表6顯示了編碼FcyIIa可替換等位基因形式中不同胺基酸的核苷酸改變的外顯子位置。從NCBI資料庫檢索編碼序列變化。如表6中所示的，外顯子1可能編碼FcyIIa胺基酸位置61的精氨酸或穀氨醯胺，而外顯子2可能編碼胺基酸位置138的纈氨酸或甲硫氨酸和胺基酸位置165的精氨酸或組氨酸。外顯子3可能編碼胺基酸位置272的脯氨酸或亮氨酸。根據本文所述的本發明，位置61、138、165和272的胺基酸組合允許最少2個野生型蛋白和最少至少6個雜交蛋白的形成。表6編碼可替換FCr/"等位基因中胺基酸差異的核苷酸改變的外顯子位置胺基酸位置外顯子可替換的胺基酸611(R)Arg611(Q)Gin1382(V)Val1382(M)Met1652(R)Arg1652(H)His272(P)Pro2723(ULeu實施例10支持HV中新生化途徑作用的植物模型過氧化氫酶1(Cat-1)是在植物的過氧化氫分解中起重要作用的酶的氧化還原酶類型。在玉米中，已經鑑定Cat-1的至少6種不同的等位基因形式，其中大部分在胺基酸組成方面不同。在1972年，在Cat-1的兩個不同等位基因形式的雜合體植物中鑑定出了Cat-1的雜交形式(Scandalios"a/.，(1972)，Jrc/z.傷oc/^w，153，p695)。顯示雜交Cat-1酶與純合子親本形式中的任何一個相比具有一定範圍增強的生化特性。新的生化途徑為與野生型相比具有增強的生化特性的雜交Cat-1分子的形成提供了貌似合理的解釋，其中野生型不依靠多聚體形式的所述酶的形成。實施例11支持HV中新生化途徑作用的昆蟲模型辛醇脫氫酶(od/O編碼擬暗果蠅(Dmso;/n7a;weMfifooZwcMra)和其他蒼蠅中發現的酶。它涉及長鏈醇的代謝。基於電泳遷移率的差異，已經鑑定出酶odh的兩個不同結構形式，F和(an)S。在1972年，Wills和Nichols(Proc.Natl.Acad.Sci.USA69，323(1972))證明了o函兩個不同結構形式中的每一個的雜合體型在充滿辛醇的培養基上產生的蒼蠅的存活中起著雜合的作用。雜合的雜種蒼蠅具有在任一親本中沒有發現的新的該酶的結構形式，它們的親本對於任一可替換的o函形式各自是純合的。新的生化途徑提供了不依賴於該酶多聚化的雜種蒼蠅中odh新結構形式形成的貌似合理的解釋(參見，Singhetal.,Genetics80,637(1975))。實施例12雜交ASL分子的鑑定如下所述，證明通過新鑑定的生化途徑將來自不同突變體等位基因中的每一個的野生型編碼外顯子包含在相同的mRNA分子中，在受影響親代的子代中產生活性精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)是可能的。之前的研究已經表明，當以雜合體形式遺傳非活性ASL突變體如ASL(D87G)和ASL(Q286R)的組合時，可以部分恢復活性。因此，可以從證明已經遺傳ASL兩個非活性等位基因突變體形式中每一個的患者的成纖維細胞或肝中分離mRNA。然後利用跨越單個外顯子的寡核苷酸引物對總mRNA進行RT-PCR。然後將含有這些區域的RT-PCR產物克隆並測序。首先從基因型如ASL(D87G)/(Q286R)患者的RT-PCR產物產生的克隆的大約85%證實了ASL的雙等位基因表達和外顯子的順式裝配。但是來自大約15%克隆的插入片段的序列將包括來自相同克隆中的兩個親代等位基因中的每一個的序列，並因此產生大約15%的導致酶活性恢復的野生型酶。實施例13雜交GAD65分子與GAD65自體抗體產生的關聯可以從患有1型糖尿病的患者獲得的胰腺組織的胰島細胞提取總mRNA。如果患者對於GAD65等位基因是雜合的，該等位基因在編碼非同義胺基酸的不同外顯子中具有核苷酸改變(參見表3)，則在該患者血液中將具有高滴度的GAD65自體抗體。然後根據患者的GAD65基因型，可以使用跨越外顯子l、4、6、8或10的寡核苷酸引物將總胰腺mRNA進行RT-PCR。將預期，大約85%克隆的插入片段的序列將證實來自所述兩個等位基因中每一個的雙等位基因表達和外顯子的順式裝配。將預期，另外15%克隆的序列含有證實雜交形式的GAD65是在來自患有I型糖尿病患者的胰島細胞中合成的插入片段，其中患者是上文中定義的GAD65的不同等位基因形式的雜合體，而且在他們的血液中具有循環的GAD65自體抗體。當已知研究的子代遺傳了具有上文中定義的等位基因的基因並鑑定了其中表達所述基因的組織或細胞時，相同的實驗原理可用於所有物種。以上包括的方法只表示是實例，並不排除使用本領域任何技術人員熟知的任何其他技術或實驗操作方案。權利要求1、鑑定能夠在動物或植物中產生雜種優勢或雜種劣勢的候選基因的方法，包括如下步驟(i)比較從呈現出雜種優勢或雜種劣勢的動物或植物分離出來的，候選基因的等位基因的mRNA序列，和從所述動物或植物的親本分離出來的，相應等位基因的核苷酸序列；(ii)鑑定來自呈現出雜種優勢或雜種劣勢的所述動物或植物的等位基因中編碼胺基酸序列變化的mRNA序列差異；和(iii)鑑定由位於候選基因內的，兩個或多個不同外顯子內的mRNA序列編碼的所述動物或植物中候選基因的等位基因之間的胺基酸序列的變化。2、根據權利要求1的方法，其中所述胺基酸序列的變化是保守性的修飾變化。3、根據權利要求l的方法，其中所述胺基酸序列的變化是非保守性的修飾變化。4、根據權利要求1的方法，其中鑑定mRNA序列差異的歩驟包括將分離自所述植物或動物的mRNA測序的歩驟。5、根據權利要求1的方法，其中所述植物選自大麥、黑麥、高粱、玉米(maize)、大豆、小麥、燕麥(com)、馬鈴薯、棉花、水稻、油菜(包括canola)、向日葵、紫苜蓿、甘蔗、香蕉、黑莓、藍莓、草莓和樹莓、香瓜、胡蘿蔔、花椰菜、咖啡、黃瓜、茄子、葡萄、香蜜瓜、生菜、芒果、甜瓜、洋蔥、番木瓜、豌豆、胡椒、菠蘿、菠菜、南瓜、甜玉米、菸草、番茄、西瓜、薔薇科水果(如蘋果、桃、梨、櫻桃和李子)和蔬菜芸苔(如花莖甘藍、巻心菜、花椰菜、抱子甘藍和球莖甘藍)。表型可以改變的其他作物、水果和蔬菜包括大麥、醋慄、鍔梨、柑橘類水果如桔子、檸檬、葡萄柚和紅橘、朝鮮薊、櫻桃、堅果類如胡桃和花生、菊苣、韭蔥、根類如竹芋、甜菜、木薯、蕪箐、蘿蔔、山藥、甘薯或者豆類。6、根據權利要求1的方法，其中所述動物是哺乳動物或魚。7、根據權利要求6的方法，其中所述哺乳動物選自靈長目、齧齒目、兔形目、鯨目、食肉目、奇蹄目或者偶蹄目的哺乳動物。8、根據權利要求7的方法，其中所述偶蹄目選自九個科中的一個豬科、西湍科、河馬科、駱駝科、鼷鹿科、長頸鹿科、鹿科、叉角羚羊科或者牛科。9、根據權利要求8的方法，其中選自牛科的所述動物是有蹄動物。10、根據權利要求9的方法，其中所述有蹄動物選自奶牛或公牛、野牛、水牛、綿羊、大角綿羊、馬、矮種馬、驢、騾、鹿，麋鹿、馴鹿、山羊、水牛、駱駝、美洲駝、羊駝或者豬。11、根據權利要求6的方法，其中所述動物是魚。12、根據權利要求11的方法，其中所述魚選自斑馬魚、歐洲鯉魚、鮭魚、食紋魚、丁鯛、七鰓鰻、圓奸虎魚、羅非魚或者鱒魚。13、根據權利要求8的方法，其中所述動物是人。14、鑑定導致雜種優勢或雜種劣勢的因子的方法，包括如下步驟:(i)鑑定由候選基因的等位基因編碼的多個mRNA或蛋白質種類的存在或不存在；和(ii)如果存在多個mRNA或蛋白質種類，則分析所述種類的mRNA和蛋白質來測定是否所述種類具有核苷酸或胺基酸的變化，各自對應於兩個或多個外顯子中的變化；其中步驟(ii)中多個mRNA或蛋白質種類的存在表示雜種優勢或雜種劣勢。15、在動物或植物中產生雜種優勢或雜種劣勢的方法，包括如下步驟(i)鑑定由候選基因的等位基因編碼的多個mRNA或蛋白質種類的存在或不存在；和(ii)如果存在多個mRNA或蛋白質種類，那麼分析所述的mRNA或蛋白質種類來測定所述的種類是否具有核苷酸或胺基酸序列的變化，各自對應於兩個或多個外顯子中的變化；其中步驟(ii)中多個mRNA或蛋白質種類的存在表示雜種優勢或雜種劣勢；(iii)測定與野生型蛋白對照的功能相比較的多個蛋白質種類的功能來測定哪個種類促進了所述植物或動物中的HV或HD;(iv)製備包括編碼步驟(iii)中所述蛋白質種類的核苷酸序列的構建體；(v)將所述構建體轉化至受體植物或動物細胞中；和(vi)使植物或動物再生，其從所述細胞表達所述構建體。16、檢測植物或動物中雜交mRNA的存在或不存在的方法，包括從植物或動物分離mRNA並將所述mRNA的核苷酸序列與植物或動物等位基因的相應編碼序列相比較的步驟。17、包括合成基因的構建體，該合成基因包括來自基因的不同等位基因的外顯子，其中所述等位基因編碼胺基酸序列的變化，其中所述變化發生在不同等位基因之間。18、體外或體內產生的雜交mRNA分子克服植物或動物中雜種劣勢和/或誘導植物或動物中雜種優勢的用途，包括將所述雜交mRNA引入所述動物或植物的步驟。19、根據權利要求18的用途，其中將所述雜交mRNA引入所述動物或植物的步驟是通過轉化或同源重組。20、根據權利要求19的用途，其中轉化至植物的步驟選自同源重組、微粒轟擊、PEG介導的轉化、電穿孔、碳化矽纖維介導的轉化或農桿菌介導的轉化。21、體外或體內產生的雜交蛋白質分子克服植物或動物中雜種劣勢和/或誘導植物或動物中雜種優勢的用途，包括將所述雜交蛋白質引入所述動物或植物的步驟。22、根據權利要求21的用途，其中將所述雜交蛋白質引入所述動物、人或植物中的步驟是通過口、局部或非腸道途徑給予雜交蛋白質。23、治療或預防疾病的方法，包括將根據權利要求1至13任一項方法鑑定的候選基因給予動物或植物的歩驟。24、治療或預防疾病的方法，包括將根據權利要求14的方法鑑定的因子給予動物或植物的步驟。25、治療或預防疾病的方法，包括將根據權利要求17的構建體給予動物或植物的步驟。26、根據權利要求1至13任一項方法鑑定的候選基因在製備治療或預防疾病的藥物中的用途。27、根據權利要求14的方法鑑定的因子在製備治療或預防疾病的藥物中的用途。28、根據權利要求17的構建體在製備治療或預防疾病的藥物中的用途。全文摘要本發明涉及鑑定用於誘導雜種優勢、雜種劣勢和/或診斷、預後或治療疾病中的候選基因及其編碼的蛋白質的方法。特別地，涉及鑑定能夠在動、植物中產生雜種優勢或雜種劣勢的候選基因的方法，包括(i)比較從呈現出雜種優勢或雜種劣勢的動、植物分離的候選基因的等位基因的mRNA序列和從該動、植物的親本分離的相應等位基因的核苷酸序列；(ii)鑑定來自呈現出雜種優勢或雜種劣勢的動物或植物的等位基因中編碼胺基酸序列變化的mRNA序列差異；和(iii)鑑定由位於候選基因內的兩個或多個不同外顯子內的mRNA序列編碼的所述動、植物中候選基因的等位基因之間的胺基酸序列變化。文檔編號C12Q1/68GK101283105SQ200680035519公開日2008年10月8日申請日期2006年7月28日優先權日2005年7月29日發明者P·H·凱申請人:雜交生物科學私人有限公司