利用抑制cd21的藥劑治療抗體介導的病變的方法

2023-12-03 07:00:01 1

專利名稱：利用抑制cd21的藥劑治療抗體介導的病變的方法
技術領域：
本發明涉及抗體介導的病變(pathology)如自身免疫病領域。更具體地，本發明涉及治療患有抗體介導的病變如自身免疫病的方法和利用幹擾CD21/C3d相互作用的藥劑延緩抗體介導的病變的發展的方法。
背景技術：
抗體介導的病變包括多種病症，包括自身免疫病、異種移植排斥、同種移植排斥、移植物抗宿主疾病和對持續施用的治療性蛋白質的免疫應答。抗體介導的病變的特徵為可導致免疫複合體的自身抗體的過度產生。免疫複合體在特定器官或組織部位中的沉積可以引起例如組織損傷、腎衰竭、腎小球性腎炎、脈管炎和伴有心包炎的嚴重器官累及等病變。抗體介導的自身免疫病變包括原發性抗磷脂綜合症(APS)、甲狀腺炎、重症肌無力、格雷夫斯病(Graves′disease)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、系統性硬皮病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)和多肌炎。
術語抗磷脂(aPL)抗體一般用於描述與血栓形成、習慣性流產和血小板減少如原發性抗磷脂綜合症(APS)以及自身免疫病如系統性紅斑狼瘡(SLE)相關的自身抗體。Harris等人(1983)Lancet 21211-1214；和Lockshin等人(1985)N.Engl.J.Med.313152-156。APS可以原發的或者繼發的，這意味著其與其它病症相關，所述病症主要是SLE。「磷脂結合抗體」(Phospholipid-Binding Antibodies)(Harris等人主編，CRC出版社，Boca Raton，FL，1991；McNeil等人「免疫學進展」(Advances inImmunology)，第49卷，193-281頁(Austen等人主編，學院出版社，San Diego，CA，1991))。aPL抗體包括所謂的抗心磷脂(aCL)自身抗體，其將在下文中討論。aPL抗體(包括aCL抗體)在多種病症中均可檢測出，但只有與自身免疫病相關的β2-糖蛋白I(β2GPI)依賴型抗磷脂抗體需要磷脂結合血清蛋白質β2GPI的存在。Vaarala等人(1986)臨床免疫學免疫病理學(Clin.Immunol.Immunopathol.)418-15。APS的臨床表現包括動脈閉塞、肢體壞疽、中風、心肌梗死、其它內臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內臟靜脈閉塞(如巴-希綜合症、門靜脈閉塞)、習慣性流產、血小板減少症、庫姆斯陽性溶血性貧血、網狀青斑、神經系統異常(如舞蹈症、短暫性局部缺血發作)、心瓣性心臟病以及突發性多系統動脈閉塞。Scientic American Medicine第15章，第IV節，5頁(2001)。
甲狀腺炎(或橋本甲狀腺炎)和格雷夫斯病是與甲狀腺有關的其它自身免疫病，並且被認為由針對促甲狀腺激素(TSH)受體的自身抗體引起。甲狀腺中的病理學發現包括慢性炎性細胞的過度浸潤、濾泡破裂、嗜曙紅細胞過多、不同程度的增生和纖維化。慢性甲狀腺炎的臨床表現多種多樣，但其主要的併發症狀為無痛甲狀腺腫、甲狀腺機能減退以及上述兩種的聯合。Scientific American Medicine第6章，第VI節，6-8頁以及第3章，第I節，16頁(2001)。
重症肌無力是一種自身免疫病，據認為其由針對乙醯膽鹼受體(AchR)的自身抗體引起。AchR的自身抗體可以在患有重症肌無力的患者的血清中檢測和測量到。重症肌無力的臨床表現包括骨骼肌無力和易疲勞。肌肉無力可以表現為不對稱上眼瞼下垂和復視，其因提升眼瞼和眼外肌移動的能力受損所致。其它身體症狀包括頸伸肌無力、頭下垂、由於面部肌肉和球肌無力所致的當患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構音障礙的低音量發音困難、可導致氣阻或反胃的吞咽困難，以及可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力。該疾病可以利用患者的致病性IgG傳遞給實驗動物。Scientific American Medicine第6章，第VI節6-8頁以及第11章，第III節，12-13頁(2001)。
系統性硬皮病是一種罕見的、慢性進行性風溼疾病，據認為其由針對核蛋白質如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70和著絲粒的自身抗體引起。系統性硬皮病可以是擴散性的或者限制性的。系統性硬皮病的限制形式或者CREST(鈣質沉著、雷諾氏現象、食道累及、指端硬化以及毛細血管擴張)可以是致命的，但比擴散性硬皮病較少累及內在器官。系統性硬皮病的臨床特徵包括手指和手掌的腫脹和變厚並可能涉及面部，皮膚的變厚、累及軀幹和臨近肘部的臂。隨著系統性硬皮病的進展，臨床特徵包括皮膚萎縮並可能脫髮、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性喪失；皮包骨，其中皮膚緊繃並緊結合在下面的結構上；以及有限的運動性，尤其是手指。ScientificAmerican Medicine第6章，第VI節6-8頁以及第15章，第V節，1-4頁(2001)。
特發性血小板減少性紫癜(ITP)是自身免疫病，其特徵為血小板的快速破壞。據認為是由於形成血小板上蛋白質的自身抗體並結合至血小板，從而使血小板隨後被網狀內皮系統除去。這些自身抗體常常直接針對血小板糖蛋白(GP)IIb-IIIa受體複合物。ITP中自身抗體的另一個靶子為GPIb受體複合物。ITP的一些臨床特徵包括下肢存在瘀斑，輕微臨床出血，包括紫癜、鼻衄、牙齦出血、月經過多，脾不顯(unpalpable spleen)，以及在幾種血小板減少症中，嘴中血泡。Scientific American Medicine第5章，第XIII節2頁(2001)。
多肌炎為風溼性疾病，其涉及主要是骨骼肌無力。據認為多肌炎由核蛋白如Jo-1、組氨醯-tRNA合成酶、蘇氨醯-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2的自身抗體引起。多肌炎的臨床特徵為相鄰肌肉無力並且也可包括可能的肺部累及，如吸入性肺炎、間質性肺病；軟組織鈣化(在兒童中最為常見)；以及與其它風溼性疾病如雷諾氏現象相關。Scientific American Medicine第6章，第VI節6-8頁以及第15章第VI節1-4頁(2001)。
系統性紅斑狼瘡(SLE)為自身免疫病，其特徵為產生多種核抗原(包括雙鏈DNA，dsDNA)的抗體。另外，抗-β2 GPI抗體也可以在患有SLE的個體中發現。據認為，與DNA反應的自身抗體在SLE的病理學中起作用，並且與狼瘡腎炎密切相關。參見例如Morimoto等人(1982)免疫學雜誌(J.Immunol.)1391960-1965；Foster等人(1993)Lab.Invest.69494-507；ter Borg等人(1 990)Arthritis Rheum.33634-643；以及Bootsma等人(1995)Lancet 3451595-1599。與SLE相關的其它臨床症狀包括面頰疹、盤形疹、蝶形疹、光過敏、口腔潰瘍、關節炎、漿膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、腎病(例如蛋白尿)、神經系統病症(例如癲癇發作或精神病)、血液病(例如溶血性貧血、白細胞減少症、淋巴細胞減少症、血小板減少症)以及免疫學病症(例如陽性紅斑狼瘡細胞製備、異常效價的針對天然DNA的抗-DNA抗體、抗-SM核抗原抗體)。Coutran等人，疾病的病理學基礎(Pathologic Basis of Disease)第4版(1989)。
現已提出幾種可能治療SLE的方法。一種方法為與無免疫原性載體偶聯的dsON的使用，也稱為平臺療法。已經證明，合成的dsON與抗-dsDNA抗體有交叉反應(美國專利號5,276,013)。例如，由連接至聚乙二醇效價平臺的4個dsON構成的四價偶聯物LJP249被用於證實在免疫的小鼠模型系統中的耐受性(Jones等人(1994)，生物偶聯物化學(BioconiugateChem.)5390-399)。另一偶聯物，LJP394，為由連接至平臺的4個dsON構成的四價偶聯物，在BXSB實驗小鼠狼瘡腎炎模型中被證明可以延緩腎病的進展並延長生存(Plmkett等人(1995)狼瘡(Lupus)4S99；Coutts等人(1996)狼瘡(Lupus)5158-159)。LJP394在患有SLE的人中也被證明可降低抗-dsDNA抗體(Weisman等人(1997)風溼病學雜誌(J.rheumatol.)24314-318)。
其它可用於治療SLE的方法也已經被描述，包括通過誘導B細胞耐受降低循環抗體水平的方法，包括但並不限於，美國專利號5,276,013、5,391,785、5,786,512、5,726,329、5,552,391、5,268,454、5,606,047、5,633,395、5,162,515、6,022,544；美國系列號08/118,055(美國專利號6,060,056)；美國系列號60/088,656和60/103,088(美國系列號09/328,199和PCT申請號PCT/us99/13194)。
儘管SLE被普遍認為是自身免疫病，其病因依然未知。據認為，B細胞表達的人補體受體1和2(hCR1和hCR2)與SLE有一定關係。在患有SLE的患者中，利用hCR1和hCR2的單克隆抗體通過流式細胞術測量可常規觀察到hCR1和hCR2(CD21)的異常表達，水平為非SLE患者的約50％。參見例如Wilson，J.G.等人，Arthritis Rheum.(1986)29739；Levy，E.J.免疫學臨床實驗(Clin.Exp.Immunol.)(1992)90235；以及Marquart，H.V.等人，免疫學臨床實驗(Clin.Exp.Immunol.)(1995)10160。
人CD21或者補體受體2(CR2)為約145-150kDa的膜糖蛋白，其主要在成熟B淋巴細胞上表達。Tedder，T.F.等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)(1984)133678。人CD21是補體片斷C3d、C3dg和iC3b以及Epstein-Barr病毒(EBV)的受體。Weis，J.J.等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)81881和Fingeroth，J.D.等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)814150。CD21由約15到16個胞外短共有重複(SCR)(每一個有約60到70個胺基酸)、約24個胺基酸的跨膜區和約34個胺基酸的短胞質部分。在小鼠中，CR2和CR1由同一基因經可變剪切產生，而在人中CR2和CR1是不同基因的唯一產物。
CD21與CD81和CD19形成非共價受體複合體，這在B細胞活化中非常重要。在成熟B細胞上，CD21在通過多聚C3d發生交聯後傳導共刺激信號。Melchers，F.等人，自然(Nature)(1985)317264。據認為，短共有重複1和2(SCR1和/或SCR2)是CD21中特異性識別C3d的部分。據認為，通過提供B細胞抗原受體和它的共受體之間的橋梁，補體片斷(例如C3d)結合至CD21在B細胞應答中起著非常重要的作用，這可使B細胞對抗原的敏感性提高100到10,000倍。Janeway和Travers，免疫生物學(Immunobiology)第三版，(1997)843。
已經描述了幾種CD21的結合劑的組合物，其涉及補體或者B細胞表面蛋白質。一種組合物涉及設計用於結合補體片斷的重組融合蛋白質。參見例如WO91/16437。已經描述的另一組合物涉及內皮細胞上B細胞受體的結合劑。這些B細胞受體包括CD11b、CD11c、CD21、CD23、70到85kDa蛋白質或者115kDa蛋白質。參見例如WO96/12742、WO96/12741或者EP 0788513。另一組合物涉及人CD21的小鼠單克隆抗體。該小鼠單克隆抗體能夠抑制Epstein-Barr病毒感染表達CD21的細胞。此外，它也能夠幹擾C3dg包被的抗原向濾泡樹突細胞和B細胞的遞送。參見例如Prodinger等人(1998)免疫學雜誌(J.Immunol.)1614604、美國專利號6,291,239(Prodinger等人)、EP1001021(Prodinger等人)、Guthridge等人(2001)1675758。也參見WO 01/92295(Isenman和Clemenza)、美國專利號5,552,381(Atkinson)和5,719,127(Atkinson等人)、WO00/67796(Curd等人)、WO96/12742(Bonnefoy和LeCoanet-Henchoz)、美國專利號6,238,670(Fearon和Dempsey)、WO 91/16437(Hebell和Fearson)、EP 528926(Hebell和Fearon)。
其它文獻描述了在抗體應答中小鼠補體受體的參加。參見例如Wiersma，E.J.等人，歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)(1991)212501-2506和Takahashi，K.等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)(1997)1591577-1569。其它文獻描述了在小鼠SLE模型中可能參予B細胞活化的淋巴細胞表面受體的研究。參見例如Early，G.S.等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)(1996)1573159-3164；和Mihara，M.等人(2000)(J.Clin.Invest.)10691-101。
儘管這些研究調查了B細胞活化受體CD40和CD152在SLE小鼠模型中的參予情況，但有關CD21在正在進行的免疫應答中的作用的研究依然有限。
目前需要能夠抑制不想要的抗體應答的改進方法。也需要治療自身免疫病(如SLE)患者的改進方法和延緩個體中自身免疫病(如SLE)發展的改進方法。於此提供的本發明滿足了這些需要。
於此引用的所有專利、專利申請和出版物特此全部引用作為參考。
發明概述本發明提供治療患有抗體介導的病變例如自身免疫病(如系統性紅斑狼瘡(SLE)、ITP或甲狀腺炎)的個體的方法，其包括向該個體施用有效量的幹擾C3d結合CD21的藥劑，由此緩解抗體介導的病變的症狀(即至少一種症狀得以緩解和/或延緩)。
另一方面，本發明提供延緩個體中與抗體介導的病變(例如SLE、ITP或甲狀腺炎等自身免疫病)相關的症狀發展的方法，其包括向該個體施用有效量的幹擾C3d結合CD21的藥劑，由此延緩抗體介導的病變的症狀。
所述症狀可以是與抗體介導的病變相關的任何一種或多種症狀。
附圖簡述

圖1描繪在致敏後14天和加強及利用PBS(對照動物)或可溶性CD21(sCD21，實驗動物)處理後7天小鼠中抗寡核苷酸(ON)IgG水平。
圖2描繪在加強免疫及利用PBS(對照動物)或抗-CD21單克隆抗體7G6(mAb；實驗動物)處理後14天小鼠中抗寡核苷酸(ON)IgG水平。
圖3描繪在對照(PBS)和抗-CD21(mAb 7G6)處理小鼠中抗Galα1-3Gal雙糖(即雙半乳糖)IgM和IgG的平均水平(±1個標準差或s.d.)。
圖4為Kaplan-Meier曲線，該曲線顯示出利用環磷醯胺、大鼠抗小鼠7G6或者兩者處理的NZB×NZW(F1)小鼠的存活結果。
發明詳述利用多種抗體介導的病變的本領域公認模型，我們已經發現，抑制CD21與C3d相互作用可以阻抑抗體的產生。抗體介導的病變包括但並不限於自身免疫病、異種移植和移植物抗宿主疾病。基於實驗結果，我們已經發現利用藥劑(包括但並不限於抗CD21單克隆抗體)抑制或幹擾CD21與C3d的相互作用可以抑制抗體介導的病變中的抗體(例如在自身免疫病如SLE中的抗dsDNA抗體)水平。
因此，本發明提供利用抑制CD21與C3d相互作用的藥劑來治療抗體介導的病變如自身免疫病(如SLE)的方法，據推測，所述抑制可以在抗體介導的病變中阻止非期望的應答。此外，本發明也提供延緩抗體介導的病變(如SLE)發展的方法，其通過向個體施用有效量的一種或多種可抑制CD21與C3d相互作用的藥劑而使抗體介導的病變的症狀得以緩解，據推測所述抑制可以阻止B細胞產生抗體。
一般技術除非另有指明，本發明的實施將使用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些技術在本領域技術範圍之內。這些技術在文獻中有完整的闡釋，例如分子克隆實驗室指南(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主編，1984)；動物細胞培養(Animal Cell Culture)(R.I.Freshnev主編，1987)；酶學方法(Methods in Enzymology)(學院出版公司)；實驗免疫學手冊(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell主編)；哺乳動物細胞基因轉移載體(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)(J.H.Miller和M.P.Calos主編，1987)；當前分子生物學實驗方法(Current Protocols in Moleculor Biology)(F.M.Ausubel等人主編，1987)；PCR多聚酶鏈式反應(PCRThe PolymeraseChain Reaction)(Mullis等人主編，1994)；當前免疫學方法(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人主編，1991)以及精編分子生物學實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)。
定義「抗體」(可互換地使用複數形式)是能夠特異性結合靶(例如碳水化合物、多核苷酸或多肽)的免疫球蛋白分子，所述結合通過位於該免疫球蛋白分子可變區中的至少一個抗原識別位點完成。正如於此所使用的，該術語不僅包括完整抗體，還包括它的片斷(例如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv)、單鏈(ScFv)、突變體、含有抗體部分的融合蛋白質、人源化抗體，以及含有具有所需特異性的抗原識別位點的任何其它修飾構型的免疫球蛋白分子。抗體包括任何種類的抗體，如IgG、IgA或者IgM，並且抗體不需要屬於任何特定種類。
「單克隆抗體」是指同質抗體群，其中單克隆抗體由參與選擇性結合抗原的胺基酸(天然存在和非天然存在)組成。單克隆抗體具有針對單個的抗原性位點的高度特異性。術語「單克隆抗體」不僅僅包括完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，還包括它的片斷(例如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv)、單鏈(ScFv)、突變體、含有抗體部分的融合蛋白質、人單克隆抗體、嵌合(如人源化)單克隆抗體，以及含有具有所需特異性並能夠結合至抗原的抗原識別位點的任何其它修飾構型的免疫球蛋白分子。上述無意限制抗體的來源和抗體產生的方式(例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等等)。
「人源化」抗體是指具有抗原結合位點(例如互補決定區或CDR)的分子，其基本上來源於非人物種的免疫球蛋白，而該分子的剩餘免疫球蛋白結構基於人免疫球蛋白的結構和/或序列。抗原結合位點可以包含融合至恆定區上的完整可變區或者僅是移植至可變結構域中的適當框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的或者經一個或多個胺基酸替代修飾的，例如修飾以使其與人免疫球蛋白更為相似。一些形式的人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有所有6個來自小鼠抗體的CDR的人源化小鼠抗體)。其它形式的人源化抗體具有一個或多個相對於原初抗體發生改變的CDR。
於此使用的「抗體介導的病變」或「抗體介導的疾病」是指免疫應答病症，其中一種或多種病理(包括症狀)與不適當的和/或非期望的抗體產生相關，更具體地由不適當的和/或非期望的抗體產生(直接或間接)引起。因為免疫應答病症是背景依賴性的，對本發明而言，「抗體介導的病變」可以包括自身免疫病，並且也可以包括移植排斥(尤其是異種移植排斥和移植物抗宿主疾病)和妊娠期間的基於Rh的排斥，其中在移植排斥中，對試圖維持外源移植組織的努力而言，免疫應答是不適當的。抗體介導的病變也包括在基因療法中與不恰當的抗體產生相關的病理。抗體介導的病變也包括對治療劑(例如治療性蛋白質)的有害的或非期望的免疫應答。這些蛋白質的例子包括幹擾素和肝素(其可以導致肝素誘導的血小板減少)。參見例如Perini(2001)Eur.Cytokine Netw.1256-61；Amiral等人(1998)血小板(Platelets)977-91。
於此可互換使用的「抗體介導的自身免疫病變」、「抗體介導的自身免疫病」或者「自身免疫病」是針對自身抗原產生了異常量抗體的免疫應答。抗體介導的自身免疫病變包括但並不限於自身免疫病，例如系統性紅斑性狼瘡(SLE)、抗體介導的血栓形成、血小板減少症(如ITP)、抗磷脂綜合症(APS)、甲狀腺炎、系統性硬皮病、多肌炎和重症肌無力。
於此使用的「自身免疫」是指針對自身抗原的免疫應答。
於此使用的「自身抗體」是指針對自身抗原的抗體。自身抗原包括但並不限於核酸(如雙鏈DNA或RNA、單鏈DNA或RNA，或者它們的任何組合)、核蛋白質(如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、著絲粒、Jo-1、組氨醯-tRNA合成酶、蘇氨醯-tRNA合成酶、PM-1、Mi-2、組蛋白和染色質)、細胞受體(例如乙醯膽鹼受體、促甲狀腺激素受體)、細胞蛋白質(例如心磷脂或β2 GPI)、RNA蛋白質複合體(例如RNP和Sm)、紅細胞和血小板糖蛋白(GP)受體複合體(例如IIb-IIIa和Ib)。
於此使用的術語「藥劑」是指生物學或化學化合物，例如簡單或複雜的有機或無機分子、肽、蛋白質、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物或抗體片斷。多種化合物可由人工合成，例如寡聚體(例如寡肽和寡核苷酸)和基於多種核心結構的合成有機化合物，這些也包括在術語「藥劑」之內。在動物中產生的或者由重組合成的或通過噬菌體展示產生的抗體也包括在術語「藥劑」之內。另外，多種天然來源可以提供供篩選的化合物，例如植物或動物提取物等等。化合物可以進行測試和/或單獨或彼此聯合使用。
「抑制或阻抑CD21/C3d介導的B細胞活化」的藥劑是指可以降低CD21/C3d介導的——由與C3d的相互作用介導的——B細胞活化程度的藥劑(即與C3d存在而藥劑不存在時CD21/C3d介導的B細胞活化程度相比，在藥劑和C3d存在的條件下CD21/C3d介導的B細胞活化程度減少)。B細胞活化的抑制可以是B細胞活性的部分減少，例如抗體產生的減少。對CD21/C3d介導的B細胞活化的抑制或阻抑可以是部分或者完全的。指示CD21/C3d介導的B細胞活化的方法為本領域所公知並於此描述。應當理解的是，「B細胞活化」包括靜息B細胞的活化、非抗體分泌B細胞的活化和已經活化的B細胞(例如漿細胞)的活化狀態的維持和/或增強。可抑制CD21/C3d介導的B細胞活化的藥劑的例子包括但並不限於，抑制CD21與C3d相互作用的抗體(可以針對CD21中與C3d天然結合的區域)、競爭性抑制劑(可以結合至C3並競爭對CD21的結合)、可溶性蛋白質、融合蛋白質、重組蛋白質和小分子。對本發明方法而言，於此描述的藥劑可以抑制或阻抑CD21/C3d介導的B細胞活化。
「幹擾C3d結合至CD21」或「阻抑C3d結合至CD21」的藥劑是指與除了不加藥劑外的相同條件相比，可以使C3d配體與CD21的相互作用程度減小的藥劑。確定C3d與CD21結合的方法在本文中公開。當恰當地施用時，「幹擾C3d結合至CD21」的藥劑可以降低抗體(如抗dsDNA抗體)的水平。
正如於此所使用的，當術語「抑制」、「阻抑」、「封閉」和「幹擾」用於指CD21和C3d之間相互作用的情況時，這些術語意味著由於可以阻礙CD21與C3d之間發生相互作用的藥劑的施用，CD21與C3d之間的相互作用從被限制到被完全封閉。「抑制」或「阻抑」CD21/C3d介導的抗體產生是指減少(可包括消除)這種抗體的產生。
「可溶性CD21」或「sCD21」於此可互換地使用，並且是指CD21的可溶(即非膜結合)形式。CD21可以利用重組技術產生或從細胞中分離(如CD21釋放)。可溶性CD21也可以以多種長度形式存在，只要能夠結合C3d即可，其可以是全長CD21的截短形式或片斷。
於此使用的「C3d」是指作為補體途徑的一部分生成的補體片斷。正如本領域所公知，血漿中存在大量的C3。作為經典補體途徑的一部分，C3被C3轉化酶轉化為C3a和C3b。iC3b是C3b的衍生物並且例如，當作為調理作用的一部分結合至病原時，其可以進一步轉變為C3dg。作為補體旁路途徑的一部分，C3通過自發裂解(有時稱為「空轉tickover」)以相當大的速率產生C3b。C3b可以與因子I相互作用，所述因子I為絲氨酸蛋白酶，其以活性形式存在於循環系統中並將C3b首先裂解成iC3b並且隨後將其進一步裂解成C3dg。C3dg可以被進一步降解產生C3d。C3d和C3dg都可以結合至CD21。應當理解，在本文中C3d和C3dg可以互換地使用。提及C3d應理解為也包括C3dg和iC3b。iC3b包括C3dg和C3d的胺基酸序列並且以相似的親合性結合CD21。iC3b經蛋白酶裂解產生C3dg。C3dg在其羧基末端具有幾個額外的胺基酸，經細胞蛋白酶裂解後生成C3d。C3d的結構為本領域公知(參見例如，Nagar，B.等人，科學(Science)1998，280，1277-1281)。C3d可以利用重組技術產生(例如利用諸如Genbank等資源中已出版的序列)或者可以從商業來源得到純化形式(Calbiochem-Novabiochem；San Diego，CA，目錄號#204870)。
於此使用的「治療」是指為獲得有益或期望結果而採取的方法，所述結果包括並優選臨床結果。對本發明而言，有益或期望的臨床結果包括但並不限於下列中的一種或多種降低抗體(如抗-雙鏈DNA抗體)產生水平(包括產生水平和/或循環水平)、緩和以下所列的與抗體介導的病變(例如自身免疫病如SLE、甲狀腺炎、異種移植排斥、重症肌無力、APS、系統性硬皮病、ITP和多肌炎)相關的一種或多種症狀、減小抗體介導的病變的程度、穩定抗體介導的病理狀況(即未惡化)、阻止抗體介導的病變的發生或復發、延緩抗體介導的病變的發展、延緩或減慢抗體介導的病理、改善抗體介導的病變、產生緩解作用(部分或全部)、減少抗體介導的病變和/或與抗體介導的病變相關的症狀的發生。
SLE的治療包括SLE的任何方面，包括但並不限於，免疫學病症(例如陽性紅斑狼瘡細胞製備、異常效價的針對天然DNA的抗-DNA抗體、抗-SM核抗原抗體、抗-β2GPI抗體)、皮疹、光過敏、口腔潰瘍、關節炎、漿膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、腎病(例如蛋白尿)、神經系統病症(例如癲癇發作或精神病)、血液病(例如溶血性貧血、白細胞減少症、淋巴細胞減少症、血小板減少症、繼發性血小板減少性紫癜)，或者狼瘡性腎炎一這是一種慢性炎性腎臟疾病。當發生狼瘡性腎炎時，可能會出現「活動(flare)」。「活動」是指活性的增加，一般指炎性活性。如果活性出現在腎臟內，那麼活動稱作「腎活動」。「腎活動」可以通過下列評價因素鑑定，其包括但並不限於蛋白尿水平、血尿水平和血清肌酸酐水平。狼瘡性腎炎的「治療」可在狼瘡性腎炎的症狀未出現時進行，並且這種治療(正如「治療」(定義)所指出的)將降低活動的發生率。「狼瘡的治療」或「SLE的治療」也包括狼瘡(例如狼瘡性腎炎)任一方面的病理學後果的減輕。
甲狀腺炎的治療包括甲狀腺炎的任一方面，其包括但並不限於，慢性炎性細胞的過度浸潤、濾泡破裂、嗜曙紅細胞過多、不同程度的增生、纖維化、無痛性甲狀腺腫和甲狀腺機能減退。與異種移植相關的抗體介導的病變的治療包括異種移植的任何方面，包括但並不限於，外源組織排斥的減少或消除、針對移植組織的抗體效價的降低和移植物抗宿主反應的減少或消除。重症肌無力的治療包括重症肌無力的任何方面，包括但並不限於，骨骼肌無力、易疲勞、不對稱上眼瞼下垂、復視、頸伸肌無力、頭下垂、由於面部肌肉和球肌無力所致的當患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構音障礙的低音量發音困難、可導致氣阻或反胃的吞咽困難，以及可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力。系統性硬皮病的治療包括系統性硬皮病的任何方面，其包括但並不限於手指和手掌的腫脹和增厚並可能累及面部，皮膚的增厚，累及軀幹和臨近肘部的臂，皮膚萎縮並可能脫髮、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性丟失；皮包骨，其中皮膚緊繃並緊結合在下面的結構上；以及有限的運動性，尤其是手指。ITP的治療包括ITP的任何方面，包括但並不限於下肢存在瘀斑、輕微臨床出血(包括紫癜、鼻衄、牙齦出血、月經過多)、脾不顯以及在幾種血小板減少症情況下嘴中血泡。多肌炎的治療包括多肌炎的任何方面，包括但並不限於，主要骨骼肌無力、相鄰肌肉無力、吸入性肺炎、間質性肺病、軟組織鈣化和雷諾氏現象。APS(也可以包括抗體介導的血栓形成)的治療包括APS的任何方面，包括但並不限於動脈閉塞、四肢壞疽、中風、心肌梗死、其它內臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內臟靜脈閉塞(如巴-希綜合症、門靜脈閉塞)、習慣性流產、血小板減少症、庫姆斯陽性溶血性貧血、網狀青斑、神經系統異常(如舞蹈症、短暫性局部缺血發作)、心瓣性心臟病以及突發性多系統動脈閉塞。
「減輕」抗體介導的病變或者一種或多種抗體介導的病變的症狀是指根據本發明利用幹擾CD21/C3d相互作用的藥劑治療的個體或個體群在抗體介導的病變的非期望臨床表現的程度和/或時程上出現減少。
抗體介導的病變的「症狀嚴重性的降低」或者「症狀的改善」是指與未施用幹擾CD21/C3d相互作用的藥劑時相比，抗體介導的病變的一種或者多種症狀得以減輕或者改善。「降低嚴重性」也包括症狀持續時間的縮短或減少。抗體介導的病變如自身免疫病(如SLE)、APS、ITP、甲狀腺炎、異種移植排斥、移植物抗宿主疾病、系統性硬皮病、重症肌無力和多肌炎的症狀描述如上並可以包括生存期(增加的總生存期作為改善的症狀)。
於此使用的對抗體介導的病變發展的「延緩」是指對抗體介導的病變發展的推遲、阻礙、延緩、延遲、穩定和/或延期。依賴於抗體介導的病變的病史和/或接受治療的個體，這種延緩可以有不同的時間長度。對本領域技術人員顯而易見的是，充分的或者顯著的延緩實際上包括預防，由此個體不發生抗體介導的病變。一種「延緩」抗體介導的病變發展的方法為當與未利用該方法相比時，在給定的期限內降低與抗體介導的病變相關的病理或症狀的發展可能性和/或在給定期限內降低疾病程度。這些比較通常(但不是必須)基於臨床研究，利用具統計意義的大量受試者進行。例如，基於這種治療可以降低個體出現一種或多種抗體介導的病變症狀的危險的觀點(無論有無臨床研究的基礎)，臨床醫師可以決定對「危險」個體使用本發明方法。
抗體介導的病變的「發展」是指個體中抗體介導的病變(如自身免疫病)的發作和/或進展。抗體介導的病變(包括自身免疫病)的發展可以利用於此所述的標準臨床技術檢測。然而，發展也指最初可能不能檢測的疾病進展。對本發明而言，進展是指疾病狀態的生物學過程，包括例如抗體(包括自身抗體)的形成。「發展」包括發生、復發和發作。於此使用的抗體介導的病變的「發作」或「發生」包括最初的發作和/或復發。
於此使用的「危險」個體是指被認為更可能發展抗體介導的病變的個體。「危險」個體可以具有或者不具有可檢測疾病，並且在利用於此描述的方法治療之前可以展示或者不展示可檢測的病症。「危險」表示個體具有一種或者多種的所謂的危險因素。具有一種或者多種的這些危險因素的個體比無這些危險因素的個體有更高可能性發展出一種或者多種自身免疫病。這些危險因素可以包括但並不限於，發展一種或者多種抗體介導的病變的家族史、既往病史、年齡、性別、種族、飲食、前病症的存在、基因(即遺傳)因素、所處環境、對SLE而言發生面頰疹和蝶形疹的病史，或者對APS而言習慣性流產的病史。另一個「危險」個體的例子是正在或者將要接受可以引起非希望抗體應答的治療劑或療法的人體。「危險」個體是適宜接受本發明方法的個體的例子。
「表位」為本領域所熟知的術語，並且是指展示出可與抗體特異性結合的任何化學部分。「表位」也可以包括抗原，即含有表位並且同樣也可特異性結合至抗體的部分或分子。
「雙鏈DNA表位」或者「dsDNA表位」是展示出可與抗-雙鏈DNA抗體特異結合的任何化學部分，並且同樣包括含有這些表位的分子。
「特異性結合」至抗體的表位是本領域所熟知的術語，並且確定這種特異性結合的方法為本領域所公知。如果與另外的細胞或者物質相比，分子能夠更頻繁、更快速、更持久地和/或以更大的親和力與特定細胞或者物質反應或者結合，那麼該分子被認為展示出「特異性結合」。如果與抗體結合至其它物質相比，抗體與靶的結合具有更大的親和力、親合性、更容易和/或更持久，那麼抗體「特異性結合」至靶。正如本領域所公知，檢測特異性結合的一種方法是競爭測定，見於此所述。
於此可互換地使用的「抗-雙鏈DNA抗體」或「抗-dsDNA抗體」或「雙鏈DNA抗體」是指特異性結合至雙鏈DNA(dsDNA)的任何抗體。類似地，於此可互換地使用的「抗-乙醯膽鹼受體抗體」或「抗-AchR抗體」是指特異性結合乙醯膽鹼受體的任何抗體。於此可互換地使用的「抗-促甲狀腺激素受體抗體」或「抗-TSH受體抗體」是指特異性結合促甲狀腺激素受體的任何抗體。「抗-Gal α1-3 Gal抗體」為在異種移植排斥中與α-半乳糖部分結合的任何抗體。應當理解，核蛋白質(如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、著絲粒、組蛋白、染色質、Jo-1、組氨醯-tRNA合成酶、蘇氨醯-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2)或細胞受體(如乙醯膽鹼受體、促甲狀腺激素受體)或者細胞蛋白質(如心磷脂)可以成為抗體的「靶」並於此將此抗體稱為「抗『靶』抗體」。另外，針對基因療法載體(如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒等等)的抗體也包括在「抗『靶』抗體」中。
正如在此處提供的「抗體」定義中所清楚地指明的，「抗-雙鏈DNA抗體」或於此所描述的任何抗體包括可以展示出該必要功能性質(即特異性結合至dsDNA)的任何片斷，例如包含可變區的片斷，如Fab片斷，並且這一原則適用於此處描述的所有抗體。正如如下所討論的，應當理解，對任何抗雙鏈DNA抗體(或功能性片斷)的特異結合是充分的。
術語「循環抗體」是指未與生物學樣品之上和/或之中它的關聯表位相結合的抗體，即游離抗體。例如，術語「循環自身免疫抗體」是指未與生物學樣品上和/或中它的關聯表位相結合的自身免疫抗體，即游離抗體。在另一例子中，術語「循環抗-雙鏈(ds)DNA抗體」是指未與生物學樣品上和/或中的雙鏈DNA表位結合的抗雙鏈DNA抗體，即游離抗體。
於此使用的術語「免疫原」是指當注射至動物體內時引起體液免疫應答的化學實體。免疫原具有B細胞表位和T細胞表位。
「T細胞表位」是指這樣的組分或其一部分，T細胞對其具有抗原特異性結合位點，其與該位點的結合將導致T細胞活化。當本發明實施方案被描述為「缺少」T細胞表位時，這表示利用本領域標準測定方法不能檢測到T細胞表位。對本發明而言，「缺少」T細胞表位的表位是指該表位缺少在待治療個體(即接受呈遞表位的效價平臺分子的個體)中引起T細胞活化的T細胞表位。例如，一個表位可能對某一或者某群個體而言缺少T細胞表位，而對其它個體而言可能具有T細胞表位。檢測T細胞表位存在的方法為本領域所公知並包括檢測T細胞增殖(如胸苷摻入)的試驗。不能統計學顯著地誘導大於本底的胸苷摻入(即利用標準的統計方法，一般p小於0.05)的免疫原一般被認為缺少T細胞表位，但應當明了，所確定的胸苷摻入量可隨所測試的免疫原的不同而不同。通常，刺激參數小於約2-3，更優選小於約1表示缺少T細胞表位。T細胞表位的存在也可以通過利用標準方法測量T細胞來源的淋巴因子的分泌來確定。T細胞表位的定位和含量(如果存在)可以通過經驗確定。應當理解，隨著時間的推移會發展出更為敏感的測定試驗來檢測T細胞表位的存在，並且對T細胞表位缺少的限定取決於所用檢測系統的類型。
於此可互換地使用的術語「多核苷酸」和「核酸」是指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸)的多聚體形式。這些術語包括單-、雙-或者三鏈DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體或者包含嘌呤和嘧啶鹼基或者其它天然的、化學、生物化學修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基的多聚體。應當理解，於此描述的雙鏈多核苷酸序列也包括於此描述的修飾物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基團(正如一般在RNA或DNA中所發現的)，或者修飾或取代的糖或磷酸基團。另外，多核苷酸的骨架可以包含合成亞單位如氨基磷酸酯的多聚體，並且因此可以形成寡聚脫氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混和的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚體。硫代磷酸酯連接可以代替磷酸二酯連接。另外，雙鏈多核苷酸還可以通過如下方式獲得自化學合成的單鏈多核苷酸產物，所述方式為合成互補鏈並在適當條件下退火，或者利用適當的引物、使用DNA聚合酶從頭合成互補鏈。以下所列為多核苷酸的非限制性例子基因或基因片斷、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質粒、載體、具任何序列的分離的DNA、具任何序列的分離的RNA、核酸探針以及引物。
正如於此所使用，「DNA」不僅僅包括A、T、C和G，也包括任何它們的類似物或這些鹼基的修飾形式，例如甲基化核苷酸、核苷酸間修飾例如不帶電荷的連接和硫代酯(thioate)、糖類似物的使用以及修飾的和/或其它的骨架結構，如聚醯胺。
「基本同源」是指序列同源，其中利用下述的一個序列比較算法或通過肉眼觀察，在比較和比對達到最大對應性時，至少50％的序列相同，優選至少60％，優選至少70％，優選至少80％，並且更優選至少90％的核苷酸或者胺基酸殘基相同。可以比較兩個序列(胺基酸或核苷酸)的全長(例如，如果它們實質上長度不同，全長是指兩者之間較短者的長度)。對序列比較而言，一般一個序列作為參考序列，測試序列與其相比較。當利用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，指定子序列座標(如果需要)，並設定序列算法的程度參數。隨後序列比較算法基於設定的程序參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分數。序列比較中的最佳比對可以通過例如Smith和Waterman，高級應用數學(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源算法，通過Needleman和Wunsch，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)48443(1970)的同源比對算法，通過Pearson和Lipman，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444(1988)的相似性檢索方法，通過這些算則的計算機化執行工具(威斯康星基因軟體包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，基因計算機組，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通過肉眼觀察(一般參見Ausubel等人，當前分子生物學實驗方法彙編(Current Protocols InMolecular Biology)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，紐約，同上)進行。當利用任何上述的算法時，針對視窗長度、空位罰分等等使用默認參數。兩個核酸序列或者多肽基本相同的另一個指針是第一多肽(例如第一核酸編碼的多肽)與第二多肽(例如第二核酸編碼的多肽)具有免疫學交叉反應性。因此，例如當兩條多肽僅僅由於保守性替代而不同時，那麼第一多肽一般基本上與第二多肽相同。
「天然存在」是指內源的化學部分，諸如碳水化合物、多核苷酸或者多肽序列，即天然所發現的物質。對天然存在的部分的加工可以在一步或者多步驟中進行，並且這些術語包括加工的所有階段。相反地，「非天然存在」的部分是指所有其它部分，例如天然不存在的物質，例如重組多核苷酸序列和非天然存在的碳水化合物。
當多核苷酸，在其原初狀態或者在利用本領域技術人員公知的方法操作後，可以轉錄和/或翻譯產生多肽或其片斷，那麼稱該多核苷酸「編碼」多肽。對本發明而言，並且為避免繁瑣地提及互補鏈，這些多核苷酸的反義(或互補)鏈也被認為編碼該序列；即，「編碼」多肽的多核苷酸序列包括常規的編碼鏈和互補序列(或鏈)。
「融合蛋白質」是指包含處於非天然位置的多個區域的多肽。這些區域可能正常存在於分開的蛋白質中而在融合多肽中被放置在一起，或者它們可能正常存在於同一蛋白質中但在融合多肽中被置於新的排列位置上。融合多肽也可以來自多聚體形式，無論是線性或是分支結構的，例如可以將抗-CD21單克隆抗體的可變區融合至用於篩選、純化或者觀測用途的標記上。
「宿主細胞」包括可以或者已經接受載體或者摻入多核苷酸和/或蛋白質的個體細胞或者細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞的後代，並且由於天然、隨機或者有意突變，該後代可以不必與原初親本細胞完全相同(在形態上或者在整套基因組DNA上)。宿主細胞包括體內轉染了本發明多核苷酸的細胞。
「轉化」或者「轉染」是指外源多核苷酸插入宿主細胞中，這與插入所使用的方法無關，所述方法例如脂轉染、轉導、感染或者電穿孔。外源多核苷酸可以以非整合載體(例如質粒)形式維持，或者可以整合進入宿主細胞基因組。
「有效量」(對於抗體介導的病變，如自身免疫病的情況)是指足以實現有益或者期望結果(包括臨床結果或延緩疾病發作)的量。有效量可以以一次或者多次施用形式施用。對本發明而言，於此描述的藥劑(或者包含藥劑的組合物)的有效量通常但不是必需為足以降低具有非期望水平的抗體(例如抗-雙鏈DNA抗體，循環抗體或者作為免疫複合體沉積的抗體)的水平的量。對治療而言，於此描述的藥劑(或者包含藥劑的組合物)的「有效量」為足以減輕、改善、穩定、逆轉、減慢或者延緩抗體介導的疾病的進展或者預防該疾病的量，所述抗體介導的疾病為如自身免疫病(如系統性紅斑狼瘡(SLE))，包括由SLE導致的進行性炎性腎變性(即狼瘡性腎炎)。對其它抗體介導的疾病例如ITP、甲狀腺炎、重症肌無力、系統性硬皮病、多肌炎和APS的治療而言，於此所述的藥劑的「有效量」是指足以減輕、改善、穩定、逆轉、減慢或者延緩這些抗體介導的疾病的一種或多種症狀的進展或者預防該疾病症狀的量，所述症狀包括但並不限於，血小板減少、血泡、慢性炎性細胞的過度浸潤、移植物抗宿主型外源組織排斥、異種移植排斥、濾泡破裂、嗜曙紅細胞過多、不同程度的增生、纖維化、無痛性甲狀腺腫、甲狀腺機能減退、骨骼肌無力、易疲勞、不對稱上眼瞼下垂、復視、頸伸肌無力、頭下垂、由於面部肌肉和球肌無力所致的當患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構音障礙的低音量發音困難、可導致氣阻或反胃的吞咽困難，以及可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力、手指和手掌的腫脹和增厚伴隨面部的可能累及，皮膚的增厚、累及軀幹和臨近肘部的臂、皮膚萎縮及可能的脫髮、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性喪失；皮包骨，其中皮膚緊繃並緊結合在下面的結構上；有限的運動性，尤其是手指；主要骨骼肌無力、相鄰肌肉無力、吸入性肺炎、間質性肺病、軟組織鈣化、雷諾氏現象的出現、動脈閉塞、四肢壞疽、中風、心肌梗死、其它內臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內臟靜脈閉塞(如巴-希綜合症、門靜脈閉塞)、習慣性流產、血小板減少症、庫姆斯陽性溶血性貧血、網狀青斑、神經系統異常(如舞蹈症、短暫性局部缺血發作)、心瓣性心臟病以及突發性多系統動脈閉塞。症狀也可以包括存活。
「分離的」或者「純化的」多肽或多核苷酸是指其基本上不含有與其天然相關的物質。所謂基本上不合有是指至少50％，優選至少70％，更優選至少80％，甚至更優選至少90％不含有與其天然相關的物質。
「生物學樣品」包括多種獲得自個體的樣品，其可以用於診斷或監測測定。該定義包括血液和其它生物學來源的流體樣品、實體組織樣品例如活檢樣本或者組織培養物或者來自上述來源的細胞，以及它們的後代。該定義也包括在獲得後經過任何方式操作的樣品，所述操作如用藥劑處理、溶解或者富集某一組分(如蛋白質或多核苷酸)。術語「生物學樣品」包括臨床樣品，並且也包括培養的細胞、細胞上清、細胞裂解物、血清、血漿、生物學流體和組織樣品。
「聯合」是指除施用一種治療模式外還施用另一種治療模式，例如向同一個體施用於此描述的藥劑及另一種藥劑(例如CD40、CTLA-4)。在另一例子中，一種抗-CD21單克隆抗體與另一具有不同序列但針對相同表位(例如SCR1和/或SCR2)的抗-CD21單克隆抗體一起施用。如上所述，「聯合」是指在一種治療模式施用於個體之前、之中或之後向該個體施用另一種治療模式。
「接受治療」包括初始治療和/或繼續治療。
「個體」為脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人。哺乳動物包括但並不限於農畜、運動動物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。
「包含」是指包括。
除非另外指明，於此使用的單數形式「a」、「an」和「the」包括複數意義。例如，抗體包括一種或多種抗體，而「症狀」是指一種或多種症狀。
發明方法對於此描述的所有方法而言，所涉及的組合物例如抑制CD21與C3d相互作用的藥劑也包括含有這些物質中的一種或多種的組合物。這些組合物還可以含有適當的賦形劑，例如藥學可接受的賦形劑(包括緩衝液)，這為本領域所公知。
通過抑制CD21/C3d介導的B細胞活化治療抗體介導的病變的方法本發明提供以產生抗體為特徵的抗體介導的病變(例如自身免疫病)的治療方法。該方法涉及抑制或者阻抑CD21/C3d的相互作用，這可以幹擾CD21介導的B細胞活化，特別是，可以幹擾能導致抗體產生的CD21/C3d介導的活化，所述抗體產生包括抗體產生和自身抗體產生。
本發明方法涉及施用抑制CD21/C3d相互作用的藥劑。將表達CD21的淋巴細胞(一般為B細胞)暴露於可抑制CD21/C3d相互作用的藥劑，由此可以抑制CD21介導的B細胞活化和抗體產生。在一些實施方案中，可以使用天然存在的CD21表達細胞(例如B細胞)。在一些實施方案中，將抑制CD21/C3d相互作用的藥劑以足夠的量施用至個體以抑制CD21/C3d介導的B細胞活化以及隨後的抗體產生，通常由此可使一種或多種症狀得以減輕和/或使疾病的發展被延緩。
可以通過幹擾CD21/C3d相互作用抑制CD21的活化作用並由此抑制CD21/C3d介導的B細胞活化和隨後的抗體產生的任何藥劑都是適宜的。可以抑制CD21/C3d相互作用並因此降低抗體產生水平(與未使用這些藥劑的抗體產生水平相比)的藥劑也是適宜的。在另一實施方案中，任何可以抑制CD21/C3d相互作用並由此延緩表達CD21的B細胞發育成分泌抗體的漿細胞的藥劑也是合適的。適用於抑制CD21/C3d相互作用的藥劑包括但並不限於抗-CD21抗體、它的衍生物或片斷，以及細胞CD21的競爭劑(例如可以結合C3d的可溶性CD21)。在一個實施方案中，該抗體針對CD21的SCR1和/或SCR2區域。適宜的藥劑及製備這些藥劑的方法的描述在文本中公開。在另一實施方案中，該藥劑為可溶性CD21分子，其可以結合至C3d並與細胞CD21競爭結合尚未結合的C3d。
應當理解，雖然推測地抗體介導的病變的症狀發展的改善和/或延緩是由於抑制B細胞活化和/或抗體產生所致，而這種藥劑的施用可以導致抗體產生的減少，但精確的機制並不需要明了。任何藥劑只要可以幹擾CD21/C3d相互作用並由此可以通過施用而有助於和/或導致這種疾病發展的改善和/或延緩，則對本發明而言都是適宜的。
CD21/C3d介導的B細胞活化可以通過本領域技術人員所公知的任何方法檢測。一種可以使用的方法是利用PCR和凝膠電泳檢測VDJ重組。另一種可以用於檢測B細胞活化的方法是利用流式細胞術和B細胞活化的指示性標誌，其包括但並不限於CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD39、CD69、CD72、CD75、CD76、CD86、CD97、CD125、CD126、CD130和CD153。
本發明使用可以抑制CD21/C3d相互作用的藥劑。對這種相互作用的抑制可以阻止B細胞活化和/或阻抑抗體產生。優選地，抗體產生被抑制、阻抑或者降低。因此，在接受治療的個體中抗體的水平可以被降低。這種方法可以用於治療個體的抗體介導的病變，例如自身免疫病(例如SLE)，其通過向個體施用抑制CD21與C3d相互作用的藥劑來進行。本方法也可用於延緩個體中抗體介導的病變例如自身免疫病(例如SLE、ITP或者甲狀腺炎)的發展。在沒有任何自身抗體出現的情況下皮疹(如蝶形疹)、易疲勞、習慣性流產、言語或微笑困難的發生可能是隨後而來的自身抗體發生的徵兆。可以在自身抗體出現之前將於此描述的藥劑施用給具有皮疹或其它與SLE相關的初期症狀的個體。於此提供的方法也可以用於阻止SLE的復發或者長期延緩與SLE相關的症狀。
可以使用幾種方法來評價對CD21/C3d相互作用的抑制。這些方法適用於多種可抑制CD21/C3d相互作用的藥劑(例如抗-CD21抗體或可溶性CD21)。一種評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是確定抗-CD21單克隆抗體與B細胞或其它表達CD21的細胞(例如來自接受該抗體治療的個體)的結合。抗體與細胞上CD21的結合可以利用結合至抗-CD21的第二抗體直接確定。第二抗體可以偶聯酶(如辣根過氧化物酶)或螢光染料例如螢光素。應當理解，第二抗體應該針對抗-CD21抗體的動物種類。例如，如果藥劑為小鼠抗-CD21單克隆抗體，那麼與觀察標誌物偶聯的第二抗小鼠IgG可以用於評價這種結合。或者，可以通過利用偶聯了酶或螢光染料的無關抗-CD21抗體測量CD21的表達來確定來自接受治療的個體的B細胞或其它表達CD21的細胞上CD21的水平。
另一種可用於評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是使用包被了C3d的ELISA培養板，將ELISA培養板接觸生物學樣品(例如B細胞或者其它表達CD21的細胞)並計數結合至ELISA培養板上的細胞的數目。在另一備選方法中，在ELISA培養板上通過比色測定(例如MTT染色)來評價活細胞表達的酶。
另一種可以使用的方法為利用抗紅細胞抗體和補體通過經典補體活化途徑利用補體片斷包被紅細胞(例如綿羊紅細胞，SRBC)。補體裝飾的SRBC可以從National Jewish Hospital的補體實驗室(Denver，CO)獲得。在不存在抗-CD21抗體的條件下混和補體包被的SRBC和表達CD21的細胞，形成「玫瑰花結」。相反，在存在抗-CD21抗體的條件下混和補體包被的SRBC和表達CD21的細胞不形成「玫瑰花結」，因為抗-CD21抗體與CD21的結合抑制了CD21結合至SRBC。這種玫瑰花結技術也可以用於評價可溶性CD21抑制CD21/C3d相互作用的能力。另一種可以使用的方法是通過補體旁路途徑的活化，使用在血清中孵育的酵母顆粒來固定補體。隨後酵母顆粒可以與表達CD21的細胞接觸並監測玫瑰花結的形成。另一種可以使用的方法是通過旁路途徑的活化或者通過與純化的補體片斷直接偶聯，用補體片段包被螢光乳膠小珠(Molecular Probes，Eagene，Oregon)。小珠與表達CD21的細胞的結合可以通過顯微鏡或者通過流式細胞術確定。
另一種可用於評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是從每一個體(在不同增加劑量)獲得生物學樣品(例如血液)，並且如果需要，通過將全血倒入綿羊紅細胞(SRBC)中從B細胞中分離出T細胞。T細胞會優先結合至SRBC上，並且T細胞-SRBC群體具有比B細胞更大的密度。利用密度離心可以從B細胞中分離T細胞-SRBC群體。隨後可以在標準ELISA中將B細胞與C3d包被的培養板接觸，如果抗-CD21抗體(或者備選地，可溶性CD21)的水平足夠封閉B細胞上的所有C3d結合區域，那麼將幾乎沒有或者完全沒有B細胞會結合至C3d包被的培養板上。
另一種可以用於評價對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是利用偶聯有可檢測標誌(例如FITC)的抗-CD21抗體。可以從接受了偶聯有可檢測標誌的抗CD21抗體的個體中獲得生物學樣品。利用流式細胞術通過在適當通道(例如對FITC而言FL1)中監測所述可檢測標誌物，並聯合第二抗體以確認抗-CD21抗體已經結合至B細胞上來觀察與B細胞的結合。一旦確認B細胞具有結合至其上的抗-CD21抗體，它們就可以與補體包被的SRBC混和並監測如上所述的「玫瑰花結」的出現。
另一種用於評價可以抑制CD21/C3d相互作用的藥劑(例如可溶性CD21或者抗-CD21抗體)對CD21/C3d相互作用的抑制的方法是競爭測定(例如Farr測定)。其它用於評價可以抑制CD21/C3d相互作用的藥劑(例如可溶性CD21或者抗-CD21抗體)對CD21/C3d相互作用的抑制的方法也可以使用並且它們為本領域普通技術人員所公知。
抗體介導的病變例如自身免疫病(例如SLE)的幾種小鼠模型可以用於測試可以抑制CD21/C3d相互作用從而在抗體介導的病變中阻抑抗體應答的藥劑(例如抗-CD21抗體或sCD21)。一種模型為自發狼瘡模型，其利用雌性紐西蘭黑×紐西蘭白(NZB×NZW)F1小鼠。另一可以使用的模型為MRL lpr/lpr自發狼瘡模型。MRL lpr/Ipr小鼠發展出與SLE人類患者相似的症狀。這些症狀包括但並不限於高效價的抗-dsDNA抗體、低補體血症、淋巴結病和致命的免疫複合體介導的腎小球腎炎。
另一個可以用於評價治療效果的動物模型是抗-DNA抗體產生的誘導模型。在這一模型中，將寡核苷酸-匙孔血藍蛋白(ON-KLH)以有效量施用至小鼠以誘導抗-dsDNA抗體的形成。實施例1公開了在小鼠模型中如何使用ON-KLH誘導抗-ON抗體。ON-KLH通過將KLH偶聯至由(CA)10-(TG)10組成的20-mer雙鏈寡核苷酸上而製成，並可以通過上述任何方法施用。施用方法包括但並不限於注射(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌內等等)。隨後可以允許小鼠產生抗-ds ON抗體，然後將一種或多種抑制CD21與C3d相互作用的藥劑(例如抗-CD21抗體或可溶性CD21蛋白質)施用給小鼠。抗-ds DNA抗體的水平可以在實驗進程的任何時間監測，其包括但並不限於在施用一種或多種抑制CD21與C3d相互作用的藥劑之前的一個或多個時間點，以及在施用一種或多種抑制CD21與C3d相互作用的藥劑之後的一個或多個時間點。
評價治療效果的其它方法也在此進行了描述。對於各種抗體介導的病變，其它本領域公認的適宜小鼠模型在實施例中描述。
抑制CD21與C3d相互作用的藥劑本發明方法涉及與CD21相互作用的藥劑的使用，所述相互作用可以抑制CD21與補體片斷iC3b、C3d和C3dg的相互作用。應當理解，在本文本中C3d和C3dg可以互換地使用。提及C3d應理解為也包括C3dg和iC3b。iC3b包括C3dg和C3d的胺基酸序列並以相似的親和力結合至CD21。iC3b被蛋白酶裂解後產生C3dg。C3dg在羧基末端具有幾個額外的胺基酸，這些胺基酸被細胞蛋白酶切除後產生C3d。
因此，本發明所期望的藥劑包括但並不限於抗-CD21抗體、融合蛋白質、可溶性蛋白質(如可溶性CD21)和重組蛋白質。
因此，一個可以利用的幹擾CD21/C3d相互作用的藥劑的例子為可溶性CD21(sCD21)蛋白質，其結合至C3d配體並與細胞CD21競爭結合尚未發生結合的C3d。優選大多數C3d被sCD21結合，由此使細胞CD21(即結合在例如B細胞和T細胞等細胞的表面的CD21)與未結合的C3d間的相互作用被抑制或者阻抑，並且使抗體產生減少或者受到抑制。sCD21可以通過公開在Hebell等人(1991)科學(Science)254102或者WO91/16437上的方法獲取，這些方法在下文描述。
在一些實施方案中，藥劑可以是抗-CD21抗體，例如人或者人源化抗體。一個可以使用的抗-CD21抗體的例子是結合至CD21中與C3d天然結合的區域的抗體。短共有區域1和2為這種區域的例子。在一個實施方案中，藥劑為結合至人CD21的短共有區域1(SCR1)和SCR2的小鼠抗-人抗體。在另一實施方案中，藥劑為結合至人CD21的短共有區域1(SCR1)和短共有區域2(SCR2)的人源化抗體。在另一實施方案中，藥劑為結合至人CD21的短共有區域1(SCR1)和SCR2的人抗體。在再一實施方案中，藥劑為結合至SCR1或其部分的抗體。在另一實施方案中，藥劑為結合至SCR2或其部分的抗體。
抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片斷(例如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv、Fc等等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、它們的突變體、含有抗體部分的融合蛋白質、人源化抗體，以及任何其它修飾構型的含有具所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子。抗體可以是小鼠、大鼠、人或者任何其它來源的。對本發明而言，抗體以抑制人CD21與C3d相互作用並且可以阻抑CD21/C3d介導的B細胞活化和隨後的抗體產生的方式與人CD21反應。在一個實施方案中，抗體為識別人CD21上可與C3d結合的一個或多個表位的小鼠或者大鼠抗體。表位可以是連續或者不連續的。抗體可以針對的表位的例子包括但並不限於短共有區域1和2(SCR1和/或SCR2)。如果需要，結合至SCR1和/或SCR2的抗體(例如大鼠單克隆抗體7G6，其針對小鼠CD21)可以按照Kinoshita等人(1988)免疫學雜誌(J.Immunol.)1403066方法獲取，並且可以在適當的、本領域公認的小鼠疾病模型中使用。在另一方面，抑制CD21與C3d相互作用(例如對CD21的SCR1和/或SCR2表位具特異性)的抗體(例如人、人源化、小鼠、嵌合的)可以通過利用表達CD21的免疫原製備。一個免疫原的例子為具有高的CD21表達的細胞，例如Raji細胞，其可以從ATCC獲取(登錄號#CCL-86)。另一個可以使用的免疫原的例子為含有CD21的SCR1和/或SCR2部分的可溶性CD21融合蛋白質。CD21的SCR1和/或SCR2部分可以與重鏈IgG相融合，例如象公開在WO 91/16437中的那樣。Raji細胞或者CD21融合蛋白質可以單獨使用或者彼此聯合使用作為免疫原。
在另一方面，可以使用的結合至人CD21(具體地，結合至SCR1和/或SCR2)的抗體為小鼠抗-人單克隆抗體(mAb)2B12。mAb 2B12按照實施例6-11的描述生成並鑑定。已經證明mAb 2B12可以破壞CD21和C3d之間的相互作用(實施例7)。按照布達佩斯條約，產生mAb 2B12的雜交瘤已經在2002年5月15日被保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas VA 20110-2209)，保藏號為——。本發明提供這一雜交瘤或者它的任何子代(其可能與保藏的雜交瘤相同或者不相同)。
因此，本發明提供下述的任何一項(或者含有下述任何一項的組合物，包括藥物組合物)(a)抗體2B12；(b)由上述雜交瘤產生的抗體；(c)抗體2B12的人源化形式；(d)由上述雜交瘤產生的抗體的人源化形式；(e)包含抗體2B12輕鏈和/或重鏈可變區的抗體；(f)包含由上述雜交瘤產生的抗體的輕鏈和/或重鏈可變區的抗體；(g)包含2B12的輕鏈和/或重鏈CDR的抗體；(h)包含由上述雜交瘤產生的抗體的輕鏈和/或重鏈CDR的抗體。抗體的人源化形式可以具有或不具有與2B12或者與上述雜交瘤產生的抗體相同的CDR。CDR區域的確定為本領域技術人員所公知。在一些實施方案中，本發明提供包含至少一個CDR的抗體，所述CDR與2B12或者由上述雜交瘤產生的抗體的至少一個CDR、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個CDR基本同源(或者，在一些實施方案中與2B12的所有6個CDR基本同源)。其它實施方案包括具有至少2個、3個、4個、5個或者6個CDR的抗體，所述CDR與2B12或者由上述雜交瘤產生的抗體的至少2個、3個、4個、5個或6個CDR基本同源。應當理解，對本發明而言，結合特異性和/或總體活性(可以就抗體產生的阻抑和/或一種或多種症狀的改善而言)通常會得以保持，但與2B12相比活性程度可能不同(可能更大或者更小)。本發明也提供製備這些抗體的方法。製備抗體的方法為本領域公知並將在本文中描述。
免疫宿主動物的途徑和時間表一般與已建立的用於抗體刺激和產生的常規技術相一致。
根據預期，任何哺乳動物對象(包括人)或者由其來源的產生抗體的細胞都可以通過操作而作為哺乳動物(包括人)雜交瘤細胞系產生的基礎。一般地，給宿主動物腹膜內接種足以引起免疫原應答的量的免疫原，例如Raji細胞或者SCR1/SCR2融合蛋白質，並且隨後利用相似量的免疫原加強免疫。在最後一次加強後收集宿主的淋巴樣細胞(優選脾淋巴樣細胞)並且利用其製備細胞懸液用於融合。
雜交瘤可以利用通常的體細胞雜交技術從淋巴細胞和永生化骨髓瘤細胞製備，所述體細胞雜交技術為Kohler，B.和Milstein，C.(1975)自然(Nature)256495-497公開或者如Buck，D.W等人(1982)體外(InVitro)18377-381所改良。可以在雜交中使用現有的骨髓瘤細胞系，包括但並不限於X63-Ag8.653以及那些來自Salk Institute，Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.，USA的細胞系。通常，該技術涉及利用融合劑例如聚乙二醇，或者利用本領域技術人員已知的與電有關的方法融合骨髓瘤細胞和淋巴細胞。經融合後，將細胞從融合培養基上分離，並在選擇生長培養基(例如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養基)上生長以淘汰未雜交的親本細胞。於此描述的培養基(無論其補充血清與否)都可以用於培養分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細胞融合技術的另一替代方法，EBV永生化B細胞可以用於產生本發明的抗-CD21單克隆抗體。將雜交瘤擴大並，如果需要，亞克隆，之後利用常規的免疫測定方法測定上清中的抗-免疫原活性，所述方法例如放射免疫測定、酶免疫測定或者螢光免疫測定。
可以作為抗體源使用的雜交瘤包括親本雜交瘤的所有衍生物、子代細胞，它們將產生抗原特異性單克隆抗體，這些抗體具有用於免疫的細胞類型的特徵。
產生這些抗體的雜交瘤可以利用已知的方法在體外或者體內生長。如果需要，單克隆抗體可以從培養基或者體液中分離，分離手段可以為常規的免疫球蛋白純化方法，例如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、層析和超濾。如果存在非期望的活性，那麼可以通過例如將製備物過由連接至固相上的免疫原製成的吸附劑並從免疫原上洗脫或者釋放所需抗體而除去這些活性。利用Raji細胞或者SCR1/SCR2融合蛋白質免疫宿主動物可以產生抗體(例如單克隆抗體)群。
如果需要，可以測序目的抗-CD21抗體(單克隆或多克隆)，並且可以隨後將該多核苷酸序列克隆入載體用於表達或者擴增。編碼目的抗體的序列可以在宿主細胞的載體中保持，並且隨後宿主細胞可以進行擴大培養並凍存以備將來使用。在備選方案中，多核苷酸序列可以用於基因操作以使抗體「人源化」或者改善抗體的親和力或者其它特性。例如，如果抗體用於臨床試驗和人的治療，則可以改造恆定區域使其與人恆定區域更相似以避免免疫應答。可能期望通過基因操作抗體序列獲得對SCR1和/或SCR2的更大親和力。對本領域技術人員顯而易見的是，可以對抗-CD21抗體進行-個以上的多核苷酸改變，而仍使其保維持對SCR1/或SCR2區域或者CD21的表位的結合能力。
單克隆抗體的人源化有4個一般步驟。它們是(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變區的核苷酸和推測的胺基酸序列；(2)設計人源化抗體，即決定在人源化過程中使用哪一抗體框架區域；(3)實際的人源化方法學/技術，以及(4)人源化抗體的轉染和表達。參見例如美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
現已描述了多種含有來自非人免疫球蛋白的抗原結合位點的「人源化」抗體分子，包括具有與人恆定區融合的嚙齒類或修飾的嚙齒類V區和它們的相關互補性決定區(CDR)的嵌合抗體。參見例如Winter等人，自然(Nature)349293-299(1991)，Lobuglio等人，美國國家科學院院報(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)864220-4224(1989)，Shaw等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)1384534-4538(1987)以及Brown等人，癌症研究(Cancer Res.)473577-3583(1987)。其它參考文獻描述了在與適當的人抗體恆定區融合之前嫁接至人支持構架區(FR)上的嚙齒類CDR。參見例如Riechmann等人，自然(Nature)332323-327(1988)，Verhoeyen等人，科學(Science)2391534-1536(1998)，以及Jones等人，自然(Nature)321522-525(1986)。另一參考文獻描述了被重組鑲飾的嚙齒類構架區所支持的嚙齒類CDR。參見例如歐洲專利出版號519,596。
這些「人源化」分子設計以最小化針對嚙齒類抗-人抗體分子的非期望免疫學應答，所述應答將限制這些部分在人類受者中的治療應用持續時間和效力。其它也可以使用的人源化抗體的方法公開在Daugherty等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，192471-2476(1991)和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
另一方面，完全人抗體可以通過利用已被改造表達特異人免疫球蛋白的商業化小鼠獲得。設計以產生更合乎期望的(例如完全人抗體)或者更強的免疫應答的轉基因動物也可用於產生人源化或者人抗體。這種技術的例子有Abgenix公司(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex公司(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TC MouserM。
或者，抗體可以利用本領域任何已知的方法通過重組技術製備和表達。抗體的重組製備方法為首先分離宿主動物產生的抗體，獲得它的基因序列，並利用此基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表達抗體。可供使用的另一方法為在植物(例如菸草)或者轉基因奶中表達抗體序列。在植物或者轉基因奶中表達抗體序列的方法已經公開。參見例如Peeters等人(2001)疫苗(Vaccine)192756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)國際免疫學評論(Int.Rev.Immunol.)1365；和Pollock等人(1999)免疫學方法雜誌(J Immunol Methods)231147。製備抗體衍生物(例如人源化、單鏈等等)的方法為本領域技術人員所公知。另外，抗體可以通過噬菌體展示技術重組製備。參見例如美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter等人免疫學年評(Annu.Rev.Immunol.)(1994)12433-455。
通過免疫宿主動物或者重組技術製備的抗體應展現下列的所有特徵(a)結合CD21；(b)結合CD21中可與C3d結合的一個或多個表位；(c)結合CD21以抑制CD21/C3d介導的B細胞活化；(d)結合CD21以抑制CD21/C3d介導的B細胞活化並降低抗體產生的水平。
也可以使用免疫測定和流式細胞分選技術例如螢光激活細胞分選術(FACS)來分離對CD21特異且更優選對CD21的SCR1和/或SCR2表位特異的抗體。例如，可以使用C3d包被的和可溶性CD21包被的培養板進行ELISA來確定對CD21的C3d結合部分(即SCR1和/或SCR2)具特異性的抗體。流式細胞術可以用於評價抗體與CD21表達細胞或細胞系的結合程度，上述CD21表達細胞包括但並不限於B細胞，所述細胞系例如Raji。或者，抗體可以通過與B細胞群相混和並隨後將B細胞暴露於分離形式(例如C3d包被的培養板)或者天然形式(例如，存在血清中)的C3d源而篩選。流式細胞術和B細胞活化指示性標誌可以用於檢測抗-CD21抗體抑制B細胞活化的情況，所述B細胞活化指示性標誌包括但並不限於CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD39、CD69、CD72、CD75、CD76、CD86、CD97、CD125、CD126、CD130和CD153。
抗體可以結合至許多不同的載體上。載體可以為活性的和/或者惰性的。為人所熟知的載體的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、玻璃、天然和改性的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵礦。對本發明而言，載體的性質可以為可溶或不溶的。本領域技術人員知道或能利用常規試驗確定用於結合抗體的其它適宜載體。
抗體也可以偶聯至可檢測試劑上。複合體可以用於檢測樣品中與抗體特異結合的抗原，這可以利用如Harlow和Lane(1988)(上述引文)所描述的標準免疫化學技術，例如流式細胞術或者免疫組化進行。可檢測標誌也可以用於確定對細胞類型(例如B細胞)的結合特異性，方法是利用可檢測標誌與另一明確的B細胞標誌(例如CD19、CD20、CD22等)並通過FACS分析染色模式。多種不同的標記物和標記方法為本領域技術人員所公知。可以在本發明中使用的標記物類型的例子包括放射性同位素、酶、膠體金屬、螢光化合物(例如FITC、PE、PECy5、APC等)、生物發光化合物和化學發光化合物等等。本領域技術人員將知道或者能夠利用常規試驗確定用於結合抗體的其它適宜標記物。此外，這些標記物與本發明抗體的結合可以利用對本領域普通技術人員而言一般的標準技術完成。
藥劑的施用可以使用藥劑(例如抗體或其片斷)的各種製劑形式來給藥。在一些實施方案中，藥劑(例如抗-CD21抗體或其片斷)可以單獨施用。在一些實施方案中，藥劑含有抗-CD21抗體或其片斷和藥學可接受的賦形劑，並且可以為各種製劑形式。藥學可接受賦形劑為本領域所公知，並為有利於藥理有效物質施用的相對惰性物質。例如，賦形劑可以賦予形狀或者稠度，或者作為稀釋劑使用。合適的賦形劑包括但並不限於穩定劑、溼潤和乳化劑、針對不同摩爾滲透壓濃度的鹽、包囊劑、緩衝液和皮膚穿透增強劑。賦形劑以及用於腸胃外和非腸胃外藥物遞送的製劑在Remington，Science and Practice of pharmacy，第20版，Mack出版公司(2000)中列出。
通常，這些藥劑配製用於注射施用(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌內等等)。因此，這些藥劑優選與藥學可接受載體如鹽、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等等混和使用。具體給藥方案(即劑量、時機和重複)將依賴於特定個體和該個體的病史。經驗考慮因素(例如半衰期)通常將有助於劑量的確定。施用頻度可隨治療進程確定和調整，並且一般(但不是必須)基於對抗體產生減少的維持和/或對一種或者多種症狀的阻抑/改善/延緩。其它適當的給藥時間表可以為每天連續輸注或者每周3次給藥，或者每周一次給藥，或者每2到4周一次給藥，或者每月一次給藥或者更小的頻度，這取決於接受治療的個體或者抗體介導的疾病的狀況。可能需要重複施用來獲得和/或維持對CD21/C3d相互作用的阻抑狀態從而治療抗體介導的病變例如自身免疫病(例如SLE)，其中重複給藥的時間安排通常基於B細胞周轉速率來確定。或者，藥劑的持繼緩釋製劑可能是適宜的。用於獲得緩釋的多種製劑和裝置為本領域公知。
備選地，可以對具有抗體介導的病變如自身免疫病(例如SLE)家族史的個體，相應地調整給藥方案以延緩抗體介導的病變的發展。在這種情況下，應當考慮平衡有效劑量和由可能毒性所致的副作用。
在一個實施方案中，對已經接受過一次或者多次抑制CD21/C3d相互作用的藥劑施用以治療抗體介導的病變如自身免疫病(例如SLE)的個體而言，藥劑的劑量可以由經驗確定。可以給予個體增加的藥劑劑量，所述藥劑抑制CD21/C3d相互作用，例如抗-CD21抗體。從施以不同增加劑量的每一個體中獲得生物學樣品(例如血液)並且(如果需要)通過將全血加入到綿羊紅細胞(SRBC)中將T細胞從B細胞中分離。T細胞優先結合SRBC並且T細胞-SRBC群比B細胞具有更大的密度。利用密度離心可以從B細胞中分離T細胞-SRBC群。隨後可以在標準ELISA中將B細胞與C3d包被的培養板接觸，如果抗-CD21抗體的水平足夠封閉B細胞上的所有C3d區域，那麼將幾乎沒有或者完全沒有B細胞結合至C3d包被的培養板上。或者，可以將補體包被的SRBC用在如上所公開的玫瑰花結測定中。在另一替代方案中，也可以通過例如FACS監測接受治療的個體的細胞表面上CD21的喪失。CD21的喪失可因施用一種或者多種本文公開藥劑進行治療後細胞表面上CD21的下調引起或者因CD21的脫落而發生。參見例如Fremeaux-Bacchi等人(1999)免疫藥理學(Immunopharmacology)4231。
對本領域技術人員顯而易見的是，劑量可以隨個體、抗體介導的病變的階段和個體內B細胞組成的不同而不同。此外，按佔整體淋巴細胞的百分數計具有較多B細胞組成的個體比具有低比例B細胞的個體可能需要更高的劑量。出現SLE症狀(例如抗-dsDNA抗體或者抗β2GPI抗體(它們也在具有APS或者抗體介導的血栓形成的個體中出現))的個體與具有低或者無抗-dsDNA抗體水平的個體相比可能需要更高劑量的抑制CD21/C3d相互作用的藥劑。
其它製劑包括本領域公知的適當的遞送形式，其包括但並不限於載體，例如脂質體。Mahato等人(1997)藥理學研究(Pharm.Res.)14853-859。脂質體製劑包括但並不限於細胞轉染劑、多層脂質體和單層脂質體。
在一些實施方案中，存在一種以上的藥劑，例如抗體。這些藥劑可以彼此相同或者不相同。這些藥劑可以含有至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同的抗體。抗-CD21抗體可以與一種或者多種針對B細胞表面蛋白質具反應性的抗體混和，所述表面蛋白質包括但並不限於CD19、CD20、CD23、CD28、CD38、CD40、CD45、CD45R或CD81。在一個實施方案中，B細胞表面蛋白質為B細胞活化或者B細胞成熟中涉及的蛋白質。B細胞的成熟可以指B細胞發育的任何階段。在一個實施方案中，抗體為針對活化途徑(例如CD19和CD81)的抗體的混合物。在另外的實施方案中，抗體為針對發育過程中的特異B細胞群(例如未成熟B細胞、成熟的幼稚B細胞、淋巴母細胞、記憶B細胞或者漿細胞)的抗體的混合物。在另一實施方案中，抗-CD21抗體與可以和T淋巴細胞表面蛋白質反應的抗體混和，所述表面蛋白質參與輔助B細胞活化和/或成熟。這些蛋白質的例子包括但並不限於CD40配體，CD152(CTLA4)和CD28。正如在本領域中常常指出的，抗體的混合物可能對於治療更廣範圍的個體群是尤其有用的。應當理解，個體中任何B細胞群體都含有處於不同發育時期的未成熟、部分成熟和成熟B細胞的混合物。與使用僅僅一種(或者比「雞尾酒」中含有的種類少)抗體相比，抗-CD21抗體與其它抗淋巴細胞蛋白質的聯合也可能更為有效。
在一些實施方案中，該方法涉及施用藥劑(其可以是抗體)並與另一治療方法或者治療模式相聯合。在一些實施方案中，所述其它療法不同於基於CD21的療法(即此額外的療法不影響CD21/C3d相互作用)。因此，本發明提供了這樣的方法，該方法還包括施用另一或額外治療(或治療劑)，該額外治療(式治療劑)可以包括一種或多種額外治療(治療劑)。額外治療(或治療劑)可以是任何可用於治療抗體介導的病變的形式(包括藥劑或者其它治療，例如放療)。例如，可以向同一個體施用一種或者多種免疫抑制劑以及適用於狼瘡的藥劑，所述免疫抑制劑為例如皮質類固醇環磷醯胺免疫抑制劑。例如對免疫抑制療法而言，可以施用一種或者多種額外的治療劑，並且這些聯合療法為本領域公知。環磷醯胺(以及其它免疫抑制劑)的施用(包括製劑、給藥等等)為本領域公知。這種聯合可以降低對往往具有不良副作用的其它治療劑的需要(例如更少的施用和/或給藥頻率)。相反，由於基於CD21的療法的保護作用，這些聯合療法也可以允許更高的劑量。
評價療效的方法療效的評價可以在幾種不同的水平進行。評價可以通過監測臨床病徵(例如與抗體介導的病變(如SLE、ITP或甲狀腺炎)相關的症狀)、細胞應答(例如抗體分泌)或者一種或多種細胞內的分子變化(例如B細胞活化標誌)進行。對抗體介導的病變的治療的各種測量的例子已經在上文中進行了討論。
對抗體介導的病變例如自身免疫病的治療療效的檢測與測量通常基於對自身抗原引起的自身免疫應答水平和/或其它與自身免疫疾病相關的症狀的檢測與測量。自身免疫應答水平可以由針對自身抗原的抗體效價來反映。優選地，與利用本發明一種或多種藥劑治療前相比，利用本發明一種或多種藥劑治療後針對自身抗原的抗體效價降低。在SLE的情況中，對抗-雙鏈DNA(抗-dsDNA)抗體、抗-SM核抗原抗體、抗-β2GPI抗體(其也出現在具有APS或者抗體介導的血栓症的個體中)和/或SLE相關臨床症狀的測量(上述為本領域所公知)可以用作療效的測量。抗-dsDNA抗體水平的測量可以通過在臨床情況下常規使用的測試(例如Farr測試或ELISA)來完成。其它SLE相關症狀的例子包括但並不限於面頰疹、盤狀疹、蝶形疹、光敏感口腔潰瘍、關節炎、漿膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、腎病(例如蛋白尿)、神經系統病症(例如癲癇發作或精神病)、血液病(例如溶血性貧血、白細胞減少症、淋巴細胞減少症、血小板減少症)和狼瘡性腎炎。狼瘡性腎炎(腎小球性腎炎或者腎發炎)以腎功能的進行性喪失並最後導致腎衰竭為特徵。狼瘡性腎炎的特徵為血尿、尿量減少、血尿氮水平升高、血清肌酸酐水平升高、高血壓和蛋白尿。因此，這些參數可以作為監測腎變性的手段。
對甲狀腺炎而言，療效的確定可以包括但並不限於測量針對促甲狀腺激素受體的抗體效價水平和甲狀腺炎相關症狀的改善或者減輕，上述症狀包括但並不限於慢性炎性細胞的過度浸潤、濾泡破裂、嗜曙紅細胞過多、不同程度的增生、纖維化、無痛性甲狀腺腫和甲狀腺機能減退。
對ITP而言，療效的確定可以包括但並不限於測量血小板水平、臨床出血(例如紫癜、鼻血醜、齒齦出血或者月經過多)的改善、血泡和下肢瘀斑的消散。
對異種移植而言，療效的確定可以包括但並不限於測量針對移植(即異種)組織的抗體效價水平、移植物抗宿主應答的減少或消失，和移植組織排斥的排斥減輕(例如壞死組織的減少或者消失)，這可由本領域技術人員確定。
對APS(也可以包括抗體介導的血栓症)而言，療效的確定可以包括但並不限於測量針對抗磷脂、心磷脂或者β2-GPI抗體效價的水平。另外，與APS相關的非限制性症狀包括動脈閉塞、四肢壞疽、中風、心肌梗死、其它內臟梗死、靜脈閉塞、外周靜脈閉塞、內臟靜脈閉塞(如巴-希綜合症、門靜脈閉塞)、習慣性流產、血小板減少症、庫姆斯陽性溶血性貧血、網狀青斑、神經系統異常(如舞蹈症、短暫性局部缺血發作)、心瓣性心臟病以及突發性多系統動脈閉塞。
對重症肌無力而言，療效的確定可以包括但並不限於測量針對乙醯膽鹼受體的抗體效價水平和與重症肌無力相關的症狀的改善或減輕，所述症狀包括但並不限於可引起行走、爬梯或搬運物體困難的骨骼肌無力、易疲勞、不對稱上眼瞼下垂、復視、頸伸肌無力、頭下垂、由於面部肌肉和球肌無力所致的當患者試圖微笑時的面部扭曲、鼻的或構音障礙的低音量發音困難、可導致氣阻或反胃的吞咽困難。
對系統性硬皮病而言，療效的確定可以包括但並不限於測量針對核蛋白質如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70和著絲粒的抗體效價水平。另外，與系統性硬皮病相關的症狀包括但並不限於手指和手掌的腫脹和增厚並可能累及面部，皮膚的增厚、累及軀幹和臨近肘部的臂。皮膚萎縮並可能脫髮、脫皮脂腺和汗腺；皮膚柔韌性喪失；皮包骨，其中皮膚緊繃並緊結合在下面的結構上；以及有限的運動性，尤其是手指。
對多肌炎而言，療效的確定可以包括但並不限於測量針對核蛋白質如Jo-1、組氨醯RNA合成酶、蘇氨醯-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2的抗體的效價水平。另外，與多肌炎相關的症狀包括但並不限於主要骨骼肌無力、相鄰肌肉無力、吸入性肺炎、間質性肺病、軟組織鈣化和雷諾氏現象。
一般地，測量適當的抗體效價(依賴於疾病種類)對監測疾病狀況以及合適的劑量是合適的。對本發明而言，一種或者多種症狀得以改善(如果適當，包括疾病事件的發生和頻度)和/或延緩。
藥劑盒本發明提供實現本發明方法的藥劑盒。因此，本發明提供適當包裝的多種藥劑盒。藥劑盒可以用于于此描述的任何一種或者多種用途，並且相應地可以含有用於任何一種或多種下列用途的說明書，所述用途為治療抗體介導的病變；延緩抗體介導的病變的發展。
本發明藥劑盒包含一個或多個容器，容器中含有於此描述的任何一種藥劑，例如抗體。每一組分(如果存在一種以上組分的話)可以分別包裝在不同容器中，或者在交叉反應性和保存期所允許的情況下，一些組分可在一個容器中混和。
本發明藥劑盒可以任選地包括一套與本發明方法中各組分的使用相關的說明書，儘管含有說明書的電子存貯介質(例如磁碟或光碟)是可以接受的，但一般包括書寫的說明書。包含在藥劑盒中的說明書一般包括有關組分以及將它們施用給個體的信息。
提供下述實施例用於闡釋而並不是限制本發明。
實施例實施例1 使用sCD21降低抗-dsDNA抗體的水平利用模式T細胞依賴型抗原致敏C57/B6小鼠，上述模式T細胞依賴型抗原為以3.8摩爾寡核苷酸/摩爾KLH的比例偶聯至由(CA)10-(TG)10組成的20-mer雙鏈寡核苷酸上的匙孔血藍蛋白(KLH)(ON-KLH)。
將小鼠取血並隨後腹膜內施用50μg明礬沉澱的ON-KLH連同作為另外佐劑的2×109個處死的百日咳博德特氏桿菌(B.Pertussis)生物體進行免疫。14天後，腹膜內施用10μg ON-KLH對小鼠加強免疫。在加強免疫時，小鼠靜脈內接受300μg可溶性CD21(sCD21；Hebell等人(1991)科學(Science)254102)並腹膜內接受300μg的sCD21。對照小鼠接受PBS。隨後的3天，小鼠每天靜脈內接受300μg的sCD21或PBS。
在加強免疫後7天將小鼠取血並利用偶聯至牛血清白蛋白的ON通過ELISA測量血清中對ON特異的IgG水平。通過與標準的免疫小鼠血清庫比較以適宜單位確定針對ON的抗體濃度。如表1和圖1所示，利用sCD21處理顯著減少抗ON的IgG水平(p＝0.02，Mann-Whitney U檢驗)。
表1致敏後(u/ml，前)和加強免疫加利用PBS或sCD21處理後7天(u/ml，後)小鼠中抗-ON的IgG水平。

與PBS處理組相比，sCD21處理組中抗體平均水平下降64％。
實施例2 使用抗-CD21抗體降低抗-dsDNA抗體的水平利用模式T細胞依賴型抗原致敏BALB/c小鼠，上述模式T細胞依賴型抗原為以3.8摩爾寡核苷酸/摩爾KLH的比例偶聯至由(CA)10-(TG)10組成的20-mer雙鏈寡核苷酸上的匙孔血藍蛋白(KLH)(ON-KLH)。
將小鼠取血並隨後腹膜內施用50μg 明礬沉澱的ON-KLH連同作為另外佐劑的2×109個處死的B.Pertussis生物體進行免疫。10周後，將小鼠取血並利用PBS或者200μg大鼠單克隆抗體7G6靜脈內處理。大鼠單克隆抗體7G6(IgG2b抗-小鼠CD21抗體)描述在Kinoshita等人(1988)免疫學雜誌(J.Immunol.)1403066中。24小時後，腹膜內施用10μgON-KLH對小鼠加強免疫。ON特異性IgG抗體的測量在加強免疫後14天利用針對ON的ELISA進行。在這一實驗中，在加強免疫前小鼠具有顯著的IgG抗-ON抗體水平，因此處理效果通過比較加強前後IgG抗-ON抗體比例確定。利用單克隆抗體處理顯著減少IgG抗-ON抗體水平(p＝0.03，Mann-Whitney U檢驗)。數據顯示在表2並在圖2中繪出。

與PBS處理組相比，抗體處理組中後/前抗體水平比率下降45％。實施例3A使用抗-CD21抗體降低狼瘡自發模型中抗-dsDNA抗體的水平NZB/WF1(H-2d/z)小鼠株系提供了研究控制狼瘡自身免疫發作的複雜機制的自身免疫模型。該動物為NZB/B1NJ雌性和NZW/LacJ雄性小鼠的F1雜交後代，並且它們獲得自Jackson實驗室(Bar Harbor，Maine)。該小鼠發展出一種未知來源的慢性炎性疾病，其可以被遺傳因子強烈的影響。自身免疫反映在高水平的循環抗-核抗體(包括抗雙鏈DNA抗體)；針對RNA-蛋白質複合體(例如RNP和Sm)、ssDNA、組蛋白、染色質、紅細胞和心磷脂的自身抗體；免疫複合體形成並在腎中沉積導致蛋白尿；以及進行性腎小球性腎炎。
由於雌性小鼠比雄性小鼠具有高得多的疾病發生率和嚴重性，因此本研究利用雌性動物進行(對雌性而言平均生命期為約35周，而雄性為約1年，根據Jackson實驗室)。
每一研究由處於疾病不同階段的動物組組成(詳見下述)，並包括(1)未接受處理(鹽水)的對照組，(2)接受同種型對照抗體的對照組，和(3)接受測試藥劑(單獨或彼此聯合)的測試組。
在4至6月齡之間時，根據蛋白尿監測確定的疾病階段將小鼠分為4個研究組。這些疾病階段如下所述·疾病發作前＝無·1+＜30mg/dl(輕微)·2+＜100mg/dl(嚴重)·3+＞100mg/dl(後期)利用大鼠IgG2b抗-小鼠CD21抗體(7G6)或者大鼠IgG2b同種型對照(Kinoshita等人(1990)Int.Immunol.2651-659)處理動物。或者，使用可溶性CD21-Ig融合蛋白質或者小鼠IgG1對照(Hebell，T.等人(1991)科學(Science)254102-105)。環磷醯胺也用於一般的免疫抑制並測試與這些抗體的協同作用。
每一組(每組最少10隻小鼠)中，小鼠利用下述方案之一處理1.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用抗-CD21 500μg。
2.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用CD21-Ig 500μg。
3.每周(第7天)腹膜內施用環磷醯胺1mg。
4.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用大鼠IgG2b 500μg。
5.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用小鼠IgG1 500ug。
6.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用鹽水。
7.聯合1和3。
8.聯合2和3。
經處理後，每周對小鼠取血用於確定抗-dsDNA和抗-β2 GPI抗體效價以及針對RNA-蛋白質複合體(例如RNP和Sm)、ssDNA、組蛋白、染色質、紅細胞和心磷脂的自身抗體的效價。此外每周評估蛋白尿的水平以監測自身免疫病的進展。
可以使用幾種測定方法確定自身免疫病的發作或進展。以下為所使用的測定法1)抗-dsDNA ELISA。動物血清中抗-雙鏈DNA抗體的效價利用固相ELISA確定。
2)抗-RNP、抗-Sm、抗-ssDNA、抗-組蛋白、抗-染色質、抗-紅細胞和抗-心磷質抗體的效價利用ELISA確定。
3)腎病。蛋白尿通過利用商業化的量杆(Ames Uristix；BayerDiagnostics，目錄號2184，Tarrytown，NY)測量。
4)抗-β2糖蛋白I(β2GPI)ELISA。針對β2GPI的抗體的效價利用固相ELISA確定。
5)存活。監測實驗動物的存活率。
實施例3B 利用抗-CD21抗體的動物研究在18周齡時對60隻雌性(NZB)×(NZW)F1小鼠取血，並且利用標準ELISA測定法測量針對雙鏈(ds)DNA的血清抗體效價，所述測定使用鮭魚精子DNA(Calbiochem，San Diego，CA)作為底物。將小鼠隨機分成4組，每組13到15隻，由此每一組包含具有類似血清抗-DNA抗體水平的小鼠。隨後使動物開始接受下述4種處理方案之一A)無處理B)每周以40mg/kg的劑量單次腹膜內注射施用溶於無菌磷酸緩衝鹽水中的環磷醯胺(第3天)。
C)每周單次腹膜內注射施用溶於無菌磷酸緩衝鹽水中的250μg大鼠IgG2b κ抗-小鼠CD21 mAb 7G6(第7天)。
D)腹膜內注射上述劑量的環磷醯胺(第3天)和7G6(第7天)。
處理僅僅在18到36周齡之間進行。在這期間，對小鼠每2周分析一次來確定體重、蛋白尿水平、血細胞比容和血清抗-dsDNA抗體濃度。另外，每天監測動物的痛苦跡象並對垂死的動物實施安樂死。
每一處理對存活的影響顯示在Kaplan-Meier曲線中(圖4)。與未處理相比，單獨注射抗-CD21 mAb並不延長存活，而單獨注射免疫抑制劑環磷醯胺卻能延長。在同時接受環磷醯胺和mAb 7G6的動物組中觀察到對延長存活最顯著的影響。
與對照小鼠(未處理)或者單獨利用環磷醯胺處理的小鼠相比，抗-CD21(7G6)處理對總抗-dsDNA抗體濃度無影響(無論是單獨施用還是與環磷醯胺聯合施用)。
實施例4 利用單克隆抗-CD21抗體7G6對α1，3-半乳糖基轉移酶敲除小鼠中gal α1-3gal的抗體的抑制α1，3-半乳糖基轉移酶敲除小鼠(Thall等人，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)(1995)27021437-21440)(GalT KO)不能合成Gal α1-3 Gal雙糖(雙半乳糖)，並且這與人、猿、舊大陸猴相似，因為它們自發形成識別末端Gal α1-3 Gal表位的抗體。人中的天然抗Gal α1-3 Gal抗體是異種移植的明顯的障礙，其引起超急性異種移植排斥。因此，GalT KO小鼠模型是測試用於減少天然抗Gal α1-3 Gal抗體的潛在方法的一個非常有用的系統(Yang等人，實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)(1998)1871335-1342)。
本實驗的目的是確定利用CD21特異性單克隆抗體7G6處理GalT KO小鼠能否阻止響應兔紅細胞(Gal α1-3 Gal二糖的來源)免疫引起的抗Gal α1-3 Gal抗體誘導。
GalT KO小鼠獲得自John Lowe(密西根大學)。利用600μg溶於磷酸緩衝鹽水(PBS)的7G6或者單純PBS腹膜內施用處理小鼠(11周齡，每組10隻)。一天後利用1×109兔紅細胞腹膜內施用免疫這些小鼠。8天後對這些動物取血並利用ELISA測定血清樣品中的抗-雙半乳糖抗體。利用溶於磷酸緩衝鹽水(PBS)的5μg/ml共100μl/孔雙半乳糖牛血清白蛋白(BSA-雙半乳糖)4℃過夜包被免疫測定滴定板(Costar#3590)。利用PBS洗滌滴定板並利用250μl/孔溶於PBS的5％脫脂奶粉4℃過夜封閉剩餘的蛋白質結合位點。將血清樣品在含有0.5％BSA的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(HBSA)中稀釋。封閉的滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗滌並加入50μl的血清樣品稀釋物。將滴定板在室溫下孵育1小時。滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗滌。加入鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗小鼠IgG或IgM(Jackson#115-055-146或者115-055-075，利用HBSA稀釋1000倍)(100μl/孔)並將滴定板在室溫下孵育1小時。滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗滌。加入酚酞單磷酸(在蒸餾水中1∶26稀釋，100μl每孔)並將滴定板在室溫下孵育。10和30分鐘孵育後在PowerWave340微量滴定板分光光度計上讀出550nm的光密度。
通過與標準曲線比較以適宜單位/ml確定抗-雙半乳糖抗體的血清水平，所述標準曲線利用取自兔紅細胞免疫的GalT KO小鼠的血清庫生成。
血清抗雙半乳糖抗體水平利用Statview通過Students t檢驗來分析。與安慰劑處理的動物相比較，7G6處理的動物中IgM和IgG抗-雙半乳糖抗體顯著減少(IgM，p＝0.0085，IgG，p＝0.0146，Mann-Whitney U檢驗)。利用7G6的處理阻斷了由RRBC免疫刺激的抗-雙半乳糖抗體增加。這些實驗的結果總結在表3和圖3中。
表3對照和抗-CD21處理小鼠中抗-雙半乳糖IgM和IgG水平

與PBS處理組相比，抗體處理組中IgM抗雙半乳糖抗體水平降低65％。與PBS處理組相比，抗體處理組中IgG抗半乳糖抗體水平降低69％。
實施例5 在自身免疫性甲狀腺炎自發模型中抗-CD21抗體的使用NOD.H-2h4株系小鼠從飲用水中接受碘化鈉後發展出自發自身免疫性甲狀腺炎。自身免疫性甲狀腺炎的發展伴隨著針對小鼠甲狀腺球蛋白的抗體水平的增加(Braley-Mullen，H.和Yu，S.(2000)免疫學雜誌(J.Immunol.)1657265-7269)。
通過在飲用水中引入碘化鈉誘發動物出現甲狀腺炎並隨後利用7G6大鼠IgG2b抗-小鼠CD21抗體或者大鼠IgG2b同種型對照(Kinoshita等人，1990，Int.Immunol.，2651-659)處理。
處理方案每一研究由如下的動物組組成(a)未接受處理(鹽水)的對照組。
(b)接受同種型對照抗體的對照組。
(c)接受7G6抗-CD21的測試組。
在8周齡時，小鼠在它們的飲用水中接受0.05％碘化鈉以誘發甲狀腺炎。在最初的實驗中，小鼠的處理從8周齡開始(即在疾病發作之前)。處理方案如下所詳述。在16周齡時收集血液樣品並對甲狀腺球蛋白抗體進行測定。在向飲用水中引入碘化鈉後8周，將小鼠處死並收集甲狀腺組織用於組織學評價。NOD.H-2h4小鼠的甲狀腺損傷在飲用水中引入碘化鈉後7-9周最為嚴重。
在隨後的實驗中，對小鼠的處理在16周齡以後進行，即在疾病發作之後。利用下述的方案對小鼠處理4周。隨後收集血液樣品以確定抗甲狀腺球蛋白抗體的水平。將小鼠處死並收集甲狀腺組織用於組織學評價。
對每一組而言，利用下述方案之一處理小鼠1.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用抗-CD21抗體500μg。
2.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用大鼠IgG2b抗體500μg。
3.通過尾靜脈每周2次(第3和第7天)施用鹽水。
每組評價最少10隻小鼠。下述測定用於跟蹤甲狀腺炎的發展1.抗甲狀腺球蛋白ELISA。動物血清中抗甲狀腺球蛋白抗體的效價利用固相ELISA確定。
2.甲狀腺病理由組織學確定。對甲狀腺濾泡的損傷通過測量單核細胞滲浸潤程度來定量。
實施例6 單克隆抗體2B12的生成利用10μg溶於Immuneasy佐劑(Qiagen，Valencia，CA)的可溶性人CD21(結構域1-2)-Ig融合蛋白質(Hebell，T等人(1991)科學(Science)254102-105)肌內(i.m.)致敏Balb/cJ雌性小鼠。兩周之後，利用同一抗原和佐劑的混合物加強免疫該小鼠。6周後，利用溶於無菌PBS的50μgsCD21(1-2)-Ig靜脈內(i.v.)加強免疫該小鼠。3天後將小鼠處死並通過標準方法將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合。經2周的選擇後，首先利用sCD21(1-2)-Ig通過直接ELISA篩選雜交瘤的上清，並且隨後利用實施例7-11描述的方法篩選。
實施例7mAb 2B12對CD21/C3d相互作用的破壞BSA-或C3d-微球體的包被將1μm羧酸酯修飾的螢光微球體(#F8823，Molecular Probes，Eugene，OR)的懸液(體積相當於約1.5×1010個微球體)利用5000×g離心沉澱5分鐘，並在1ml 50mM MES，pH7.0(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)中洗滌一次，並在0.5ml 50mM MES中重懸。向此懸液中加入各2mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺HCl，Pierce#22980)和磺基-NHS(N-羥基磺基琥珀醯亞胺，Pierce#24510)，並隨後將樣品在室溫下暗處旋轉20分鐘。將活化的微球體懸液在5000×g離心5分鐘並在1ml 50mM MES，pH7.0中洗滌3次。隨後將1體積的活化微球體懸液加至2倍體積的溶於PBS的1mg/ml C3d或者BSA蛋白中，並在室溫下暗處旋轉2小時。再將微球體離心並在50mM MES，pH7.0中洗滌3次。C3d-或者BSA包被的微球體最終以4×109/ml重懸於含有1％BSA和0.01％NaN3的50mM HEPES，pH7.4中，並貯存於4℃。
Raji細胞-C3d微球體結合測定將CD21+人Burkitt氏淋巴瘤細胞系Raji(ATCC#CCL86)細胞從培養中收穫並在PFN(含有1％(V/V)胎牛血清(FBSGibco BRL，Gaithersburg，MD)和0.01％(V/V)的疊氮化鈉的PBS，以防止CD21的表面調節)中洗滌。將細胞在PFN中以106/ml重懸並以200μl/樣品小份加入至FACS管中。在50μL PFN中加入小鼠抗人CD21 mAb 2B12(在預實驗中確定為30-50ng)。對照管不合抗體或者含有30-50ng的小鼠抗-人CD21 mAb HB5(BD Pharmingen，La Jolla，CA)，該mAb識別CD21的3-4結構域上的表位，並對C3d結合具有極小的影響。將小管在4℃下孵育15分鐘。隨後將BSA-或者C3d-包被的1μm螢光微球體加至細胞中，終比例為每個Raji細胞25、50或者100個微球體。加入的微球體的總體積為20μL。將小管短暫渦旋並在室溫下孵育20分鐘。加入PFN至終體積500μL，並隨後將樣品渦旋並在室溫下在FACSC Calibur流式細胞儀上分析。Raji-微球體偶聯物在FL3中鑑定為一系列峰，這些峰代表與不同數目的微球體結合的細胞。為定量分析結果，在直方圖中設定標誌由此將第一個峰從分析中排除。
下表顯示的典型數據為在mAb 2B12存在或者不存在時，以不同微球體細胞比率，與C3d-或者BSA-包被的小珠結合的Raji細胞的百分數。
可以看出mAb 2B12的加入完全抑制了對Raji細胞的C3d特異性結合。利用mAb HB5觀察到很小程度的抑制作用，尤其在較低的微球體細胞比率時。

*結合細胞％為標誌M1內的細胞％。
**抑制作用％＝100×[(無Ab時M1內的細胞％)-(Ab存在時M1內的細胞％)/無Ab時M1內的細胞％]實施例8 利用直接ELISA檢測2812對可溶性重組人CD21蛋白質結構域的結合用5μg/ml的重組可溶性CD21(1-2)-Ig融合蛋白質(Hebell，同上引文)或重組可溶性CD21(1-4)-his 4℃過夜包被微量滴定板孔。
重組可溶性CD21(1-4)-his按照下述製備利用標準方法，從人脾總RNA(Clontech，Palo Alto，CA)中通過PCR擴增含有cDNA的片斷，所述cDNA編碼人CD21的信號肽和氨基末端前四個蛋白質結構域。擴增引物為5』CGCGAGCTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAATTTCTTCACA-3』(反向)(SEQ ID NO1)和5』-GATCTTATAAATATGGGCGCCGCGGGCCTG-3』(正向)(SEQ ID NO2)。反向引物編碼(His)6純化標籤並跟著終止密碼子和Sac I限制性位點。正向引物編碼Bgl II限制性位點。將擴增片斷按照生產廠家說明書(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆至pCR2.1-TOPO質粒中。克隆片斷(SEQ ID NO3)的核酸序列通過利用Retrogen引物延伸測序服務(San Diego，CA)確證。CD21編碼序列以小寫字母表示；擴增引物序列以大寫字母表示；Bgl II和Sac I限制性位點以下劃線標出。
5』-AGATCTTATAAATatgggcg ccgcgggcct gctcgqggtt ttcttggctc tcgtcgcacc gggggtcctcgggatttctt gtggctctcc tccgcctatc ctaaatggcc ggattagtta ttattctacc cccattgctg ttggtaccgtgataaggtac agttgttcag gtaccttccg cctcattgga gaaaaaagtc tattatgcat aactaaagac aaagtggatggaacctggga taaacctgct cctaaatgtg aatatttcaa taaatattct tcttgccctg agcccatagt accaggaggatacaaaatta gaggctctac accctacaga catggtgatt ctgtgacatt tgcctgtaaa accaacttct ccatgaacggaaacaagtct gtttggtgtc aagcaaataa tatgtggggg ccgacacgac taccaacctg tgtaagtgtt ttccctctcgagtgtccagc acttcctatg atccacaatg gacatcacac aagtgagaat gttggctcca ttgctccagg attgtctgtgacttacagct gtgaatctgg ttacttgctt gttggagaaa agatcattaa ctgtttgtct tcgggaaaat ggagtgctgtcccccccaca tgtgaagagg cacgctgtaa atctctagga cgatttccca atgggaaggt aaaggagcct ccaattctccgggttggtgt aactgcaaac tttttctgtg atgaagggta tcgactgcaa ggcccacctt ctagtcggtg tgtaattgctggacagggag ttgcttggaccaaaatgcca gtatgtgaag aaattCACCA CCACCACCAC CACTAAGAGC TC-3』(SEQ IDNO3)克隆的核酸序列(SEQ ID NO4)含有編碼CD21序列的開放閱讀框，見下述。推定的信號肽和(His)6純化標籤以下劃線標出。
MGAAGLLGVFLALVAPGVLGISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGEKSLLCITKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKTNFSMNGNXSVWCQANNMWGPTRLPTCVSVFPLECPALPMIHNGHHTSENVGSLAPGLSVTYSCESYLVGEKIINCLSSGKWSAVPPTCEEARCKSLGRFPNGKVKEPPILRVGVTANFFCDEGYRLQGPPSSRCVLAGQGVAWTKMPVCEEIHHHHHH(SEQ ID NO4)利用Bgl II和Sac I限制性內切酶將SEQ ID NO3中的限制性片斷從pC R2.1-TOPO上釋放，並利用標準技術將其亞克隆至表達載體pBacPAK8(Clontech，Palo Alto，CA)中，pBacPAK8已經利用相同的限制性內切酶線性化。產生的表達載體上的CD21片斷的核酸序列(CD21SCR1-4)通過利用Retrogen引物延伸測序服務(San Diego，CA)確認。
按照生產廠家的說明書，利用BaculoPlatinumTM共轉染載體(Orbigen，San Diego，CA)將CD21SCR1-4轉染至Sf9昆蟲細胞中。收集病毒顆粒並按照標準方法利用Sf9細胞的再感染產生高滴度的原種。重組蛋白質SCD21(1-4)-組氨酸通過用高滴度病毒感染TN5昆蟲細胞，並孵育約50小時而產生。重組sCD21(1-4)-his蛋白質按照生產廠家的說明書利用在Ni-NTA瓊脂糖(QIAGEN，Valencia，CA)上的鎳螯合層析收集。進一步的細節見於Prodinger WM等人，Immunopharmacology(1997)39141-8。
相應的對照為用小鼠IgGλ(Ig融合部分的同種型)或者用其它含組氨酸標籤的重組蛋白質包被的孔。在將孔用1％BSA/PBS溶液封閉1小時後，將孔洗滌，隨後加入測試抗體(兩個重複)並將滴定板在室溫下孵育1小時。將滴定板洗滌並向孔中加入第二山羊抗-小鼠Igκ-鹼性磷酸酶抗體，室溫下30分鐘。將滴定板洗滌並加入酚酞單磷酸底物(PPMP)顯色。
典型的OD結果為
sCD21包被孔 MoIg包被孔正常小鼠血清1∶2500 0.055 0.061OKB7(小鼠抗-人CD21)1∶2500 0.44 0.0962B12培養物上清 0.65 0.045對照培養基 0.041 0.041實施例9 通過細胞ELISA檢測2B12對Raji細胞的結合將Raji細胞在HFN(含有1％v/v FBS和0.05％ w/v NaN3的Hanks平衡鹽溶液(HBSS))中洗滌一次並等分加入微量滴定板的孔中。所有步驟均在4℃下進行。將微量滴定板離心並移去上清。向孔中加入測試抗體，將微量滴定板振蕩並孵育30分鐘。隨後通過4個循環的加入HFN然後離心並移去上清洗滌來洗滌細胞。加入HFN中的第二鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，將微量滴定板振蕩並孵育30分鐘。將細胞如上所述再次洗滌。加入PPMP底物溶液並孵育30分鐘，之後將微量滴定板在550nm讀數確定OD。
典型的OD結果為加入OD 550nm對照培養物上清0.0922B12上清 2.451小鼠IgG 0.072抗-人CD21 mAb BE-50.546抗-人CD21 mAb Bly-4 1.171實施例10 通過流式細胞術檢測2B12對Raji細胞的結合將Raji細胞在冷的PFN(含有1％FBS和O.1％NaN3的PBS)中洗滌並以2×105/樣品分成小份加入FACS小管。將測試樣品加至細胞(例如雜交瘤上清，純化的mAb)，混和並在4℃下孵育20分鐘。將細胞在PFN中洗滌並加入第二螢光素偶聯Ab(例如山羊抗小鼠IgG(H+L)-FITC，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。將細胞再次在4℃下孵育20分鐘並隨後洗滌。通過加入碘化丙錠至終濃度為PFN中的2μg/ml從流式細胞分析中排除死細胞。隨後在FACSCCalibur上分析細胞，並利用MFI測量染色的強度。典型的結果顯示如下條件 平均螢光指數(MFI)單獨的Raji 5+對照培養基4+2B12培養物上清165+OKB7*123+BE-5**85+HB5***117*OKB7來自Ortho Diagnostics(Raritan，NJ)**BE-5來自BioSource International(Camarillo，CA)***HB5來自BD Pharmingen(La Jolla，CA)實施例11 2B12對Raji細胞CD21的免疫沉澱將人B類淋巴母細胞系Raji細胞進行表面生物素化並溶於含有去汙劑的緩衝液中。將細胞裂解物與來自骨髓瘤細胞系SP2/0(陰性對照)，或來自雜交瘤HB5(小鼠抗人CD21結構域3-4)，或來自測試雜交瘤2B12的培養上清一起孵育。隨後，將裂解物與兔抗小鼠多克隆抗體孵育，接著與含有殺死的金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)生物體的蛋白質-A(PansorbinTM)孵育，由此收集免疫複合體。從這些初級免疫沉澱得到的沉澱物通過SDS-PAGE分離並轉膜，利用過氧化物酶偶聯的鏈親合素顯象並隨後通過化學發光法顯示。
為證明已知的抗-CD21 mAb和測試2B12抗體識別相同的分子，將每一來自初級免疫沉澱的上清分成3部分，並利用相同的抗體進行第二輪的免疫沉澱。
本實驗的結果毫無疑義地證明，mAb 2B12與mAb HB5識別同一分子。首先，它們都直接免疫沉澱相同大小約140kD的分子。其次，利用mAb HB5去除了CD21的上清也去除了被mAb 2B12識別的分子。相反地，去除了被2B12識別的分子的上清也去除了被HB5免疫沉澱的CD21。因此，mAb HB5和2B12都免疫沉澱來自Raji細胞的CD21。
儘管為清楚和易於理解起見，前述發明已經通過說明和實例被詳細地描述，但對本領域技術人員顯而易見的是，可以進行某些改變和修飾。因此，本描述和實例不應理解為限制本發明的範圍，所述本發明範圍通過附加的權利要求描繪。
權利要求
1.治療患有抗體介導的病變的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量的幹擾C3d結合至CD21的藥劑，由此改善此抗體介導的病變的症狀。
2.根據權利要求1所述的方法，其中抗體介導的病變為自身免疫病。
3.根據權利要求2所述的方法，其中自身免疫病為系統性紅斑狼瘡。
4.根據權利要求1所述的方法，其中抗體介導的病變為異種移植排斥。
5.根據權利要求1所述的方法，其中抗體介導的病變為甲狀腺炎。
6.根據權利要求1所述的方法，其中藥劑為特異性結合至CD21的與C3d結合的區域的抗體。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述區域包含短共有區域1和短共有區域2。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述區域包含短共有區域1或者它的一部分。
9.根據權利要求6所述的方法，其中所述區域包含短共有區域2或者它的一部分。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述藥劑為抗體。
11.延緩個體中與抗體介導的病變相關的症狀發展的方法，其包括向所述個體施用有效量的幹擾C3d結合至CD21的藥劑，由此延緩抗體介導的病變的症狀發展。
12.根據權利要求11所述的方法，其中抗體介導的病變為自身免疫病。
13.根據權利要求12所述的方法，其中自身免疫病為系統性紅斑狼瘡。
14.根據權利要求11所述的方法，其中抗體介導的病變為異種移植排斥。
15.根據權利要求11所述的方法，其中抗體介導的病變為甲狀腺炎。
16.根據權利要求11所述的方法，其中藥劑為特異性結合至CD21的與C3d結合的區域的抗體。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述區域包含短共有區域1和短共有區域2。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述區域包含短共有區域1或者它的一部分。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述區域包含短共有區域2或者它的一部分。
20.根據權利要求11所述的方法，其中所述藥劑為抗體。
全文摘要
本發明提供利用抑制CD21/C3d相互作用的藥劑改善抗體介導的病變的一種或多種症狀而治療抗體介導的病變，諸如自身免疫病(例如SLE、ITP和甲狀腺炎)的方法。本發明也提供利用抑制CD21/C3d相互作用的藥劑延緩抗體介導的病變發展的方法。
文檔編號A61P37/06GK1511041SQ02810098
公開日2004年7月7日 申請日期2002年5月17日 優先權日2001年5月17日
發明者M·D·林尼克, M－A·坎貝爾, M D 林尼克, 脖炊 申請人:拉喬拉製藥公司