RNA聚合酶I的抑制劑在抑制血管損傷後再狹窄的應用的製作方法
2023-12-03 11:59:36
本發明屬於醫藥技術領域，具體為利用RNA聚合酶I的抑制劑抑制血管損傷後再狹窄的發生。
背景技術：
冠狀動脈硬化性心臟病(即冠心病)是嚴重危害人類健康的重要殺手。據世界衛生組織統計，全世界每年約有1700萬人死於冠心病，佔疾病死亡總人數的50％以上。目前在我國冠心病的發病率呈現不斷上升趨勢。隨著人口不斷老化，40歲以後每增加10歲，冠心病的發病風險就要增加1倍左右。如何有效預防治療冠心病已經成為目前社會的重大需求。
冠心病是冠狀動脈血管內發生動脈粥樣硬化病變而導致血血管狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病。對於狹窄成度嚴重(病人症狀明顯，影響正常生活)和危險性高(容易造成心肌梗塞的發生)的病變，目前臨床上廣泛採用的治療方法之一是介入治療。介入治療是通過穿刺淺表血管，將特定的心臟導管送入冠狀動脈後進行診斷與治療。介入治療依靠的主要技術包括：
(1)冠狀動脈球囊血管成形術：即將相應大小的球囊沿導管送到狹窄的節段，根據病變的特點用適當的壓力和時間進行擴張，達到解除狹窄的目的。單純球囊血管成形術後容易發生冠狀動脈急性閉塞和再狹窄。急性閉塞多見於術後24小時內，發生率在3％-5％，可導致患者急性心肌梗死，甚至死亡。再狹窄一般發生於術後6個月內，發生率在25％-50％，患者會再次出現心絞痛症狀，需再次治療。由於以上的局限性，目前已很少單獨使用。
(2)冠狀動脈金屬支架植入術：為克服球囊成形術的局限性，人們將用不鏽鋼或合金材料製成的網狀金屬支架置入冠狀動脈內狹窄的階段支撐血管壁，維持血流通常。即便如此，術後6個月內仍有20％-30％的血管發生再狹窄，這個過程被稱為「支架內再狹窄」。
(3)藥物洗脫支架(drug-eluting stent)植入術：為進一步防止支架內再狹窄的發生，人們發明了藥物洗脫支架，即用藥物包裹金屬支架，讓藥物在局部緩慢釋放。藥物洗脫支架的使用使支架內再狹窄發生率進一步降低。
其中，臨床中用於支架塗層的藥物，最主要的藥理學作用是通過抑制血管平滑肌細胞的增殖，達到抑制血管再狹窄的目的。目前市場上主要包括以下兩類：
(I)蛋白激酶mTOR的抑制劑：代表藥物是依維莫斯(Everolimus)和西羅莫司(sirolimus)；
(II)微管蛋白穩定劑：代表藥物是紫杉醇(Paclitaxel)。
上述這些藥物在細胞內作用的生物學靶點不同，但都能夠有效抑制血管平滑肌細胞的增殖功能。然而，雖然藥物洗脫支架植的使用大大降低了支架內再狹窄的發生，但並沒有完全根除相關病變的發生。臨床研究的數據顯示仍然有不到10％的血管管腔在應用藥物洗脫支架後會發生支架內再狹窄。而且，由於這種病變是在使用了增殖抑制劑的情況下發生的，其病理特徵與非藥物洗脫支架造成的支架內再狹窄並不完全相同。因此，發現新的幹預治療靶點及新的藥物類型對進一步提高藥物洗脫支架預防再狹窄的效能具有廣泛的應用前景。同時，對於那些現有藥物不能有效抑制其生長的病變，找到新的藥物類型能夠為臨床醫生提供更多的治療選擇。
技術實現要素：
針對上述現有技術，本申請人通過實驗研究意外發現，抑制細胞內的核糖核酸(RNA)聚合酶I可以有效抑制平滑肌細胞增殖，並且能有效抑制球囊損傷後血管再狹窄的發生。這些結果提示，RNA聚合酶I作為預防血管再狹窄發生的新的生物學靶點，可以使用能夠特異性抑制RNA聚合酶I的藥物來預防或治療介入治療後血管再狹窄的發生。
因此，本發明的第一個方面，涉及RNA聚合酶I的抑制劑在製備預防或治療血管損傷後血管再狹窄的藥物或產品中的應用；在製備治療血管損傷的藥物或產品中的應用；在製備預防或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用；在用於製備抑制血管平滑肌細胞增殖的藥物或產品中的應用，或者用於抑制血管內膜增生的藥物或產品中的應用。
進一步的，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的第二個方面，涉及一種組合物，所述組合物含有RNA聚合酶I的抑制劑，所述組合物用於預防或治療血管損傷後再狹窄，或者用於預防或治療血管損傷，或者用於預防或治療動脈粥樣硬化。
進一步的，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的第三個方面，涉及藥物洗脫支架，所述藥物洗脫支架包被有RNA聚合酶I的抑制劑。所述藥物洗脫支架用於預防或治療血管損傷後再狹窄，或者用於預防或治療血管損傷，或者用於預防或治療動脈粥樣硬化。
進一步的，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的第四個方面，涉及藥物釋放球囊，所述藥物釋放球囊包被有RNA聚合酶I的抑制劑。所述藥物釋放球囊用於預防或治療血管損傷後再狹窄，或者用於預防或治療血管損傷，或者用於預防或治療動脈粥樣硬化。
進一步的，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的第四個方面，涉及一種檢測RNA聚合酶I表達水平或功能活性，或者檢測其抑制劑抑制效率的試劑在製備試劑盒中的應用，所述試劑盒用於診斷血管損傷後的再狹窄和血管平滑肌細胞增生性的血管疾病。
本發明的第五個方面，涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括檢測RNA聚合酶I表達水平或功能活性，或者檢測其抑制劑抑制效率的試劑，所述試劑盒用於診斷血管損傷後的再狹窄和血管平滑肌細胞增生性的血管疾病。
本發明的第六個方面，涉及一種篩選預防或者治療血管介入治療後血管再狹窄的藥物的方法，所述方法包括：
(1)將待測物質加入含有RNA聚合酶I的體系中；
(2)測定所述待測物質是否特異性抑制RNA聚合酶I的表達，其中，與未加入待測物質的實驗相比，能夠特異性抑制RNA聚合酶I表達的物質作為預防或者治療血管介入治療後血管再狹窄的候選藥物。
根據本發明上述任一方面的應用、組合物、藥物洗脫支架、藥物釋放球囊、試劑盒、方法，其中所述的RNA聚合酶I的抑制劑可以是能夠特異抑制RNA聚合酶I表達的任何物質；包括是在細胞中特異抑制RNA聚合酶I表達的物質，也可以是與RNA聚合酶I具有特異性相互作用。
優選的，所述RNA聚合酶I抑制劑可選自RNA聚合酶I的小幹擾RNA、硫代核苷或者硫代核苷的類似物或衍生物、放線菌素D或者放線菌素D的類似物或衍生物、CX-5461或者CX-5461的類似物或衍生物、BMH-21或者BMH-21的類似物或衍生物；
進一步優選的，所述RNA聚合酶I抑制劑為CX-5461。CX-5461是美國Cylene Pharmaceuticals公司近期開發出來的新藥，是RNA聚合酶I的特異性抑制劑。目前CX-5461的主要用途是抗腫瘤，正在進行臨床研究階段。而申請人在實驗大鼠的球囊損傷後血管再狹窄模型上證實血管外局部應用CX-5461幹預後顯著抑制了血管再狹窄的程度，而對正常血管壁細胞沒有明顯毒性作用。
需要說明的是，在本發明中，所述的血管再狹窄是指在局部血管發生損傷時，所作出的導致血管管腔再狹窄的普遍性生物學反應。這裡主要指醫源性損傷引起的血管再狹窄，損傷過程主要由動脈重塑和內膜增生組成。
本發明的有益效果：針對臨床上出現的應用藥物洗脫支架後發生支架內再狹窄的病人，這些血管病變組織很可能對所用藥物已產生耐受性或抵抗性。RNA聚合酶I的抑制劑其所作用的生物靶點與當前使用的兩類塗層藥物不同，因此為臨床醫生提供了一個全新的治療選擇。與傳統的治療血管再狹窄的藥物相比，我們發明的新方法作用於新的生物學靶點，因此在開發新型藥物洗脫支架的領域中可能具有廣泛的應用前景。
具體實施方式
應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。
需要注意的是，這裡所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本申請的示例性實施方式。如在這裡所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括複數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語「包含」或「包括」時，其指明存在特徵、步驟、操作、器件、組件或它們的組合。
需要說明的是，本發明中，所述的血管再狹窄是指在局部血管發生損傷時，所作出的導致血管管腔再狹窄的普遍性生物學反應。這裡主要指醫源性損傷引起的血管再狹窄，損傷過程主要由動脈重塑和內膜增生組成。
正如背景技術所介紹的，臨床中用於支架塗層的藥物，最主要的藥理學作用是通過抑制血管平滑肌細胞的增殖，達到抑制血管再狹窄的目的。然而，雖然藥物洗脫支架植的使用大大降低了支架內再狹窄的發生，但並沒有完全根除相關病變的發生。臨床研究的數據顯示仍然有不到10％的血管管腔在應用藥物洗脫支架後會發生支架內再狹窄。而且，由於這種病變是在使用了增殖抑制劑的情況下發生的，其病理特徵與非藥物洗脫支架造成的支架內再狹窄並不完全相同。因此，發現新的幹預治療靶點及新的藥物類型對進一步提高藥物洗脫支架預防再狹窄的效能具有廣泛的應用前景。同時，對於那些現有藥物不能有效抑制其生長的病變，找到新的藥物類型能夠為臨床醫生提供更多的治療選擇。
有鑑於此，本申請的一種典型的實施方式中，提供一種RNA聚合酶I的抑制劑在製備預防或治療血管損傷後血管再狹窄的藥物或產品中的應用；在製備治療血管損傷的藥物或產品中的應用；在製備預防或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用；在用於製備抑制血管平滑肌細胞增殖的藥物或產品中的應用，或者用於抑制血管內膜增生的藥物或產品中的應用。
其中，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的又一典型實施方式中，涉及一種組合物，所述組合物含有RNA聚合酶I的抑制劑，所述組合物用於預防或治療血管損傷後再狹窄，或者用於預防或治療血管損傷，或者用於預防或治療動脈粥樣硬化。
其中，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的又一典型實施方式中，涉及藥物洗脫支架，所述藥物洗脫支架包被有RNA聚合酶I的抑制劑。所述藥物洗脫支架用於預防或治療血管損傷後再狹窄，或者用於預防或治療血管損傷，或者用於預防或治療動脈粥樣硬化。
其中，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的又一典型實施方式中，涉及藥物釋放球囊，所述藥物釋放球囊包被有RNA聚合酶I的抑制劑。所述藥物釋放球囊用於預防或治療血管損傷後再狹窄，或者用於預防或治療血管損傷，或者用於預防或治療動脈粥樣硬化。
其中，所述血管損傷為動脈粥樣硬化介入治療、移植後動脈病引起的血管損傷，例如通過球囊擴張或放入支架引起的血管損傷，或者移植後動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。
本發明的又一典型實施方式中，涉及一種檢測RNA聚合酶I表達水平或功能活性，或者檢測其抑制劑抑制效率的試劑在製備試劑盒中的應用，所述試劑盒用於診斷血管損傷後的再狹窄和血管平滑肌細胞增生性的血管疾病。
本發明的又一典型實施方式中，涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括檢測RNA聚合酶I表達水平或功能活性，或者檢測其抑制劑抑制效率的試劑，所述試劑盒用於診斷血管損傷後的再狹窄和血管平滑肌細胞增生性的血管疾病。
本發明的又一典型實施方式中，涉及一種篩選預防或者治療血管介入治療後血管再狹窄的藥物的方法，所述方法包括：
(1)將待測物質加入含有RNA聚合酶I的體系中；
(2)測定所述待測物質是否特異性抑制RNA聚合酶I的表達，其中，與未加入待測物質的實驗相比，能夠特異性抑制RNA聚合酶I表達的物質作為預防或者治療血管介入治療後血管再狹窄的候選藥物。
根據本發明上述任一方面的應用、組合物、藥物洗脫支架、藥物釋放球囊、試劑盒、方法，其中所述的RNA聚合酶I的抑制劑可以是能夠特異抑制RNA聚合酶I表達的任何物質；包括是在細胞中特異抑制RNA聚合酶I表達的物質，也可以是與RNA聚合酶I具有特異性相互作用的物質。
本發明的又一典型實施方式中，所述RNA聚合酶I抑制劑可選自RNA聚合酶I的小幹擾RNA、硫代核苷或者硫代核苷的類似物或衍生物、放線菌素D或者放線菌素D的類似物或衍生物、CX-5461或者CX-5461的類似物或衍生物、BMH-21或者BMH-21的類似物或衍生物。
本發明的又一典型實施方式中，所述RNA聚合酶I抑制劑為CX-5461。CX-5461是美國Cylene Pharmaceuticals公司近期開發出來的新藥，是RNA聚合酶I的特異性抑制劑。目前CX-5461的主要用途是抗腫瘤，正在進行臨床研究階段。而申請人在實驗大鼠的球囊損傷後血管再狹窄模型上證實血管外局部應用CX-5461幹預後顯著抑制了血管再狹窄的程度，而對正常血管壁細胞沒有明顯毒性作用。
為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本申請的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本申請的技術方案。
實施例1大鼠頸總動脈球囊損傷術
1.動物實驗過程
(1)材料與設備：健康雄性Wistar大鼠，眼科剪，眼科鑷，手術剪，輔料鑷，手術縫合線，縫合針，止血鉗，持針器，1.25mm球囊(Medtronic公司)，大鼠手術臺，棉球，紗布塊，注射器，碘酒棉球，酒精棉球。
(2)術前準備1)：手術器械和敷料：均經過121℃，30min高壓滅菌，球囊採取75％酒精浸泡消毒。2)麻醉用藥：麻醉選擇10％水合氯醛，劑量為0.35ml/100g體重，給藥途徑為腹腔注射。3)自製拉鉤：將訂書釘一端和橡皮筋鉤在一起並固定，訂書釘另一端做45度彎曲，用於鉤掛組織，將橡皮筋另一端以圖釘固定在手術臺上，可以任意調節圖釘位置而改變牽拉的力度。
(3).手術過程1)把大鼠麻醉後固定在手術臺上，根據頸動脈皮下走行剃毛，縱向切開皮膚。2)用彎止血鉗鈍性分離組織，並以止血鉗拉開皮層和基層，使頸總動脈以及頸內外動脈分叉處充分暴露，改用顯微鑷分離，分離長度大約1.5-2cm，分離時動作要輕柔，不得用刀剪等銳利器械，以防損傷血管和神經，特別在分離神經時動作不僅要輕，而且不能大幅度牽拉，以避免對大鼠產生較大的刺激。3)結紮頸外動脈：選擇4-0號手術縫合線做結紮。先在頸外動脈近心端穿一根手術線備用。結紮頸外動脈的遠心端。活結結紮頸內動脈。4)提起頸總動脈近心端的備線，向心方向輕輕牽拉，以阻斷動脈血流為止，然後用止血鉗夾住備線兩端，以止血鉗的重力固定備線位置，使股動脈血流保持被阻斷狀態。5)球囊選擇直徑為1.25mm，長度為10mm。6)提起頸外動脈遠心端打結的縫合線，用眼科剪在兩根結紮線之間，向心方向剪一「V」型口，注意不要把頸外動脈剪斷，剪開部分不要超過頸外動脈直徑的1/2。7)「V」型口剪好後，迅速將球囊尖端插入頸外動脈，將提前穿好的近心端備線以活結固定球囊和頸外動脈，然後將頸總動脈結紮線略放開，稍稍恢復血流。再以左手提起頸外動脈遠心端的結紮線，右手稍稍用力向前推進球囊進入頸總動脈，遇阻力則稍稍反向牽拉，重新向心插入，直至球囊進入約3cm。8)向注入氣體，壓力為8kpa，使球囊膨大，然後向後牽拉球囊末端，大約拉出1cm左右，減小壓力放出氣體，再重新向心插入球囊，再次注入氣體，重複上述步驟，如此反覆2-3次。9)最後把球囊中的氣體放出，然後緩慢拉出球囊，並及時拉緊近心端的備線，結紮頸外動脈近心端。解開頸總動脈、頸內動脈結紮線，恢復血流。10)剪斷結紮點多餘的縫合線，用敷料鑷輕輕使血管，肌肉恢復原位，縫合皮層。
2.血管周圍局部緩釋治療：
(1)Pluronic F127凝膠製備：稱取5克Pluronic F127加入20毫升無菌的生理鹽水中，4℃攪拌過夜，配置成25％溶液。
(2)配置cx-5461(分子量513.6)儲存液：秤取5毫克藥物加入到3.5毫升二甲基黃碸(DMSO)中，37℃超聲水浴振蕩過夜，得2.8毫摩爾(mM)濃度的CX-5461儲存溶液。儲存溶液分裝後可於零下80℃冷凍保存6個月。
(3)配置藥物緩釋凝膠：將0.25微升和5微升CX-5461儲存液加入到1毫升冷的Pluronic F127凝膠中混勻，分別得到含0.7微摩爾(mM)和14微摩爾(mM)藥物濃度的凝膠溶液。Pluronic F127凝膠在4℃是呈粘稠溶液狀態，體溫條件下凝固成固體凝膠。
(4)手術後局部施用凝膠：球囊損傷手術後，將200微升含有不同藥物濃度的凝膠均勻地滴注到暴露的血管表面和周圍，待凝膠凝固後進行皮膚縫合。用含有5微升/毫升DMSO的凝膠作為對照試驗組。
3.血管內膜病變的測量
手術後14天將實驗動物注射過量麻藥安樂死，分離並取出頸動脈，在生理鹽水中衝洗乾淨後，用4％多聚甲醛浸泡固定，經脫水後包埋於石蠟塊中進行組織病理切片。切片用蘇木素-伊紅染色。形態學測量使用普通光學顯微鏡觀察，隨機選擇不同部位照相，圖像文件用Image-Pro Plus 5.0軟體(Media Cybernetics公司)進行分析。管腔狹窄病變程度用兩個指標來衡量：內膜總面積和內膜面積與中膜面積的比值。數據統計：計算平均值加減標準差，然後用單因素方差分析比較各組間的差異。統計軟體使用Graphpad Prism。
4.實驗結果及討論
實驗結果見表1。由結果可見，局部應用RNA聚合酶I抑制劑CX-5461治療後，球囊損傷造成的血管內膜增生程度明顯受到抑制，而且這種作用呈藥物劑量依賴性。損傷後血管內膜增生，佔據管腔位置，是導致血管再狹窄發生的直接原因。目前臨床使用的藥物塗層支架都是利用藥物抑制內膜增生達到防止再狹窄發生的目的。我們的實驗證明CX-5461能夠有效抑制內膜增生及血管平滑肌細胞增生，表明CX-5461有預防血管再狹窄發生的藥理作用。
表1：局部應用CX-5461治療對大鼠頸動脈球囊損傷後內膜增生程度的影響
每組動物數5-8隻。*表示統計學分析有顯著性意義。
以上所述僅為本申請的優選實施例而已，並不用於限制本申請，對於本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護範圍之內。