靶向下調STAT3基因表達在提高肺腺癌化療敏感性方面的應用的製作方法
2023-12-03 11:59:16
本發明屬於醫藥領域,涉及肺癌化療敏感性相關基因的發現,具體涉及靶向下調STAT3基因表達在提高肺腺癌化療敏感性方面的應用。
背景技術:
肺癌是全球最常見的惡性腫瘤,死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發病率呈現逐年上升趨勢,年平均增長近2%。肺癌根據病理學特點的不同分為多種組織類型,肺癌組織類型不同,其治療措施也不同。根據2004版WHO分類,常見肺癌組織病理學分型分為非小細胞癌(NSCLC)和小細胞癌(SCLC)。非小細胞癌又分為鱗狀細胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大細胞癌(LCC)。不同肺癌臨床治療方案不同,預後效果也不同。因此,為了提高治療效果,肺癌的治療策略已經從傳統的以分期為基礎的治療模式轉變為以組織學類型和基因突變為指導的個體化、精準的多學科治療模式。個體化治療提高了肺癌的治療和預後效果。
腺癌(AC)作為最常見的肺癌組織學類型,在全球及我國發病率均呈上升趨勢。流行病學研究結果顯示,非小細胞肺癌的發病有明顯的性別差異,尤其是腺癌。腺癌佔原發肺癌的50%,是非吸菸患者的主要組織學類型。鱗狀細胞癌(SCC)又稱肺鱗癌,佔原發肺癌的30%,是非吸菸患者的另一種主要組織學類型。小細胞肺癌是肺癌常見的類型之一,約佔肺癌總數的14%,與吸菸明顯相關。作為一種高侵襲性腫瘤,SCLC疾病進展快,易早期發生轉移,由於易復發和產生耐藥,中位總生存期僅8個月-11個月,5年生存率不足5%。
臨床上,不同組織學類型肺癌的給藥和治療方案也不同。但是,順鉑為基礎的化療方案仍為肺腺癌、肺鱗癌及小細胞肺癌的一線治療方案,順鉑為基礎的化療方案比非順鉑為基礎的化療方案具有更好的生存期。
但是,順鉑抵抗出現以及順鉑的毒副反應嚴重降低了患者的生存質量,一定程度上限制著順鉑的臨床應用。針對此種情況,眾多醫藥工作者試圖逆轉不同肺癌細胞對順鉑抵抗的出現,以及通過提高肺癌對順鉑的化療敏感性降低順鉑的臨床劑量從而降低對患者的毒副作用。
STAT3(信號傳導蛋白和轉錄激活物)可通過介導炎症介質的細胞外信號調控腫瘤細胞、免疫細胞等的生物學行為,是慢性炎症促進腫瘤發生及腫瘤相關性炎症形成過程中不可或缺的關鍵性分子。一般情況下,細胞因子、生長因子等可結合至細胞表面的相應受體,從而啟動細胞內酪氨酸激酶磷酸化級聯反應。在JAK2、MAPK或mTOR等激酶的作用下,胞漿中的STAT3可因自身Y705及S727位點磷酸化而發生二聚化、活化,此外STAT3亦可通過可逆性乙醯化而活化。活化的STAT3可轉位至細胞核內並結合於基因組DNA,發揮轉錄調控作用。STAT3的這一信號轉導及轉錄激活作用維持和調控著正常機體的一系列生物學行為,包括胚胎發育、程序性細胞死亡、器官發生、先天性免疫、適應性免疫、細胞生長等,而STAT3的異常活化可導致多種疾病的發生。臨床研究發現,肝癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤中的STAT3活性均發生高頻率的異常活化,且其活化程度與腫瘤患者的預後呈顯著反相關,與腫瘤關係密切。
TRPM7是TRPM(瞬時受體電位)亞族的一員是具有離子通道和激酶活性雙功能的膜蛋白它對陽離子有通透性,使細胞去極化,可使自身和底物磷酸化。TRPM7可以介導感覺信號的傳遞,調節細胞鈣鎂平衡和影響發育,其表達及活性異常與多種疾病特別是腫瘤的發生具有相關性。TRPM7通道激酶在細胞的增殖、存活、分化、生長和遷移等一系列細胞活動中起重要作用。TRPM7在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌等患者中異常高表達,並且與腫瘤的轉移、臨床分期等相關,是腫瘤預後的獨立預測因子。
LIN28是一種高度保守的RNA結合蛋白,在let-7的轉錄調節過程中起重要的負性調控作用,可以抑制let-7的加工合成。LIN28促進胚胎幹細胞的快速增長,參與幹細胞的增殖,在腫瘤幹細胞的形成中發揮重要作用。LIN28在多種腫瘤組織或腫瘤細胞系中高表達,可以促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的進展,與患者預後不良有關。另外LIN28能夠促進組織修復。有研究顯示LIN28屬於一種致癌基因,它在腫瘤細胞中過表達,促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的進展。LIN28在多種腫瘤組織或細胞系中高表達,而且多出現在低分化以及預後差的腫瘤中。同時LIN28的表達與惡性腫瘤患者的生存密切相關,它的高表達可能預示患者預後不良。另外,作為一種參與誘導多能幹細胞的多能因子,LIN28可能成為腫瘤的潛在治療靶點。
RNA幹擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發的靶mRNA高效特異性降解的現象,是研究基因功能的重要技術手段。RNA幹擾中常用的病毒載體有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等。與其他載體相比,慢病毒載體具有以下優點:(1)既可以感染分裂期細胞又能感染非分裂期細胞。逆轉錄病毒載體不能感染非分裂期細胞,而慢病毒載體已被證實能有效感染大腦,眼睛,肝臟,造血系統等器官的非分裂期細胞。腺病毒和腺相關病毒載體雖然具有感染非分裂期細胞的能力,但容易引起炎症和毒性反應。另外,慢病毒基因組可以與宿主基因組整合,因此更適合長期誘導轉移基因的表達。(2)病毒突變和產生有複製能力的病毒機率小。(3)可以兼容多個轉錄啟動子,轉錄多個目的序列片段。(4)能夠容納相對大的轉移基因序列。慢病毒經過改建後可以容納10Kb左右的外源基因片段,因此應用範圍更加廣泛。
申請人在研究過程中發現,上述三個基因的表達與不同類型肺癌對順鉑的化療敏感性存在相關性,然後以該基因為靶標篩選得到了可以增強順鉑化療敏感性的化合物,化療時配合該化合物可以降低化療所需的順鉑劑量,降低順鉑對機體帶來的不良反應。
技術實現要素:
本發明的目的是提高順鉑對肺腺癌、肺鱗癌和小細胞肺癌的化療敏感性,從而可以降低順鉑的給藥劑量,降低順鉑對機體帶來的不良反應。
上述目的是通過如下技術方案實現的:
肺腺癌化療敏感性技術方案:
基因STAT3作為靶標在製備促進肺腺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。
具體實施例中,所述化療藥物為順鉑。
抑制基因STAT3表達的抑制劑在製備促進肺腺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。
其中,所述抑制劑可以為幹擾基因STAT3表達的RNA片段,如靶向幹擾基因STAT3表達的siRNA或shRNA,或為下調基因STAT3表達的小分子化合物。
進一步地,所述小分子化合物具有如下結構的通式:
R3選自-H,-OCH3,-OH,-CH3。
優選地,所述小分子化合物為(Z)-3-苯基-2-(4-甲基苯甲醯基)丙烯酸。
優選地,小分子化合物為(Z)-3-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苯甲醯基)丙烯酸。
優選地,所述小分子化合物為(Z)-3-(4-羥基苯基)-2-(4-甲基苯甲醯基)丙烯酸。
優選地,所述小分子化合物為(Z)-3-(4-甲基苯基)-2-(4-甲基苯甲醯基)丙烯酸。
肺鱗癌化療敏感性技術方案:
基因TRPM7作為靶標在製備促進肺鱗癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。
具體實施例中,所述化療藥物為順鉑。
抑制基因TRPM7表達的抑制劑在製備促進肺鱗癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。
其中,所述抑制劑可以為幹擾基因TRPM7表達的RNA片段,如靶向幹擾基因TRPM7表達的siRNA或shRNA,或為下調基因TRPM7表達的小分子化合物。
進一步地,所述小分子化合物具有如下結構的通式:
R1選自-CH3或-OCH3,R3選自-H或-OH。
優選地,所述小分子化合物為(Z)-3-(3-羥基苯基)-2-(4-甲基苯甲醯基)丙烯酸。
優選地,小分子化合物為(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-(4-甲基苯甲醯基)丙烯酸。
優選地,小分子化合物為(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲醯基)丙烯酸。
小細胞肺癌化療敏感性技術方案:
基因LIN28作為靶標在製備促進小細胞肺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。
具體實施例中,所述化療藥物為順鉑。
抑制基因LIN28表達的抑制劑在製備促進小細胞肺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。
其中,所述抑制劑可以為幹擾基因LIN28表達的RNA片段,如靶向幹擾基因LIN28表達的siRNA或shRNA,或為下調基因LIN28表達的小分子化合物。
進一步地,所述小分子化合物具有如下結構的通式:
R2和R3為-OH或-H,或R2和R3為-O-CH2-O-。
進一步地,小分子化合物為(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲醯基)丙烯酸。
進一步地,小分子化合物為(Z)-3-(3-羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲醯基)丙烯酸。
本發明的有益效果:
本發明提供的技術方案通過下調肺腺癌中基因STAT3的表達可以顯著提高肺腺癌對順鉑的化療敏感性,通過下調肺鱗癌中基因TRPM7的表達可以顯著提高肺鱗癌對順鉑的化療敏感性,通過下調小細胞肺癌中基因LIN28的表達可以顯著提高小細胞肺癌對順鉑的化療敏感性;本發明技術方案提供的上述基因的表達抑制劑可以有效提高順鉑的化療敏感性,從而可以降低順鉑的給藥劑量,降低順鉑對機體帶來的不良反應。
附圖說明
圖1為轉染含STAT3-shRNA序列的慢病毒重組載體的293FT細胞在倒置螢光顯微鏡下的100×顯微放大圖,圖中灰色板塊代表綠色螢光;
圖2A為shRNA幹擾後SPCA-1細胞中STAT3 mRNA的表達變化;圖2B為shRNA幹擾後SK-MES-1細胞中TRPM7 mRNA的表達變化;圖2C為shRNA幹擾後NCI-H1688細胞中LIN28 mRNA的表達變化;
圖3為shRNA幹擾後細胞中靶基因蛋白的表達變化;其中,A為shRNA幹擾後SPCA-1細胞中STAT3蛋白的表達變化;B為shRNA幹擾後SK-MES-1細胞中TRPM7蛋白的表達變化;C為shRNA幹擾後NCI-H1688細胞中LIN28蛋白的表達變化。
具體實施方式
下面結合具體實施例和附圖詳細介紹本發明的技術方案和技術效果。
實施例1:基因表達與肺癌化療敏感性的相關性
一、實驗材料
1、實驗細胞
包括肺腺癌細胞株SPCA-1、A549;肺鱗癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520;小細胞肺癌細胞株NCI-H1688、NCI-H446。各細胞株均為本公司凍存,復甦後按如下方法培養:
SPCA-1:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
A549:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
SK-MES-1:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H520:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H1688:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H446:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
2、實驗動物
SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司,7周齡,體重19.5~22.5g。所有小鼠置於溫度(22±2)℃、溼度(60±5)℃、12h明暗交替環境中飼養。
其他材料包括常規試劑、常規儀器等均為本領域技術人員熟知並易於獲取的材料。
二、實驗方法
1、慢病毒載體的構建及慢病毒的包裝
shRNA設計:根據GenBank中基因cDNA序列,利用Invitrogen公司軟體BLOCK-iTTMRNAi Designer設計出目的基因的shRNA片段,每個基因選出1條最優的片段,同時設置陰性對照(negative control,NC)。
shRNA片段序列如下表所示:
慢病毒載體的構建:按照慢病毒包裝試劑盒(Invitrogen)說明書中操作步驟構建pcDNATM6.2-GW/EMGFP-miR表達載體,轉化感受態細胞TOP10,提取質粒,通過BP/LR反應構建目的基因表達重組載體pLenti6/V5-DEST,轉化感受態細胞Stb13,提取質粒用於病毒包轉。
慢病毒的包裝:將提取好的高純度的pLenti6/V5-DEST、包轉試劑VirapowerTMpackaging mix(Invitrogen)和LipofectamimeTM 2000(Invitrogen)共轉染293FT細胞,第2天用新的完全培養基替代舊的培養基,48~72h後收集細胞液,3000r/min 4℃離心5min,吸出上清分裝後置於-80℃保存。
2、細胞分組及轉染
取對數生長期的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688,分別分為空白對照組、RNA幹擾組和陰性對照組。空白對照組不進行轉染處理,RNA幹擾組轉染含shRNA序列的慢病毒重組載體,陰性對照組轉染含shRNA-NC序列的慢病毒重組載體。具體如下:
SPCA-1 RNA幹擾組:轉染含STAT3-shRNA的慢病毒重組載體;
SPCA-1陰性對照組:轉染含STAT3-shRNA-NC的慢病毒重組載體;
SK-MES-1 RNA幹擾組:轉染含TRPM7-shRNA的慢病毒重組載體;
SK-MES-1陰性對照組:轉染含TRPM7-shRNA-NC的慢病毒重組載體;
NCI-H1688 RNA幹擾組:轉染含LIN28-shRNA的慢病毒重組載體;
NCI-H1688陰性對照組:轉染含LIN28-shRNA-NC的慢病毒重組載體。
靶細胞轉染方法:
取對數生長期的細胞,以1×105/孔的密度接種於24孔板,每孔加0.5mL含10%胎牛血清和抗生素的培養基,37℃、5%CO2培養24h後換液。取100μL病毒原液加入到400μL含10%胎牛血清的培養基中稀釋,同時加入聚凝胺至終濃度為8μg/mL,37℃、5%CO2培養24h。換用0.5mL不含聚凝胺的培養基,培養48-72h,於螢光顯微鏡下觀察轉染細胞中的綠色螢光蛋白(GFP)的表達情況,GFP陽性細胞率>80%,則進行後續實驗。
3、Real-time RT-PCR方法測定細胞中靶基因的mRNA表達水平
將空白對照及轉染處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2條件下常規培養,至細胞生長達到85%左右,用0.25%胰酶消化、收集細胞,按RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA,凝膠電泳鑑定其完整性,分光光度法測定其純度和量。根據Real time PCR試劑盒說明書中的方法配置好各個樣品的反應體系,在PCR儀上設置好反應程序進行PCR反應。以GAPDH為內參基因,用實時定量PCR相對定量法對SPCA-1細胞中的STAT3 mRNA、SK-MES-1細胞中的TRPM7 mRNA、NCI-H1688細胞中的LIN28 mRNA結果進行分析。
各基因的RT-PCR引物序列設計如下:
4、Western blot法測定細胞中靶基因對應蛋白的表達水平
將空白對照及轉染處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2條件下常規培養,至細胞生長達到85%左右,用細胞裂解試劑盒對細胞進行裂解,裂解細胞時加入2×loading蛋白上樣緩衝液,95℃加熱5min,用10%SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品,溼轉法轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入一抗4℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1h,ECL化學發光檢測顯影,在凝膠成像系統上拍照並分析。以β-actin為內參,用Quantity One 4.6.2軟體分析條帶灰度值,用相對灰度值對SPCA-1細胞中的STAT3蛋白、SK-MES-1細胞中的TRPM7蛋白、NCI-H1688細胞中的LIN28蛋白結果進行分析。
5、MTT法檢測不同細胞對順鉑的化療敏感性
取對數生長期的細胞(SPCA-1的空白對照組、RNA幹擾組和陰性對照組;SK-MES-1的空白對照組、RNA幹擾組和陰性對照組;NCI-H1688的空白對照組、RNA幹擾組和陰性對照組),用2.5g/L的胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基製成單細胞懸液,按1×105/mL接種於96孔板中,置37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養,24h後加入終濃度為0、0.5、1、2、4、8μM的順鉑(SPCA-1細胞)或終濃度為0、5、10、20、40、80μM的順鉑(SK-MES-1和NCI-H1688細胞),每濃度設3個復孔,藥物作用48h後每孔加入5g/L MTT 20μL,37℃繼續孵育4h後小心吸去孔內培養基,每孔加入DMSO 150μL,置搖床上低速振蕩10min,酶標儀測量490nm波長處的吸光度值(A)。抑制率=(對照組A值-各濃度組A值)/對照組A值×100%,並繪製藥物-劑量反應曲線,Bliss法計算IC50。
三、實驗結果
1、慢病毒重組載體的包裝
將包裝質粒和包裝試劑一起通過LipofectamimeTM 2000轉入293FT細胞後,其包裝成功的確認和效率可通過綠色螢光蛋白基因(GFP)的表達判斷,轉染48h後倒置螢光顯微鏡下可見綠色螢光,證明轉染成功。圖1為轉染含STAT3-shRNA序列的慢病毒重組載體的293FT細胞在倒置螢光顯微鏡下的100×顯微放大圖,未轉染的293FT細胞未見綠色螢光。轉染其他序列的293FT細胞的綠色螢光蛋白基因的表達情況與STAT3-shRNA基本一致。
2、病毒轉導靶細胞
在螢光顯微鏡下可觀察到經過轉染處理的靶細胞內有綠色螢光蛋白的表達,說明質粒成功轉染靶細胞。各轉染處理的靶細胞中綠色螢光蛋白陽性細胞率均大於80%。
上述結果證明重組載體已成功轉染至靶細胞,並在靶細胞中穩定表達。
3、shRNA幹擾後各細胞中靶基因的mRNA水平的變化
慢病毒轉染肺腺癌細胞株SPCA-1後,Real-time PCR檢測STAT3 mRNA結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,SPCA-1 RNA幹擾組STAT3 mRNA水平顯著降低(P<0.01);慢病毒轉染肺鱗癌細胞株SK-MES-1後,Real-time PCR檢測TRPM7 mRNA結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,SK-MES-1 RNA幹擾組TRPM7 mRNA水平顯著降低(P<0.01);慢病毒轉染小細胞肺癌細胞株NCI-H1688後,Real-time PCR檢測LIN28 mRNA結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,NCI-H1688 RNA幹擾組LIN28 mRNA水平顯著降低(P<0.01)。結果見下表和圖2A-2C。
4、shRNA幹擾後各細胞中靶基因的蛋白質水平的變化
慢病毒轉染肺腺癌細胞株SPCA-1後,Western blot檢測STAT3蛋白結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,SPCA-1 RNA幹擾組STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.01);慢病毒轉染肺鱗癌細胞株SK-MES-1後,Western blot檢測TRPM7蛋白結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,SK-MES-1 RNA幹擾組TRPM7蛋白水平顯著降低(P<0.01);慢病毒轉染小細胞肺癌細胞株NCI-H1688後,Western blot檢測LIN28蛋白結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,NCI-H1688 RNA幹擾組LIN28蛋白水平顯著降低(P<0.01)。
結果見圖3。
上述結果證明,含有上述shRNA片段的慢病毒重組載體可以有效下調靶基因的表達。
5、不同細胞對順鉑的化療敏感性
慢病毒轉染肺腺癌細胞株SPCA-1後,MTT實驗結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,SPCA-1 RNA幹擾組對順鉑的化療敏感性明顯增加,IC50值顯著降低(P<0.01);慢病毒轉染肺腺癌細胞株SK-MES-1後,MTT實驗結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,SK-MES-1 RNA幹擾組對順鉑的化療敏感性明顯增加,IC50值顯著降低(P<0.01);慢病毒轉染小細胞肺癌細胞株NCI-H1688後,MTT實驗結果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,NCI-H1688 RNA幹擾組對順鉑的化療敏感性明顯增加,IC50值顯著降低(P<0.01)。
不同細胞對順鉑的藥物敏感性見下表:
上述結果表明,STAT3低表達,肺腺癌SPCA-1細胞對順鉑的敏感性顯著增加;TRPM7低表達後,肺鱗癌SK-MES-1細胞對順鉑的敏感性顯著增加;LIN28低表達後,小細胞肺癌NCI-H1688對順鉑的敏感性顯著增加。
實施例2:以靶基因為靶標篩選提高肺癌化療敏感性的化合物
一、實驗材料
1、實驗細胞
包括肺腺癌細胞株SPCA-1、A549;肺鱗癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520;小細胞肺癌細胞株NCI-H1688、NCI-H446。各細胞株均為本公司凍存,復甦後按如下方法培養:
SPCA-1:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
A549:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
SK-MES-1:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H520:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H1688:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H446:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
2、實驗動物
SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司,7周齡,體重19.5~22.5g。所有小鼠置於溫度(22±2)℃、溼度(60±5)℃、12h明暗交替環境中飼養。
其他材料包括常規試劑、常規儀器等均為本領域技術人員熟知並易於獲取的材料。
二、實驗方法
1、化合物幹擾處理肺癌細胞
取對數生長期的細胞,以1×105/孔的密度接種於孔板中,每孔加含10%胎牛血清和抗生素的培養基,37℃、5%CO2培養24h後換含有待測試化合物的完全培養基,繼續培養48h。
各化合物名稱、結構、編號及給藥濃度如下:
2、Real-time RT-PCR方法測定細胞中靶基因的mRNA表達水平
將空白對照及化合物幹擾處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2條件下常規培養,至細胞生長達到85%左右,用0.25%胰酶消化、收集細胞,按RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA,凝膠電泳鑑定其完整性,分光光度法測定其純度和量。根據Real time PCR試劑盒說明書中的方法配置好各個樣品的反應體系,在PCR儀上設置好反應程序進行PCR反應。以GAPDH為內參基因,用實時定量PCR相對定量法對SPCA-1細胞中的STAT3 mRNA、SK-MES-1細胞中的TRPM7 mRNA、NCI-H1688細胞中的LIN28 mRNA結果進行分析。
各基因的RT-PCR引物序列設計如下:
3、Western blot法測定細胞中靶基因對應蛋白的表達水平
將空白對照及化合物幹擾處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2條件下常規培養,至細胞生長達到85%左右,用細胞裂解試劑盒對細胞進行裂解,裂解細胞時加入2×loading蛋白上樣緩衝液,95℃加熱5min,用10%SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品,溼轉法轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入一抗4℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1h,ECL化學發光檢測顯影,在凝膠成像系統上拍照並分析。以β-actin為內參,用Quantity One 4.6.2軟體分析條帶灰度值,用相對灰度值對SPCA-1細胞中的STAT3蛋白、SK-MES-1細胞中的TRPM7蛋白、NCI-H1688細胞中的LIN28蛋白結果進行分析。
4、MTT法檢測不同細胞對順鉑的化療敏感性
取對數生長期的細胞(SPCA-1的空白對照組、化合物幹擾組;SK-MES-1的空白對照組、化合物幹擾組;NCI-H1688的空白對照組、化合物幹擾組),用2.5g/L的胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基製成單細胞懸液,按1×105/mL接種於96孔板中,置37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養,24h後加入終濃度為0、0.5、1、2、4、8μM的順鉑(SPCA-1細胞)或終濃度為0、5、10、20、40、80μM的順鉑(SK-MES-1和NCI-H1688細胞),每濃度設3個復孔,藥物作用48h後每孔加入5g/L MTT 20μL,37℃繼續孵育4h後小心吸去孔內培養基,每孔加入DMSO 150μL,置搖床上低速振蕩10min,酶標儀測量490nm波長處的吸光度值(A)。抑制率=(對照組A值-各濃度組A值)/對照組A值×100%,並繪製藥物-劑量反應曲線,Bliss法計算IC50。
三、實驗結果
1、化合物幹擾後各細胞中靶基因的mRNA水平的變化
化合物處理肺腺癌細胞株SPCA-1後,Real-time PCR檢測STAT3 mRNA結果顯示,與空白對照組比較,化合物幹擾組STAT3 mRNA水平顯著降低(P<0.01);化合物處理肺鱗癌細胞株SK-MES-1後,Real-time PCR檢測TRPM7 mRNA結果顯示,與空白對照組比較,化合物幹擾組TRPM7 mRNA水平顯著降低(P<0.01);化合物處理小細胞肺癌細胞株NCI-H1688後,Real-time PCR檢測LIN28 mRNA結果顯示,與空白對照組比較,化合物幹擾組LIN28 mRNA水平顯著降低(P<0.01)。
結果見下表。
2、化合物幹擾後各細胞中靶基因的蛋白水平的變化
化合物處理肺腺癌細胞株SPCA-1後,Western blot檢測STAT3蛋白結果顯示,與空白對照組比較,化合物幹擾組STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.01);化合物處理肺鱗癌細胞株SK-MES-1後,Western blot檢測TRPM7蛋白結果顯示,與空白對照組比較,化合物幹擾組TRPM7蛋白水平顯著降低(P<0.01);化合物處理小細胞肺癌細胞株NCI-H1688後,Western blot檢測LIN28蛋白結果顯示,與空白對照組比較,化合物幹擾組LIN28蛋白水平顯著降低(P<0.01)。結果見下表。
3、化合物處理後各細胞對順鉑的化療敏感性
化合物處理肺腺癌細胞株SPCA-1後,MTT實驗結果顯示,與空白對照組比較,化合物處理組對順鉑的化療敏感性明顯增加,IC50值顯著降低(P<0.01);化合物處理肺腺癌細胞株SK-MES-1後,MTT實驗結果顯示,與空白對照組比較,化合物處理組對順鉑的化療敏感性明顯增加,IC50值顯著降低(P<0.01);化合物處理小細胞肺癌細胞株NCI-H1688後,MTT實驗結果顯示,與空白對照組比較,化合物處理組對順鉑的化療敏感性明顯增加,IC50值顯著降低(P<0.01)。不同細胞對順鉑的藥物敏感性見下表:
化合物1-4對鱗癌SK-MES-1和小細胞癌NCI-H1688無明顯增敏作用(80μM幹擾48h後順鉑IC50值無明顯降低,下同);化合物5、6對腺癌SPCA-1和小細胞癌NCI-H1688無明顯增敏作用;化合物8、9對腺癌SPCA-1和鱗癌SK-MES-1無明顯增敏作用;化合物7對鱗癌SK-MES-1和小細胞癌NCI-H1688都具有明顯的增敏作用。
化合物1-4具有如下共同的結構:
其中,R3為-H,-OCH3,-OH,-CH3。
化合物5-7具有如下共同的結構:
其中,R1為-CH3或-OCH3,R3為-H或-OH。
化合物7-9具有如下共同的結構:
其中,R2和R3為-OH或-H,或R2和R3為-O-CH2-O-。
化合物1-9對人正常胚肺MRC-5細胞的毒性:
取對數生長期的MRC-5細胞,用DMEM高糖培養液調整至5×104/ml,以90μl/孔加入96孔培養板中。實驗分空白對照組、給藥組(10、20、40、80、160μM),置37℃、5%CO2培養箱培養,24h後分別以10μl/孔加入藥物或溶媒,繼續培養24小時。於實驗終止前4h加入MTT(10μl/孔),實驗終止時加入10%SDS(100μl/孔),置培養箱中過夜,次日于波長570nm處測定吸光值。按下式計算抑制率。抑制率=(空白對照組A值-給藥組A值)/空白對照組A值×100%。結果證明,化合物1-9對正常胚肺細胞均無明顯的細胞毒性,最大給藥濃度160μM時對人正常胚肺MRC-5細胞的抑制率最大不超過15%。
實施例3:從動物水平對篩選出的化合物進行活性確證
一、實驗材料
1、實驗細胞
包括肺腺癌細胞株SPCA-1、A549;肺鱗癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520;小細胞肺癌細胞株NCI-H1688、NCI-H446。各細胞株均為本公司凍存,復甦後按如下方法培養:
SPCA-1:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
A549:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
SK-MES-1:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H520:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H1688:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
NCI-H446:37℃、5%CO2條件下常規培養於含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養液(GIBICO公司)中,當細胞密度達75%~85%時進行傳代培養。
2、實驗動物
SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司,7周齡,體重19.5~22.5g。所有小鼠置於溫度(22±2)℃、溼度(60±5)℃、12h明暗交替環境中飼養。
其他材料包括常規試劑、常規儀器等均為本領域技術人員熟知並易於獲取的材料。
二、實驗方法
1、動物模型的建立及分組
肺腺癌裸鼠:取對數生長期肺腺癌A549細胞用0.25%胰蛋白酶消化製成單細胞懸液,臺盼藍拒染法記數活細胞數佔95%以上,將細胞密度調至1×107/ml,每隻裸鼠取0.2ml細胞懸液接種於右大腿背側皮下,術前測量體重。接種後每日觀察,待出現肉眼可見移植瘤後,用遊標卡尺測量移植瘤,待移植瘤體積達100mm3左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、低劑量組、高劑量組、單順鉑組,空白對照組給予等體積生理鹽水,經皮下注射給藥,隔天一次,連續十次。藥物處理結束後一天,頸椎脫臼法處死裸鼠,照相,觀察記錄各組裸鼠包塊形態大小,將腫塊剝出、稱重,冷藏於-80℃備用。
肺鱗癌裸鼠:取對數生長期肺鱗癌NCI-H520細胞用0.25%胰蛋白酶消化製成單細胞懸液,臺盼藍拒染法記數活細胞數佔95%以上,將細胞密度調至1×107/ml,每隻裸鼠取0.2ml細胞懸液接種於右大腿背側皮下,術前測量體重。接種後每日觀察,待出現肉眼可見移植瘤後,用遊標卡尺測量移植瘤,待移植瘤體積達100mm3左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、低劑量組、高劑量組、單順鉑組,空白對照組給予等體積生理鹽水,經皮下注射給藥,隔天一次,連續十次。藥物處理結束後一天,頸椎脫臼法處死裸鼠,照相,觀察記錄裸鼠包塊形態大小,將腫塊剝出、稱重,立即冷藏於-80℃備用。
小細胞肺癌裸鼠:取處於對數生長期體外培養的小細胞肺癌NCI-H446細胞用0.25%胰蛋白酶消化製成單細胞懸液,臺盼藍拒染法記數活細胞數佔95%以上,將細胞密度調至1×107/ml,每隻裸鼠取0.2ml細胞懸液接種於右大腿背側皮下,術前測量體重。接種後每日觀察,待出現肉眼可見移植瘤後,用遊標卡尺測量移植瘤,待移植瘤體積達100mm3左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、低劑量組、高劑量組、單順鉑組,空白對照組給予等體積生理鹽水,經皮下注射給藥,隔天一次,連續十次。藥物處理結束後一天,頸椎脫臼法處死裸鼠,照相,觀察記錄各組裸鼠包塊形態大小,將每個腫塊剝出、稱重,立即冷藏於-80℃冰箱備用。
2、給藥方案及化療敏感性評價
各組給藥方案如下表:
通過腫瘤抑制率比較不同組別裸鼠對順鉑的化療敏感性,抑瘤率=(1-給藥組瘤重/空白對照組瘤重)×100%。
3、腫瘤組織中靶基因的mRNA表達水平
液氮磨組織提取RNA,取100mg組織加入1mL Trizol,提取總RNA。紫外分光光度計測定A260及A280,分析RNA純度並調整濃度。根據Real time PCR試劑盒說明書中的方法配置好各個樣品的反應體系,在PCR儀上設置好反應程序進行PCR反應。以GAPDH為內參基因,用實時定量PCR相對定量法對A549肺腺癌組織中的STAT3 mRNA、NCI-H520肺鱗癌組織中的TRPM7 mRNA、NCI-H446小細胞肺癌組織中的LIN28 mRNA結果進行分析。
各基因的RT-PCR引物序列設計如下:
4、腫瘤組織中靶基因蛋白的表達水平
液氮磨組織提取蛋白質,取100mg組織加入0.75mL細胞裂解液,提取總蛋白。運用BCA法測定蛋白量。每例取50μg,與4×上樣緩衝液混合後煮沸5min,在15%SDS-PAGE電泳,然後電轉移至0.22μm PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入一抗4℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1h,ECL化學發光檢測顯影,在凝膠成像系統上拍照並分析。以β-actin為內參,用Quantity One 4.6.2軟體分析條帶灰度值,用相對灰度值對A549肺腺癌組織中的STAT3蛋白、NCI-H520肺鱗癌組織中的TRPM7蛋白、NCI-H446小細胞肺癌組織中的LIN28蛋白結果進行分析。
三、實驗結果
1、不同裸鼠對順鉑的化療敏感性
化合物1-4與順鉑聯合給藥可以顯著提高肺腺癌裸鼠對順鉑的化療敏感性;化合物5-7與順鉑聯合給藥可以顯著提高肺鱗癌裸鼠對順鉑的化療敏感性;化合物7-9與順鉑聯合給藥可以顯著提高小細胞肺癌裸鼠對順鉑的化療敏感性。
不同組別裸鼠對順鉑的化療敏感性結果見下表:
2、肺癌組織中靶基因的mRNA表達水平的變化
化合物1-4可以顯著降低裸鼠肺腺癌組織中STAT3 mRNA水平,且呈一定的濃度相關性;化合物5-7可以顯著降低裸鼠肺鱗癌組織中TRPM7 mRNA水平,且呈一定的濃度相關性;化合物7-9可以顯著降低裸鼠小細胞肺癌組織中LIN28 mRNA水平,且呈一定的濃度相關性。
mRNA表達水平見下表。
3、肺癌組織中靶基因的蛋白表達水平的變化
化合物1-4可以顯著降低裸鼠肺腺癌組織中STAT3蛋白水平,且呈一定的濃度相關性;化合物5-7可以顯著降低裸鼠肺鱗癌組織中TRPM7蛋白水平,且呈一定的濃度相關性;化合物7-9可以顯著降低裸鼠小細胞肺癌組織中LIN28蛋白水平,且呈一定的濃度相關性。
蛋白表達水平見下表。
使用順鉑化療時,輔以化合物1-7可以顯著提高順鉑對裸鼠移植瘤的抑制率,裸鼠移植瘤組織學分析發現,相關靶基因的表達顯著下調。
上述實施例證明:本發明提供的技術方案通過下調肺腺癌中基因STAT3的表達可以顯著提高肺腺癌對順鉑的化療敏感性,通過下調肺鱗癌中基因TRPM7的表達可以顯著提高肺鱗癌對順鉑的化療敏感性,通過下調小細胞肺癌中基因LIN28的表達可以顯著提高小細胞肺癌對順鉑的化療敏感性;本發明技術方案提供的上述基因的表達抑制劑可以有效提高順鉑的化療敏感性,從而可以降低順鉑的給藥劑量,降低順鉑對機體帶來的不良反應。