四環素與載體蛋白偶聯產物和四環素類抗生素抗體製備的方法及用途的製作方法

2023-12-03 06:28:56

專利名稱：四環素與載體蛋白偶聯產物和四環素類抗生素抗體製備的方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫化學生物技術領域，尤其是涉及一種四環素與載體蛋白偶 聯產物和四環素類抗生素抗體製備的方法及用途。
背景技術：
關於藥物殘留的控制既需要完善的檢驗方法和標準，又需要健全的監控體
系。目前國際上對抗生素類藥物殘留的檢測主要有儀器分析法(包括HPLC和 GC-MS)和微生物學法(主要用於抗生素殘留的檢測)等。儀器分析法既要求 儀器設備具有相當高的精度，也要求技術人員具有較好的分析操作技能，其昂 貴的價格和緩慢的軟體更新速度以及操作上的煩瑣限制了其在一般實驗室中的 應用。但由於檢測的靈敏度可以達到ng級水平(ppb級)，在一些大型實驗室仍 將其作為殘留檢測的參考標準使用。
四環素類抗生素在畜牧業中的濫用導致動物體內藥物的滯留或蓄積，並以 殘留的方式進入人體及生態系統。它對人體及環境的危害主要是慢性、遠期和 累積性的。四環素可與新形成的骨、牙中所沉積的鈣相結合。妊娠5個月以上 的婦女服用這類抗生素時，出生的幼兒乳牙可出現螢光、變色、牙釉質發育不 全，畸形和生長抑制。幼兒，尤其是出生後第1年，由於腎發育不全，藥物不 能充分排洩，即使短期用藥，也極易引起乳牙的色素沉著和牙釉質發育不全， 易於造成齲齒，牙染色由黃轉為棕黃。劑量越大，黃染越深，牙釉質發育不全 也更加顯著。四環素引起噁心、嘔吐、上腹部不適、腹脹、腹瀉等。長期用四 環素後，使正常菌群的分布發生改變，敏感菌受到抑制，耐藥細菌、真菌(主要 是白色念珠菌)等乘機在體內繁殖，發生消化道、呼吸道和泌尿道等感染。在長 期的生活中，恰恰是人類和動物腸道的正常菌群成了耐藥基因的儲存庫，並不 斷的將耐藥基因轉移給致病菌，並在人和動物中交叉傳播，尤其是釋放到環境 中耐藥菌的危害更為嚴重，可造成耐藥基因的迅速轉移。隨著人們生活水平以 及對濫用抗生素危害性認識的提高，人們非常重視食品中抗生素的殘留，喜歡 食用無抗生素殘留的畜產品和水產品。

發明內容
本發明的目的是提供一種四環素與載體蛋白偶聯產物和四環素類抗生素抗 體製備的方法及用途。
四環素與載體蛋白偶聯產物的製備方法包括如下步驟a) 將5-1000mg的四環素鹽酸鹽溶解於l-20ml超純水中；
b) 10-3000mg的載體蛋白溶解於l-110ml的0.1-0.2MpH3-6的醋酸鈉緩衝溶 液中；
c) 將上述兩種溶液混勻後，在攪拌狀態下逐滴加入25%的甲醛10-3000111， 加畢後在10-35'C下避光攪拌反應l-48小時，合成四環素-載體蛋白偶聯產物；
d) 四環素-載體蛋白偶聯產物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸鹽緩衝 液在4'C透析l-3天；
e) 透析後的四環素-載體蛋白偶聯產物進行紫外掃描，分析鑑定偶聯產物及 濃度測定，分裝後於-2(TC冰箱保存備用。
所述的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種 球蛋白、酶或卵清蛋白。
所述的四環素-載體蛋白偶聯產物可免疫動物製備四環素類抗生素抗體及作 為人工抗原應用於食品中四環素類抗生素檢測的免疫學方法。
抗四環素類抗生素單抗的製備方法包括如下步驟
1) 四環素-載體蛋白偶聯產物作為免疫原免疫BALB/C小鼠；
2) 取免疫鼠的脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞在50。/。聚乙二醇融合劑下融合， HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法篩選分泌抗四環素抗體的 細胞；
3) 採用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩 定傳代並分泌抗四環素類抗生素特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株；雜交瘤細 胞注射入BALB/C小鼠腹腔製備單抗腹水；
4) 採用直接競爭ELISA方法測定抗四環素類抗生素單抗與土黴素、金黴素、 鏈黴素、卡那黴素、青黴素、慶大黴素、氯黴素的交叉反應率，選擇僅與四環 素類抗生素有特異性免疫反應，且檢測靈敏度達到0.5-3 ng/mL的單抗，可用於 畜產品中四環素類抗生素殘留的檢測。
所述的免疫原是根據權利要求書1方法偶聯的四環素-載體蛋白偶聯產物。 所述的免疫原的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、
牛丙種球蛋白、酶或卵清蛋白。
抗四環素類抗生素單抗用於檢測食品中四環素類抗生素殘留的免疫學方
法。所述的用於檢測食品中四環素類抗生素殘留的免疫學方法為競爭ELISA或
免疫檢測試紙條。
四環素-載體蛋白偶聯產物免疫鼠、兔子、羊、驢、牛或禽製備抗四環素類抗生素多抗的製備方法包括如下步驟
1) 初次免疫採用0.1-5mg偶聯產物抗原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化後 皮下或皮內或肌肉小量、多點注射免疫；
2) 每間隙2-4周，用弗氏不完全佐劑與偶聯產物抗原充分乳化後皮下或皮 內或肌肉小量、多點注射，進行2-5加強免疫；
3) 末免不加佐劑，加倍劑量肌肉注射免疫，末免後7-10天後採血，離心分 離血清；
4) 用蛋白A/G親和柱純化IgQ純化的IgG凍乾冰箱保存。 本發明的優點是1)本發明提供一種能製備檢測食品中四環素類抗生素殘
留的抗體的四環素免疫原偶聯方法，其操作簡單方便；2)提供了一種能獲得檢 測四環素類抗生素殘留的特異、靈敏抗體的製備方法，其方法簡單有效；3)利 用本發明所製備的抗體，可有效地用於畜產品中四環素類抗生素殘留的檢測。 目前四環素殘留的檢測主要有儀器分析和免疫分析兩種方法,其中儀器分析法主 要用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)，由於其存在儀器昂貴、操作煩 瑣、費時費力、費用高、不能大規模現場檢測等問題，也要求技術人員具有一 定的操作和分析技能，因而不能很好推廣應用。酶聯免疫吸附分析(ELISA)具 有簡便、快捷、能大規模檢測、靈敏和成本低廉及現場檢測的優點,尤其適合在 生產和流通過程中對畜產品及水產品中四環素等抗生素殘留進行檢測。膠體金 免疫層析試紙條應用廣泛，已有多種可檢測人、動物、植物病原、癌症抗原、 激素、藥物與農藥殘留的試紙條，該方法具有如下優點操作簡單、方便、快 速，幾乎人人都會使用；不需任何設備；結果準確可靠、特異性強、靈敏度高； 低成本高效益；保存方便等。因此免疫層析試紙條目前己成為多種物質免疫學 檢測的發展方向之一。本專利應偶聯的人工抗原製備抗四環素抗體，以該多抗 為核心開發四環素殘留檢測試劑盒及膠體金免疫層析試紙條，為我國動物源食 品中四環素殘留的快速檢測服務。
具體實施例方式
本發明提供了四環素與載體蛋白偶聯產物和四環素類抗生素抗體製備的方 法及用途。用製備的免疫原製備四環素的特異性強、靈敏度高、穩定性好、能 大量生產的單克隆抗體和多抗，並用這些抗體建立了檢測食品中四環素類抗生 素殘留具有高度特異性、靈敏性和正確性的快速診斷方法一競爭ELISA及免疫 層析試紙條，可有效地用於畜產品中四環素類抗生素殘留的檢測，為我國的食 品安全服務。1. 一種四環素與牛血清白蛋白(BSA)偶聯產物的製備方法的步驟
a) 將5mg的四環素鹽酸鹽溶解於lml超純水中；
b) 10mg的載體蛋白BSA溶解於lml的0.1-0.2MpH3-6的醋酸鈉緩衝溶液中；
c) 將上述兩種溶液混勻後，在攪拌狀態下逐滴加入25Q/。的甲醛10ul,加畢後 在10-35。C下避光攪拌反應l-48小時，合成四環素-BSA偶聯產物；
d) 四環素-BSA偶聯產物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸鹽緩衝液在 4。C透析l-3天；
e) 透析後的四環素-BSA偶聯產物、四環素、BSA溶液進行紫外掃描，分析 鑑定偶聯產物及濃度測定，分析發現偶聯產物的紫外掃描圖形與BSA、四環素 的掃描圖形明顯不同，說明四環素已與BSA偶聯成功，偶聯產物分裝後於-2(TC 冰箱保存，用於免疫動物製備抗體及作為四環素人工抗原應用於食品中四環素 類抗生素檢測的免疫學方法。
2. —種四環素與牛血清白蛋白(BSA)偶聯產物的製備方法的步驟
a) 將1000mg的四環素鹽酸鹽溶解於20ml超純水中；
b) 3000mg的載體蛋白BSA溶解於110ml的0.1-0.2MpH3-6的醋酸鈉緩衝溶液
中；
c) 將上述兩種溶液混勻後，在攪拌狀態下逐滴加入25。/。的甲醛3000ul,加畢 後在10-35'C下避光攪拌反應l-48小時，合成四環素-BSA偶聯產物；
d) 四環素-BSA偶聯產物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸鹽緩衝液在 (C透析l-3天；
e) 透析後的四環素-BSA偶聯產物、四環素、BSA溶液進行紫外掃描，分析 鑑定偶聯產物及濃度測定，分析發現偶聯產物的紫外掃描圖形與BSA、四環素 的掃描圖形明顯不同，說明四環素己與BSA偶聯成功，偶聯產物分裝後於-2(TC 冰箱保存，用於免疫動物製備抗體及作為四環素人工抗原應用於食品中四環素 類抗生素檢測的免疫學方法。
3. 四環素類抗生素單克隆抗體的製備方法 1)免疫動物
四環素-BSA偶聯產物免疫四周齡體重18-20 g BALB/C雌性小鼠取1 mg/ml四環素-BSA偶聯產物0.5-0.7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化 後，經背腹部皮下多點注射0.2-0.3ml/只，間隔3-4周，取與一免等量抗原和等 體積的福氏不完全佐劑充分乳化後，進行腹腔注射加強免疫(0.2-0.3ml/只)，共 進行3-5次加強免疫，不加佐劑的末免用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天後取脾細胞進行融合。
2) 細胞融合
取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10: 1的比例，在 無血清的RPMI-1640 (Gibco)培養基中混勻，1500 rpm離心5 min，去除培養 基，用50。/。PEG(聚乙二醇，Sigma)作為融合劑，在37。C下水浴下加入0.5-0.7ml， 使其融合2 min，用無血清的RPMI-1640培養基終止融合後1500 rpm離心5 min， 沉澱用HAT篩選培養基(Sigma)懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中， 37°C， 5%032的細胞培養器皿中培養。
3) 雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及其克隆
細胞在培養器皿中培養5天後，用HAT篩選培養基換液一次，第10天用HT 培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底5%-50%時，用四環素偶聯卵清蛋白作為包 被抗原進行間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲500多個對四環素有反應的陽性 孔，陽性率為1%。選擇12個呈強陽性反應的細胞孔，進行有限稀釋法克隆， 獲得1C1株能分泌抗四環素的特異性抗體的雜交瘤細胞株。經6個月以上體外 傳代和多次凍存復甦後，細胞株均能良好生長，並穩定分泌抗體。經擴大培養 後，用於腹水製備和液氮保存。
4) 單克隆抗體腹水製備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植垸(Sigma)， 7-10 天后腹腔注入5-10><105個雜交瘤細胞，注射後7-10天可見小鼠腹部明顯膨大， 採取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取 1倍體積腹水加2倍體積0.06 M pH 4.8醋酸緩衝液稀釋，加辛酸(30 ul/ml腹水)， 室溫下邊加邊攪拌，4。C澄清l小時，12000 rpm離心20 min，收集上清，再用 50%飽和硫酸銨沉澱免疫球蛋白，4。C放置2小時，3000-5000 rpm離心20 min， 沉澱用2倍體積的PBS溶液溶解，在4'C流動透析24小時後即獲純化的腹水抗 體，-70。C保存。
5) 單克隆抗體的亞類鑑定和腹水效價測定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠IgG、 IgG!、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗，結果為，1C1的抗體類型及亞 類為Ig^，單克隆抗體的輕鏈為K鏈。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效 價，結果為上述腹水效價均在10_6以上。 4.檢測四環素殘留的直接競爭ELISA方法的建立 1)四環素-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯產物的製備a) 將1000mg的四環素鹽酸鹽溶解於20ml超純水中；
b) 3000mg的HRP溶解於l 10ml的0.1-0.2M pH3-6的醋酸鈉緩衝溶液中；
c) 將上述兩種溶液混勻後，在攪拌狀態下逐滴加入25。/。的甲醛3000ul，加畢 後在10-35"下避光攪拌反應1-48小時，合成四環素-HRP偶聯產物；
d) 四環素-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯產物放入透析袋中，用pH7.2的磷 酸鹽緩衝液(PBS)在4"C透析l-3天；
e) 透析後的四環素-HRP偶聯產物、四環素、HRP溶液進行紫外掃描，鑑定 偶聯產物，分析發現偶聯產物的紫外掃描圖形與四環素、HRP的掃描圖形明顯 不同，說明四環素己與HRP偶聯成功，偶聯產物分裝後於-2(TC冰箱保存，用於 檢測四環素類抗生素的競爭ELISA方法。
2) 直接競爭ELISA方法條件優化
用方陣試驗法對抗體和酶標半抗原的進行一系列濃度的稀釋，確定直接競 爭ELISA法抗體和酶標半抗原的最適工作濃度。OD45o值約為1.0,抗體抗原用 量較少的濃度組合，即為抗體-抗原的最佳工作濃度。首先，將單抗用PBS (0.01 M,pH7.4)稀釋成一系列濃度，分別依次加入96孔酶標板(100jaL/we11)， 37 °C 下溫育2h，PBST洗滌3次；用含2.0X脫脂奶的PBS封閉，每孔300 pL， 37 °C 溫育0.5h，後用PBST洗滌3次；加入預先以PBS稀釋成不同濃度的酶標半抗 原，在微量震蕩器上混勻，37 'C下溫育1 h， PBST洗滌3次；加入底物溶液(IOO (jL/wel1)， 37 。C溫育15 min，加入終止液(50 pL/wel1)，用酶標儀測定各孔的
OD45Q值。
3) 抗體親和性及檢測靈敏度
在優化的條件下，在預先包被好單抗的酶標板上，加入系列濃度的四環素
標樣，每濃度3孔重複，設不加四環素對照和溶劑空白對照，50nL/wel1,再加入
0.22pg/ml酶標半抗原50pL，震蕩l min後37 。C下溫育l h， PBST洗滌4次；加
入TMB底物溶液(100 pL/wel1)， 37 。C溫育15 min，加入2M硫酸終止液(50
^L/wdl)，用酶標儀測定各孔的OD，值。以抑制率與四環素濃度的半對數繪製
標準曲線。抑制率I計算公式如下
(ODmax-ODmin) - (ODx-ODmin) 1%= (ODmax- ODmin) Xl00
式中OD^r不加抗生素的吸光值；ODr抗生素濃度為X時的吸光值；ODmin-空白對照孔的吸光值。
以抑制率達到50%的抗生素濃度(IC5Q)來表示抗體對四環素的親和性，以Ido作為ELISA方法的檢測靈敏度。在優化的ELISA分析條件下，對四環素建 立標準曲線，以考察其在最優化的反應體系中的檢測靈敏度。根據競爭ELISA 反應標準曲線計算得單抗對四環素的ICs。為5.21 ng/ml， IC,。為0.35 ng/ml。 4)單抗的特異性
在優化的條件下，將鹽酸四環素標準品、土黴素、金黴素、鏈黴素、卡那 黴素、青黴素、慶大黴素、氯黴素、作系列稀釋，分別與單抗進行直接競爭ELISA， 製作標準曲線，並在曲線上找出抑制率50%的濃度，以及上述幾種物質50%抑 制率的濃度，然後計算出各類抗生素的交叉反應率。交叉反應率CR計算方法為 CRn/。二四環素IC5。/其它抗生素IC5Xl00。結果表明，1C1單抗與土黴素、金黴 素交叉反應率分別為30%、 65%，而與慶大黴素、卡那黴素、鏈黴素、青黴素、 氯黴素的交叉反應率均小於0.1%。說明單抗能檢測食品中的四環素類抗生素殘 留。
5. 抗四環素類抗生素多抗的製備
用四環素與載體蛋白偶聯產物免疫鼠、兔子、羊、驢、牛、禽等動物製備 多抗。初次免疫採用偶聯產物人工抗原(0.1-5mg)與等體積弗氏完全佐劑 (complete freund'sadjvant,CFA)充分乳化，然後皮下或皮內或肌肉小量、多點 注射；間隙2-4周後，再用弗氏不完全佐劑(incomplete freund，s adjvant, IFA) 與抗原充分乳化，然後皮下或皮內或肌肉小量、多點注射進行加強免疫；間隙 2-4周，進行2-5加強免疫；末免不加佐劑，直接肌肉注射，末免後7-10天後採 血。每次免疫後4-8採少量血，進行ELISA效價的測定，效價滿意後大量採血， 離心分離血清。用蛋白A/G親和柱純化IgG純化的IgG用於食品中四環素類檢 測的免疫學方法。
6. 免疫層析試紙條的製備 膠體金的製備及單抗的金標記
膠體金顆粒製備在100ml去離子水中加入P/。檸檬酸三鈉lml，煮沸後迅 速加入l。/。氯金酸lml，繼續煮沸15min，冷卻後，4'C下保存備用。通常情況下， 製備好的膠體金顆粒的大小平均為30 nm。 單抗的金標記
取己製備好的膠體金溶液100ml，用O.l mol/L碳酸鉀溶液調pH至(j8.0。邊攪 拌邊加入單抗2.0mg，攪拌15min，再逐滴加入2.5 ml 25 mg/ml聚乙二醇20000
(PEG 20000)，攪拌20min。 20 000 r/min離心20 min，棄上清液，力口入10mlpH 7.4PBS緩衝液(含0.4mg/mlPEG)清洗2次。將沉澱用5ml含2% BSA的PBS緩衝液(pH7.4)溶解，用0.22nm無菌過濾器過濾後，4 。C保存備用。
免疫層析試紙條的組裝
用點膜機把適當濃度的四環素-BSA抗原及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別 作為檢測線(T)和控制線(C)，在37'C烘箱乾燥8h。以同樣方法，將製備好 的金標記四環素單抗包被在膠體金結合墊上。將樣品墊、膠體金結合墊、硝酸 纖維素膜及吸水墊依次粘貼在底板上，從而組成一個連續的微濾體系。將貼好
的板切割成4mm寬的條，裝入模板中製成檢測試劑板，避光、密閉、常溫保存
備用o
用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴(約100ul)於上述試劑板的加樣孔中， 加樣後開始計時；結果應在3-5分鐘內讀取，其他時間判讀無效；讀取結果時， 檢測試劑應圖3右側所示擺放方式置於觀察者正面。根據觀察區的T、 C線的顏色 比對來確定結果，T線顯色比C線深或者相等時，結果判定為陰性。當T線顏色顯 色比C線淺時，檢測結果為陽性。
將鹽酸四環素標準品配置成不同濃度的分析試樣溶液0、 1、 3、 5、 7、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100 ng/ml，用檢測試紙條進行測定， 每個試樣做3個重複，5min後觀察結果，檢測結果表明，當樣品中四環素殘留 藥物的含量達到或超過0.85g/ml，由於大多數單克隆抗體被樣品中的四環素殘留 競爭結合，T線的包被抗原結合到的四環素單克隆抗體就很少或者沒有，T線的 顯色明顯比C線淺或不顯色，結果為陽性；當樣品中四環素殘留的含量低於 0.56ng/ml時，T線呈色與C線一致或比C線淺，結果為陰性；無論是陽性還是 陰性結果，膠體金-四環素單抗結合物總能與C線處的羊抗鼠IgG結合，形成一條 紫紅色的條帶。如果，C線不顯色，無論是T線有無，這時的結果均無效。 檢測試劑板的穩定性試驗
用同一批次不同檢測試劑板檢測同一樣品，及用不同批次檢測試劑板測定 同一樣品，其質控線、檢測線的顯色時間及顏色深淺和最終結果判讀基本相同。 將相同批次的試劑板置於37i:、室溫、4"C密閉保存3個月，每2周各檢測陽性和 陰性奶樣各20份，結果顯示隨著時間和溫度的變化，檢測結果未發生大的變化。 根據37"C下一天相當於1周估算，本試劑板可以在室溫下保存12個月。
權利要求
1. 一種四環素與載體蛋白偶聯產物的製備方法，其特徵在於包括如下步驟a)將5-1000mg的四環素鹽酸鹽溶解於1-20ml超純水中；b)10-3000mg的載體蛋白溶解於1-110ml的0.1-0.2M pH3-6的醋酸鈉緩衝溶液中；c)將上述兩種溶液混勻後，在攪拌狀態下逐滴加入25％的甲醛10-3000ul，加畢後在10-35℃下避光攪拌反應1-48小時，合成四環素-載體蛋白偶聯產物；d)四環素-載體蛋白偶聯產物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸鹽緩衝液在4℃透析1-3天；e)透析後的四環素-載體蛋白偶聯產物進行紫外掃描，分析鑑定偶聯產物及濃度測定，分裝後於-20℃冰箱保存備用。
2. 根據權利要求l所述一種四環素與載體蛋白偶聯產物的製備方法，其特徵 在於所述的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種 球蛋白、酶或卵清蛋白。
3. —種如權利要求l所述方法製備的四環素與載體蛋白偶聯產物的用途，其 特徵在於所述的四環素-載體蛋白偶聯產物可免疫動物製備四環素類抗生素抗體 及作為人工抗原應用於食品中四環素檢測的免疫學方法。
4. 一種抗四環素類抗生素單抗的製備方法，其特徵在於包括如下步驟.-1) 四環素-載體蛋白偶聯產物作為免疫原免疫BALB/C小鼠；2) 取免疫鼠的脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞在50 %聚乙二醇融合劑下融合， HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法篩選分泌抗四環素類抗生 素抗體的細胞；3) 採用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩 定傳代並分泌抗四環素類抗生素特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，雜交瘤細 胞注射入BALB/C小鼠腹腔製備單抗腹水；4) 採用直接競爭ELISA方法測定抗四環素類抗生素單抗與土黴素、金黴素、 鏈黴素、卡那黴素、青黴素、慶大黴素、氯黴素的交叉反應率，選擇僅與四環 素類抗生素有特異性免疫反應，且檢測靈敏度達到0.5-3 ng/mL的單抗。
5. 根據權利要求4所述的一種抗四環素類抗生素單抗的製備方法，其特徵在 於所述的免疫原是根據權利要求1方法偶聯的四環素-載體蛋白偶聯產物。
6. 根據權利要求4所述的一種抗四環素類抗生素單抗的製備方法，其特徵在 於所述的免疫原的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種球蛋白、酶或卵清蛋白。
7. —種如權利要求4所述方法製備的抗四環素類抗生素單抗的用途，其特徵 在於，四環素單抗用於檢測食品中四環素類抗生素殘留的免疫學方法。
8. 根據權利要求7所述的一種四環素類抗生素單抗的用途，其特徵在於所述 的用於檢測食品中四環素類抗生素殘留的免疫學方法為競爭ELISA或免疫檢測 試紙條。
9. 一種用權利要求1所述方法製備的偶聯產物免疫鼠、兔子、羊、驢、牛或 禽製備抗四環素類抗生素多抗的製備方法，其特徵在於包括如下步驟1) 初次免疫採用0.1-5mg偶聯產物抗原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化後 皮下或皮內或肌肉小量、多點注射免疫；2) 每間隙2-4周，用弗氏不完全佐劑與偶聯產物抗原充分乳化後皮下或皮 內或肌肉小量、多點注射，進行2-5加強免疫；3) 末免不加佐劑，加倍劑量肌肉注射免疫，末免後7-10天後採血，離心分 離血清；4) 用蛋白A/G親和柱純化IgQ純化的IgG凍乾冰箱保存。
全文摘要
本發明提供一種四環素與載體蛋白偶聯產物、四環素類抗生素抗體製備的方法及用途。用本發明偶聯的四環素人工抗原免疫動物製備可用於食品中四環素類抗生素檢測的抗體；免疫的BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞融合，用與載體蛋白偶聯的四環素作為包被抗原篩選陽性雜交瘤細胞、經細胞克隆獲得能穩定傳代並分泌抗四環素類抗生素抗體的雜交瘤細胞，並製備腹水單抗。利用製備的抗體建立了對四環素類抗生素具有高度特異性、靈敏性和精確性的直接競爭ELISA方法及免疫膠體金試紙條，可為快速檢測食品中四環素殘留服務。
文檔編號C07K14/435GK101429244SQ20081016259
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者吳建祥, 張少恩 申請人:浙江大學