白蛋白的純化方法

2023-12-03 06:13:41

專利名稱：白蛋白的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種白蛋白的純化方法，更具體地說是涉及從人體血漿組份Ⅴ中純化白蛋白的方法。
眾所周知，白蛋白是血漿中最大部分的蛋白質，在血漿組份Ⅴ中含量尤為豐富，白蛋白的濃度約為40克/升血漿。單體形式的白蛋白分子量為66，000至69，000。一般來說，白蛋白可以從人血中分離出來首先，將血液分離成許多小組份，如血漿、血清。血細胞等，接著再將其分離成許多亞組份，例如組份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、和Ⅴ。白蛋白可進一步從組份Ⅴ沉澱中濃縮並純化而得到。從血漿中純化白蛋白的最普通方法是Cohn的冷醇沉澱方法[Cohn等，Journal American Chemical Society 68，459-475(1946)]。Cohn方法是通過用乙醇濃度的遞增及pH遞減的順序沉澱來分離血漿蛋白，所需的白蛋白大多存在於組份Ⅴ沉澱中。
當白蛋白用於化學領域或醫藥領域中時，一般都需要高純度、穩定且濃度高的產品，必須將混雜於白蛋白中的其它汙染蛋白去除掉，所以，純化白蛋白的步驟，也被稱為組分Ⅴ加工的步驟是必不可少的。在加醇沉澱法中，由於沉澱過程中會使白蛋白變性及沉澱中的白蛋白的機械損失，從組分Ⅴ中對白蛋白加工的得率低達10-15%。另外，在該組分Ⅴ加工中也會形成白蛋白的聚合物及二聚物，這不僅減少了純化白蛋白單體的得率，另外由於白蛋白聚合物引起不需要的免疫應答，故這種產物也會對人體產生副作用。因此，長期以來人們希望能開發出一種從組分Ⅴ沉澱中純化白蛋白單體的新方法。
本發明的一個目的在於提供一種純化白蛋白的新方法，用該方法純化可得到高純度的白蛋白單體，其聚合物和二聚物形式的白蛋白收率則極低。
本發明的白蛋白純化方法的特徵在於該方法包括下列步驟(Ⅰ).將純化白蛋白系統中的乙醇濃度調節至8-13%(重量)，pH調節至4.5-4.8;
(Ⅱ).從溶液中除去沉澱;
(Ⅲ).將濾液的pH增至4.8-6.5，從溶度中除去乙醇;
(Ⅳ).從溶液中除去沉澱物。
下面，我們將對本發明的白蛋白純化方法作詳細的闡述。
在-3～8℃溫度下，將適量組分Ⅴ沉澱溶於8～13%，較好地溶於9～11%的乙醇水溶液中以得到蛋白質濃度為5～8%的混合物，將該溶液的pH進一步調節為4.5～4.8。通過過濾除去沉澱。
將濾液的pH調節至約4.8～6.5，較好調至5.1～5.3後，從溶液中除去乙醇，直至其中的乙醇濃度低於0.05%為止。所述的從濾液中除去乙醇的步驟可通過超濾滲析、基於分子大小分離溶液組份的壓力驅動膜方法來進行，在滲析過程中，鹽濃度的減少率與醇濃度的減少率相同，若溶液混濁，再進行過濾以得到純化的白蛋白溶液。
可用常規的方法使所述的白蛋白溶液穩定。通常向溶液中對於每克蛋白質加入0.08毫摩爾N-乙醯基DL-色氨酸和辛酸鈉。將溶液的pH調節至6.8-7.2。使調節好的溶液在60℃下加熱消毒10至20小時。
用於本發明中的組分Ⅴ沉澱可從Cohn方法得到在-5℃及攪拌下，通過毛細噴嘴向血漿中加入乙酸鹽緩衝液及乙醇-水混合物(0.163%(摩爾)乙醇)，加入速率以50cc至500cc/分鐘遞增，通過加入乙酸鹽緩衝液可使pH控制在4.8，最終得到了沉澱形式的組分Ⅴ。
本發明的方法是一個簡單而有效的方法，系將組分Ⅴ加工方法與超濾純化方法的構思加以合併改進以替代組分Ⅴ加工的方法。根據本發明的方法，白蛋白的純度高於97%，這與組分Ⅴ加工方法所得的純度相當。值得注意的是，用本發明方法純化的白蛋白中，單體形式含量較高，白蛋白中其聚合物和二聚體的含量比用常規組分Ⅴ加工方法純化所得的白蛋白中的含量要低得多。因此，用本發明方法純化的白蛋白可放心地用於治療中而不會產生任何由白蛋白聚合物所引起的不需要的免疫反應。
下面根據實施例對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明不為這些實施例所限定。
實施例1在攪拌及3℃溫度下，向盛有747克水的罐中依次加入212.44克組分Ⅴ沉澱及38.4克95%酒精。使沉澱懸浮有乙醇-水中後，用0.5M NaOH和pH4.0緩衝液使混合物的pH調節至4.58。稱取0.8克硅藻土預置於濾器上，用60℃或60℃以上的注射用水衝洗NA 30KP和/或NA600RP濾器時間不少於15分鐘，然後用冷注射用水衝洗直至濾器中流出液體的水溫為10℃或更低。混合物過濾後，濾器用40.0克10%乙醇-水後洗。加入0.5M NaOH使濾液的pH調至5.42，用超濾(UF)系統滲透來進行初步濃縮，向超濾系統的容量罐中加入注射用冷水以進行恆體積洗滌。最後，使濾液濃縮至22～24%固體。
在適當攪拌下，以1.0毫升/分鐘的速率向產物溶液中加入4.53毫升穩定溶液(N-乙醯基DL-色氨酸和辛酸鈉)。混合10分鐘後，加入0.5M NaOH使穩定的白蛋白材料的pH調節至6.9。在60℃水浴中加熱產物10個小時以得到pH6.9的20%白蛋白溶液。
實施例2除了用178.01克組分Ⅴ、41克95%酒精和753克水的混合物，並將其pH調至4.62外，其它用實施例1的方法可得到純化的白蛋白溶液。
比較實施例將組分Ⅴ沉澱在0℃下溶於6份體積水中，在約2小時內向溶液內加入1體積53.3%乙醇，在加入期間使溫度降至-2至-3℃。輕輕攪拌所得的混濁溶液2小時，然後通過過濾使其澄清。
使溫度降至-5℃，同時將乙醇濃度增加至40%時白蛋白從濾液中沉澱出來。為了使沉澱對乙酸的吸附最小，通過加入足量的碳酸氫鈉而使pH值在5.0至5.2間，接著在-5℃溫度下於2小時內對於每毫升濾液加入545毫升95%冷乙醇。在-5至-6℃下通過離心或過濾可以得到沉澱出來的白蛋白。
試驗將實施例1和2純化所得的產物與對比實施例中純化所得的產物就白蛋白純度及HPLC分析所得的分子大小分布狀態等幾方面進行比較，結果列於下表Ⅰ中。
表Ⅰ 白蛋白質量試驗
由上可知，用實施例1和2的方法純化的白蛋白，其單體含量較高，聚合物、二聚體、N-基體和碎片的含量較比較實施例的產物低。
權利要求
1.一種白蛋白的純化方法，其特徵在該方法包括下列步驟(Ⅰ).將純化白蛋白系統中的乙醇濃度調節至8～13%(重量)，pH調節至4.5～4.8；(Ⅱ).從溶液中除去沉澱；(Ⅲ).將濾液的pH增至4.8～6.5，從溶液中除去乙醇；(Ⅳ).從溶液中除去沉澱物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的純化白蛋白系統包括5～8%(重量)白蛋白和其它蛋白質，8～13%(重量)乙醇及水。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於其中將組分Ⅴ溶於9～11%乙醇水溶液中以得到純化白蛋白系統。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於其中的溶解過程在-3～8℃溫度下進行。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(Ⅲ)中pH被調節至5.1～5.3。
6.根據權利要求1或5所述的方法，其特徵在於在步驟(Ⅲ)中，從濾液中除去乙醇使其濃度低於0.05%。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於用超濾滲析法除去乙醇。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於通過過濾除去沉澱。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於其中過濾在硅藻土濾器上進行。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於該方法進一步包括步驟(Ⅴ)向溶液中相應於每克蛋白質加入0.08毫摩爾N-乙醯基DL-色氨酸和辛酸鈉後對白蛋白溶液進行穩定和消毒。
全文摘要
本發明涉及一種白蛋白的純化方法，其特徵在於將白蛋白純化系統中的乙醇濃度調節至8～13％(重量)，pH調節至4.5～4.8；除去沉澱；將濾液的pH增至4.8～6.5，再從溶液中除去乙醇，接著從溶液中除去沉澱。根據該方法所得的白蛋白純度高於97％。值得注意的是與常規的純化方法相比，本發明純化所得的白蛋白單體含量高，聚合物及其它雜質形成少，可以有效地用於治療及化學領域。
文檔編號C07K1/36GK1087914SQ9211426
公開日1994年6月15日 申請日期1992年12月11日 優先權日1992年12月11日
發明者張宗彥, 基·黃 申請人:上海萊士血製品有限公司