人c－型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品的製作方法

2023-12-02 20:38:26

專利名稱：人c－型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品的製作方法
技術領域：
人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品，屬於長效重組融合蛋白藥物技術領域。
背景技術：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血漿中的主要蛋白成分，在血漿中的濃度為40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有維持血漿滲透壓功能外，還能結合內源性和/或外源性配體，包括激素、有毒代謝產物、藥物等。通過結合這些配體，HSA可以調節激素活性、內源性和/或外源性物質的毒性和藥物的利用度(Ji-Sook Haet al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640119-128)。David S.Park等構建的HalfHSA(截取HSA的前297個胺基酸殘基)具有野生型HSA相應區類似的二級結構，同時保留了野生型HSA結合甲狀腺素和甲狀腺素類似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48169-174)，細胞中剛翻譯出來的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein結構，包括18個胺基酸殘基的信號肽和6個胺基酸殘基前肽的原肽。信號肽和前肽在轉運和分泌的過程中被切除，成熟的HSA由585個胺基酸殘基組成，含有17對二硫鍵，分子量約為66.5KDa。通常情況下，HSA為非糖基化蛋白，然而有的突變體中也存在N-連接糖基化(見Uniprot中的protein ALBU_HUMAN)。Peters的觀點認為進化出大分子蛋白的優點是減小其在內循環時經腎排洩(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37161-245)。HSA的分子量相對較大，在正常情況下，不易被腎小球濾過，其血漿半衰期在20天左右。
人C-型利尿鈉肽(typc C natriutetic peptides，CNP)主要存在於中樞神經系統，由血管內皮細胞合成和分泌，通過與靶細胞的血管平滑肌細胞上的特異性NP-B受體結合，激活與質膜相連的鳥苷酸環化酶，促進第二信使cGMP積累，導致cGMP依賴蛋白激酶磷酸化，通過降低細胞內鈣離子濃度，使血管平滑肌鬆弛，達到調節局部血管張力的作用，並阻止血管平滑肌增生。CNP是一種強的非內皮依賴性的外周靜脈擴張劑，在許多神經系統疾病及其它疾病中的潛在作用價值越來越受到廣泛重視。血漿中CNP濃度很低，以pg濃度存在，半衰期較短，約為2.6分鐘，這些特性給CNP的藥物化造成了很大的障礙，研究CNP的藥物化，首先要改善它的穩定性，提高其生物利用度。為了克服上述缺點，可以對CNP加以修飾，以延長其半衰期。主要方法有做成緩釋劑型、利用化學手段修飾(如用PEG，葡聚糖修飾)、利用基因工程手段將其與其它大分子蛋白融合。本發明將把CNP和HSA進行融合表達，通過研發人CNP的長效化技術，改善CNP體內藥代動力學性狀，研發出一種具有自主智慧財產權的長效新藥。

發明內容
本發明的目的是提供一種人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品。本發明的融合蛋白在保持了人C-型利尿鈉肽的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，在藥學領域有良好的應用前景。
本發明的技術方案從人血管內皮細胞中提取RNA，通過RT-PCR反轉錄得到CNP cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術，連接HSA cDNA和CNP cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-CNP cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；HSA-CNP cDNA融合基因在宿主系統進行表達，HSA-CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中。
CNP cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA和CNP cDNA融合基因的克隆，融合蛋白HSA-CNP的重組酵母構建和融合蛋白HSA-CNP的表達的步驟詳見實施例。
用上述方法製備的人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區和與人C-型利尿鈉肽至少85％序列同源的第二區；所述與人血清白蛋白同源的第一區位於融合蛋白的N末端，所述與人C-型利尿鈉肽同源的第二區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人C-型利尿鈉肽同源的第二區位於融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
優選的是所述融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區和與人C-型利尿鈉肽至少95％序列同源的第二區。
所述融合蛋白的第一區可以由人血清白蛋白部分結構域組成、或經結構域重排後的人血清白蛋白組成，包括所有HSA天然存在的多態型外，還包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名為HSA(1-n)，n為369-419。
所述融合蛋白包括與人血清白蛋白胺基酸殘基序列相同的第一區和與人C-型利尿鈉肽胺基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別胺基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
本發明的另一內容是提供表達融合蛋白編碼區的宿主。宿主系統是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞等表達系統。優選的宿主系統是酵母。優選的酵母是畢赤酵母。優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
CNP cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多個宿主系統中表達，如細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞，及生物體(如脊椎動物、昆蟲)等。在這些表達系統中目的基因被整合到宿主的染色體中或插入到質粒中。本發明優選的是酵母表達系統，該系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白後修飾系統，有利於大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢赤酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢赤酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利於純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
畢赤酵母表達系統分泌型表達載體主要有pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞內型表達載體主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，優選的是畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有His缺陷型的選擇性標記基因HIS4、AOX1啟動子、MFα分泌信號肽和G418抗性基因(可作為篩選重組子的標記)等元件。AOX1啟動子是一個強啟動子，可以高效的啟動目的基因的表達。在畢赤酵母裡共編碼兩種乙醇氧化酶AOX1和AOX2，細胞中絕大多數乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇為唯一碳源培養的細胞中，該酶可佔細胞總蛋白的30％以上。AOX2與AOX1的同源性雖然高達97％，但酶活很低。當AOX1基因缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細胞利用甲醇能力降低，細胞在甲醇為唯一碳源的培養基上生長很慢。
帶有融合cDNA的表達載體可以通過轉化鋰鹽法、PEG法、原生質體法或電穿孔法轉化宿主系統。成功轉化的細胞，即帶有本發明構建的DNA的細胞，可以通過本領域熟知的方法加以鑑定，如收集細胞，裂解後提取DNA，然後進行Southern雜交和PCR鑑定，也可在誘導表達後用HSA抗體和/或CNP抗體檢測培養液上清。
本發明的有益效果利用重疊PCR技術，連接HSA cDNA和CNP cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩定性(避免針對連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的問題。
優選的酵母表達系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白後修飾系統，有利於大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢赤酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢赤酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利於純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
可以通過培養帶有本發明構建的DNA的宿主系統，來生產本發明的融合蛋白。宿主系統培養優選在生物反應器上進行，培養分兩個階段，第一階段主要用於宿主系統生長，第二階段主要用於產物合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細胞培養物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉澱、超濾、層析、製備電泳等技術及這些技術的組合。


圖1.質粒pPIC9K-HSA-CNP構建圖2.融合蛋白基因的瓊脂糖電泳分析Lane1DNA Mark；Lane2PCR產物圖3.融合蛋白的SDS-PAGE分析Lane1蛋白質Mark；Lane2HSA-CNP圖4.融合蛋白的HSA抗體檢測Lane1蛋白質Mark；Lane2HSA-CNP具體實施方法實施例1CNP cDNA的克隆從人血管內皮細胞中提取RNA，通過RT-PCR反轉錄得到的CNP cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出CNP cDNA，所用的引物如下p15』CGGAATTCCACCATGCATCTCTCCCA-3』p25』AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCT-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，CNPcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經EcoR I和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoR I和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒EcoR I和NotI雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pBlue-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-CNP；實施例2HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15』-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3』PH25』-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA；實施例3HSA cDNA和CNP cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下P15』-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3』P25』-AGCAGCTGGGAGAGATGCATGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAG-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；CNP cDNA的PCR擴增，所用引物如下P35』-CAAGTCAAGCTGCCTTAGGCATGCATCTCTCCCAGCTGCT-3』P45』-AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCTCATGGAGCC-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-CNP 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性10分鐘，56℃退火45秒，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；利用重疊PCR融合CNPcDNA和HSA cDNA將CNP的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物以體積比1∶1比例混合後作為模板，在50μl的PCR反應體系中加入2.5mmol/L的dNTP4μl，10×pfuBuffer 5μl，5U/μl pfu DNA聚合酶1μl，混合好的模板2μl，雙蒸水36μl；PCR條件為95℃充分變性10min，65℃退火1min，72℃延伸4min30s，94℃變性1min。循環8次後，向反應體系中加入10μmol/L的P1和P4的引物各1μl，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.2kb的目標條帶，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經EcoRI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切後純化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K 5μl，加入10×ligation buffer 2μl，T4連接酶0.4μl，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒EcoRI和NotI酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA-CNP；實施例4HSA-CNP重組酵母表達系統構建及融合蛋白的表達融合蛋白HSA-CNP的重組酵母構建取一支凍存的DH5α/pBlue-HSA-CNP，接種到20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒，提取的質粒pBlue-HSA-CNP和酵母表達載體pPIC9K，分別經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段，取雙酶切後純化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligationbuffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取長出的菌落，接種於20ml氨苄青黴素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pPIC9K-HSA-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-HSA-CNP；提取DH5α/pPIC9K-HSA-CNP中的質粒，經SalI酶切後，電擊轉化畢赤酵母KM71，轉化物塗布於含有1mol/L山梨醇的MD平板上，於30℃，培養6天。每塊平板上用2ml水洗滌，收集洗滌液。取部分收集到的洗滌液，分別塗布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，於30℃，培養3～6天。挑取在最高濃度G418的YPD平板上的長出菌落，接種於20mlMD培養基中，30℃培養24小時，用常規方法提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑑定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-HSA-CNP；融合蛋白HSA-CNP的表達將KM71/pPIC9K-HSA-CNP接種至裝有100mlBMGY(100mM磷酸鉀、pH 6.0、1.34％無胺基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm值為2～6，離心收集菌體。將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY(100mM磷酸鉀、pH 6.0、1.34％無胺基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％(V/V)，誘導3天。離心收集上清，過濾除菌，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑑定融合蛋白HSA-CNP分子的CNP的免疫源性。
用放射免疫法鑑定上清中的HSA-CNP。參照C-型利鈉肽放免試劑盒(HY-044)的說明方法進行測定。取稀釋好的發酵上清液200μl，加入一抗100μl，搖勻放置於37℃水浴，6小時後取出加入125I-CNP標記100μl，搖勻於4℃放置過夜，之後加入500μl分離劑(二抗)，混勻室溫放置20分鐘，3500rpm離心25分鐘，去上清，由γ-記數儀測定沉澱cpm值並根據標準曲線讀出結果。Western雜交表明產物具有CNP和HSA的免疫源性。
權利要求
1.人C-型利尿鈉肽CNP與人血清白蛋白HSA的融合蛋白的製備方法，其特徵是從人血管內皮細胞中提取RNA，通過RT-PCR反轉錄得到CNP cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；用重疊PCR技術，連接HSA cDNA和CNP cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-CNP cDNA融合基因插入到克隆載體，HSA-CNP cDNA融合基因在宿主系統進行表達，HSA-CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中；(1)CNP cDNA的克隆以RT-PCR反轉錄得到的CNP cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出CNPcDNA，所用的引物如下p15』CGGAATTCCACCATGCATCTCTCCCA-3』p25』AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCT-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，CNP cDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經EcoRI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoR I和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒EcoR I和Not I雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pBlue-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-CNP；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15』AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3』PH25』-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA；(3)HSA cDNA和CNP cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下P15』-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3』P15』-AGCAGCTGGGAGAGATGCATGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAG-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；CNP cDNA的PCR擴增，所用引物如下P35』-CAAGTCAAGCTGCCTTAGGCATGCATCTCTCCCAGCTGCT-3』P45』-AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCTCATGGAGCC-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-CNP 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性10分鐘，56℃退火45秒，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；利用重疊PCR融合CNPcDNA和HSA cDNA將CNP的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物以體積比1∶1比例混合後作為模板，在50μl的PCR反應體系中加入2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfuBuffer 5μl，5U/μl pfu DNA聚合酶1μl，混合好的模板2μl，雙蒸水36μl；PCR條件為95℃變性10min，65℃退火1min，72℃延伸4min30s，94℃變性1min，循環8次後，向反應體系中加入10μmol/L的P1和P4的引物各1μl，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.2kb的目標條帶，純化好的目標片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經EcoRI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切後純化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K 5μl，加入10×ligation buffer 2μl，T4連接酶0.4μl，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒EcoRI和NotI酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存於-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA-CNP；(4)融合蛋白HSA-CNP的重組酵母構建取一支凍存的DH5α/pBlue-HSA-CNP，接種到20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒，提取的質粒pBlue-HSA-CNP和酵母表達載體pPIC9K，分別經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；取雙酶切後純化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligationbuffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取長出菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃；重組質粒命名為pPIC9K-HSA-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-HSA-CNP；提取DH5α/pPIC9K-HSA-CNP中的質粒，經SalI酶切後，電擊轉化畢赤酵母KM71，提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑑定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-HSA-CNP；(5)融合蛋白HSA-CNP的表達將KM71/pPIC9K-HSA-CNP接種至裝有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm為2～6，離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％(V/V)，誘導3天，離心收集上清，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交及放射免疫鑑定融合蛋白HSA-CNP分子的CNP的免疫源性。
2.用權利要求1所述方法製備的人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵是包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區和與人C-型利尿鈉肽至少85％序列同源的第二區；所述與人血清白蛋白同源的第一區位於融合蛋白的N末端，所述與人C-型利尿鈉肽同源的第二區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人C-型利尿鈉肽同源的第二區位於融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
3.根據權利要求2所述的人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區和與人C-型利尿鈉肽至少95％序列同源的第二區。
4.根據權利要求2所述的人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白的第一區由人血清白蛋白部分結構域組成或經結構域重排後的人血清白蛋白組成。
5.根據權利要求2所述的人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白包括與人血清白蛋白胺基酸殘基序列相同的第一區和與人C-型利尿鈉肽胺基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
6.根據權利要求5所述的人C-型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別胺基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是宿主系統是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞表達系統。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵是優選的宿主系統是酵母。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵是優選的酵母是畢赤酵母。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵是優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
全文摘要
人C－型利尿鈉肽(CNP)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的製備方法及產品，屬於長效重組融合蛋白藥物技術領域。本發明利用重疊PCR技術，將HSA cDNA和CNP cDNA進行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的HSA－CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿主系統中進行表達。本發明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區和與人C－型利尿鈉肽至少85％序列同源的第二區，該融合蛋白可以在不改變融合蛋白特性的前提下，進行個別胺基酸殘基的取代、缺失或加入。本發明的融合蛋白在保持了人C－型利尿鈉肽的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，改善其溶解度，在藥學領域有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/62GK101063123SQ200710020890
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月17日 優先權日2007年4月17日
發明者金堅, 張蓮芬, 陳偉, 李潔, 許正宏, 雷楗勇, 竇文芳, 史仲平 申請人:江南大學