一株同時降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌的製作方法
2023-12-03 02:33:56
本發明涉及一株同時降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌，屬於微生物技術領域。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種2A類致癌物，被認為是食品中繼黃麴黴毒素之後的又一重要汙染物。很多研究者在許多酒飲料和食品中檢測到了氨基甲酸乙酯的存在。自此，發酵食品中氨基甲酸乙酯的含量受到廣泛關注。已有報導檢測了不同香型成品白酒中EC的含量，結果顯示白酒中EC平均含量約為100μg·L-1，低於150μg·L-1的國際限量標準。其中，清香型、醬香型、藥香型及特香型白酒中EC含量較低，而濃香型、芝麻香型、鳳香型等白酒中EC含量偏高。
在烘焙和發酵食品中，經常在發酵液中添加尿素作為酵母的氮源。已有報導顯示尿素與乙醇反應可以生成EC；同時發現葡萄汁發酵過程中EC的主要來源是由精氨酸分解而來的尿素。日本研究者通過基因工程手段構建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，利用該酵母發酵發現沒有尿素的累積，並且EC含量大幅度下降。範文來、徐巖等也發現酒醅中尿素和EC的變化趨勢類似，二者之間具有一定的相互關係。酒飲料中的EC可能產生於蒸餾前、蒸餾時及蒸餾後各個階段，目前，普遍認為蒸餾前，也就是發酵階段形成的EC主要來源於尿素。
因此，獲取能降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌，對於以粟酒裂殖酵母作為主要功能微生物的發酵食品的生產就顯得尤為重要，對於食品安全具有重要貢獻。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明提供了一株降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)。
所述粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)，已於2016年6月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12715，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
所述粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715是從白酒酒醅中篩選得到的。
所述粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715具有如下特性：
(1)本發明的粟酒裂殖酵母菌對高粱汁中的精氨酸的降解能力達1.01mmol·L-1且只生成較少的尿素(0.54mmol·L-1)；
(2)本發明的粟酒裂殖酵母菌對，對高粱汁中的尿素的降解能力高達2.03mmol·L-1；
(3)產多種風味物質；
(4)用於酒精飲料發酵過程中，通過在發酵過程中適當提高其含量，可以有效降低精氨酸和尿素含量，有利於發酵過程中EC含量的降低。
本發明的第二個目的是提供含有所述CGMCC NO.12715菌株的微生物菌劑。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑含有CGMCC NO.12715菌體的活細胞、冷凍乾燥得到的CGMCC NO.12715幹菌體、固定化的CGMCC NO.12715細胞、CGMCC NO.12715的液體菌劑、CGMCC NO.12715的固體菌劑，或者以其他任何形式存在的CGMCC NO.12715菌株。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任何可以應用於食品或者食品製備的任意種屬的菌株，比如地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等等。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有保藏編號為CGMCC NO.12717的植物乳桿菌和保藏編號為CGMCC NO.12716的發酵乳桿菌。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑是將保藏編號為CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵母、保藏編號為CGMCC NO.12716的發酵乳桿菌、保藏編號為CGMCC NO.12717的植物乳桿菌分別活化後，按照體積比1:1:1混合得到液體菌劑。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任意能用於食品的載體。
本發明的第三個目的是提供所述微生物菌劑在食品技術領域的應用，尤其是應用於發酵食品技術領域。
本發明的第四個目的是提供所述CGMCC NO.12715菌株或者所述含有CGMCC NO.12715的微生物菌劑的應用，是應用於食品技術領域，尤其是發酵食品技術領域。
在本發明的一種實施方式中，所述應用，是應用於釀造酒、蒸餾酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黃酒、果酒方面。
在本發明的一種實施方式中，所述應用，是將所述CGMCC NO.12715菌株或者所述含有CGMCC NO.12715的微生物菌劑添加到白酒、葡萄酒、黃酒或者果酒釀造過程中。
本發明的第五個目的是提供一種酒精飲品的製備方法，所述方法是在酒精飲料的發酵過程中額外接種含有保藏編號為CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵菌的微生物菌劑到發酵基質中。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑以粟酒裂殖酵菌為唯一微生物；所述方法是在白酒發酵酒醅中額外接種CGMCC NO.12715菌株至107CFU/g酒醅。
在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑是將保藏編號為CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵母、保藏編號為CGMCC NO.12716的發酵乳桿菌、保藏編號為CGMCC NO.12717的植物乳桿菌分別活化後，按照體積比1:1:1混合得到液體混合菌劑。
在本發明的一種實施方式中，所述方法是在白酒發酵酒醅中額外接種微生物菌劑至微生物菌劑含量為107CFU/g酒醅。
在本發明的一種實施方式中，所述方法是微生物製劑按照總接種量107CFU/g酒醅接種至固態發酵培養基中，並接種10wt％的大曲，放置30℃恆溫培養箱中靜置發酵6d。
其中，固態發酵培養基的製備：稱250g高粱，加入350mL蒸餾水，於70-80℃培養箱中浸泡24h。將水瀝乾，稱取500g高粱於真空袋中，再加入25mL蒸餾水；121℃，滅菌20min；加酶糖化1d。
本發明的有益效果：
本發明的粟酒裂殖酵母菌，是目前能同時降解精氨酸和尿素且降解效果最好的粟酒裂殖酵母菌。本發明的CGMCC NO.12715對高粱汁中的精氨酸的降解能力達1.01mmol·L-1且只生成較少的尿素(0.54mmol·L-1)；對高粱汁中的尿素的降解能力高達2.03mmol·L-1；產多種風味物質；用於酒精飲料發酵過程中，通過在發酵過程中適當提高其含量，可以有效降低精氨酸和尿素含量，有利於發酵過程中EC含量的降低。
生物材料保藏
本發明所提供的粟酒裂殖酵母菌，分類學命名為粟酒裂殖酵母菌Schizosaccharomyces pombe，已於2016年6月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12715，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
本發明所提供的發酵乳桿菌，分類學命名為發酵乳桿菌Lactobacillusfermentum，已於2016年6月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
本發明所提供的植物乳桿菌，分類學命名為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum，已於2016年6月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12717，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
具體實施方式
EC含量測定參照文獻：頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工業科技,2012,33(14):60-63。
酒醅中尿素含量的測定
尿素含量測定參照文獻：Jimenez-Martin E,Ruiz J,Perez-Palacios T,et aL.Gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of free amino acids as their dimethyl-tert-butylsilyl(TBDMS)derivatives in animal source food[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(10):2456-2463。
實施例1：本發明的粟酒裂殖酵母對精氨酸、尿素的降解情況
酵母是將精氨酸轉化為尿素的主要菌群，由於生長需求，酵母需大量的氮源。環境中的精氨酸和尿素都可作為氮源供酵母吸收利用，但酵母優先利用精氨酸。因此，環境中精氨酸、尿素和酵母菌等都會影響發酵過程中尿素的含量，從而影響EC的含量。而酵母的數量和代謝能力是影響尿素水平的重要因素，研究發酵體系中酵母將精氨酸代謝成尿素的能力很有必要。
根據酒醅中精氨酸和尿素檢測結果設計代謝實驗中精氨酸添加量為300mg L-1(高粱汁培養基中本身含有一定的精氨酸，額外添加300mg L-1後總精氨酸含量約690mg/L，接近真實酒醅中精氨酸含量)，尿素添加量為200mg L-1。發酵採用高粱汁對實驗菌株進行精氨酸、尿素的代謝實驗。
實驗及對照組設定：
空白1：高粱汁培養基按2％接種量接種，不添加精氨酸及尿素；
實驗組1：添加300mg L-1精氨酸的高粱汁培養基按2％接種量接種；
實驗組2：添加200mg L-1尿素的高粱汁培養基按2％接種量接種；
其中，實驗菌株是按2％接種量接種到培養基中，30℃下靜置培養48～54h。測定發酵起點、發酵終點的發酵液中精氨酸、尿素的含量以及活菌數。
高粱汁培養基：將高粱:水＝1:4(M:V)，加澱粉酶蒸煮液化，60℃加糖化酶糖化，過濾離心，調節糖度至10°Bx。
選取發酵酒醅中篩出的4株對精氨酸和/或尿素代謝能力相對較強的酵母Saccharomyces cerevisiae C3、Zygosaccharomyces bailii C7、Schizosaccharomycespombe C11和Issatchenkia orientalis C16進行精氨酸和尿素的代謝能力實驗。
結果如表1所示。從表1中可以看出4株酵母菌都可以降解精氨酸生成尿素，但其能力有強有弱。S.cerevisiae C-3降解精氨酸生成尿素的能力雖然很強，但是對尿素的降解能力較弱，只有0.56mmol·L-1。S.pombe C-11對精氨酸的降解能力達1.01mmol·L-1且只生成較少的尿素(0.54mmol·L-1)，對尿素的降解能力高達2.03mmol·L-1，是4株酵母中最強的。針對這一特點，若在發酵過程中適當提高其含量，可以有利於發酵過程中EC含量的降低。
表1 4株酵母菌對精氨酸和尿素的代謝能力
粟酒裂殖酵母菌Schizosaccharomycespombe C11，已於2016年6月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12715。
此外，本發明還得到的能同時高效降解精氨酸和尿素的發酵乳桿菌CGMCC NO.12716(L. fermentum JSA30)、植物乳桿菌CGMCC NO.12717(L.plantarum JD19)，如表2所示。同時，植物乳桿菌CGMCC NO.12717和發酵乳桿菌CGMCC NO.12716，都能夠代謝產生酸類、醇類、酮類、酚類等物質，為白酒提供重要的風味化合物；CGMCC NO.12717和CGMCC NO.12716，於MRS培養基、30℃厭氧發酵2d後進入穩定期，菌體濃度分別可達OD600＝3.5、OD600＝2.4，發酵液pH分別為3.8、4.3；發酵36h後乳酸含量分別可達到24g/L、12g/L；發酵3d的乙酸產量分別可達5.7g/L、6g/L。
表2CGMCC NO.12716和CGMCC NO.12717對精氨酸和尿素的代謝情況
實施例2：粟酒裂殖酵母產風味物質測定
高粱浸出汁培養基：高粱200g→粉碎→加水800mL和高溫澱粉酶200μL→蒸煮20min→加入高溫澱粉酶200μL，蒸煮20min→冷卻後加入液化酶1mL→55℃保溫4h→過濾得濾液。
將粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715菌株種子液搖瓶培養1d後，按107CFU/mL接種量接入高粱浸出汁培養基於30℃培養箱中恆溫靜置培養6d。並檢測發酵結束時發酵液的風味物質。
運用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)方法分析。分別取8mL離心後的上清液和蒸餾液，放入裝有3g鈉鹽的頂空進樣瓶中。以4-甲基-2-戊醇為內標。旋緊瓶蓋，將頂空瓶置於50℃恆溫萃取45min。萃取完後進GC-MS分析，GC-MS分析條件見文獻。結果如表3所示。
表3主要風味物質
實施例3：CGMCC NO.12715的固態模擬發酵
固態發酵培養基的製備：稱250g高粱，加入350mL蒸餾水，於70-80℃培養箱中浸泡24h。將水瀝乾，稱取500g高粱於真空袋中，再加入25mL蒸餾水。121℃，滅菌20min。加酶糖化1d。
對照組：在額外有添加300mg L-1的精氨酸的固態發酵培養基中接種10wt％的大曲，30℃ 恆溫培養箱中靜置發酵6d。
實驗組1：將粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715的種子液以終濃度107CFU/g酒醅的接種量接種至額外有添加300mg L-1的精氨酸的固態發酵培養基中，並接種10wt％的大曲，放置30℃恆溫培養箱中靜置發酵6d。
實驗組2：將保藏編號為CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵母、保藏編號為CGMCC NO.12716的發酵乳桿菌、保藏編號為CGMCC NO.12717的植物乳桿菌分別活化後，按照體積比1:1:1混合得到液體混合菌劑。測定液體混合菌劑中的細胞濃度，然後以107CFU/g酒醅的接種量接種至額外有添加300mg L-1的精氨酸的固態發酵培養基中，並接種10wt％的大曲，放置30℃恆溫培養箱中靜置發酵6d。
實驗組3：與實驗組1相比，僅僅是將額外添加的300mg L-1精氨酸替換成額外添加200mg L-1尿素。
實驗組4：與實驗組2相比，僅僅是將額外添加的300mg L-1精氨酸替換成額外添加200mg L-1尿素。
實驗組和對照組各3個平行，結果取平均值，如表4-5所示。由表4可知，通過接種CGMCC NO.12715或者本發明的混合微生物菌劑強化發酵，可以有效降解精氨酸和尿素。同時，實驗組得到的產品風味更佳優良，尤其是實驗組2。
表4發酵結果
其中，Cit為瓜氨酸、Arg為精氨酸，Orn為鳥氨酸。Δ代表發酵後相應物質的含量-發酵前的含量，比如ΔCit代表發酵6d後發酵物中瓜氨酸含量減去初始培養基中的瓜氨酸含量。
表5發酵結果
可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬於本發明所附的權利要求的保護範圍。