一種禾穀孢囊線蟲lamp快速檢測方法及應用的製作方法

2023-12-02 15:49:06

專利名稱：一種禾穀孢囊線蟲lamp快速檢測方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種禾穀孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
禾穀抱囊線蟲(Heteroderaavenae Wollenweber, I 924),即 Cereal cystnematode (簡稱CCN，又名燕麥孢囊線蟲)，是全世界範圍內分布的禾穀類作物重要病原線蟲。該線蟲自1874年在德國被發現以來，目前在全世界40多個國家均有發生和危害，其中中國、澳大利亞、歐洲、印度、中東等地區的禾穀孢囊線蟲病危害嚴重並遭受了巨大的經濟損失。例如在澳大利亞禾穀孢囊線蟲的危害面積達到了 200萬公頃，一般產量損失23-50%，嚴重時損失73-89%，年經濟損失約7200萬澳元(Brennan J P, Murray GM.Aust ralian w heat disease assessing their economic import ance[J]. Agric.S c1.，1988，52(2) :176 一 183)。在歐洲主要的禾穀作物種植區，大約有50%以上的地塊受到禾穀孢囊線蟲的侵染，每年由禾穀孢囊線蟲造成的經濟損失約300萬歐元(AlexanderH M, Julie M N,Nematode parasites of cereals. Plant parasitic nematodes insubtropical and tropical agriculture[M]. Second edition. CAB international2005:1 3 1-1 9 I);在印度，禾穀孢囊線蟲引起小麥和大麥的「Molya」病害，小麥產量損失達 47. 2 %、大麥損失高達 87. 2 % (RivoalR. , Cook, R. , Nematode pests of cereals.1n:Plant Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. [B].Evaan K. et al. , Eds.Walling ford Press, UK, 1993，259-303)。在我國，禾穀孢囊線蟲自1989年在湖北天門縣矮黃麥株上首次發現以來[陳品三，王明祖，彭德良·我國小麥禾穀孢囊線蟲(Heterodera avenae wollenweber)鑑定研究[J]·植物病理學報，1992，22(4) : 339-343]，目前在我國小麥主產區的河北、河南、北京、山西、內蒙古、青海、湖北、安徽等16省、市和自治區均有發生和分布，危害面積達400萬hm2以上，且有逐漸蔓延之勢 ，目前已成為危害我國麥類作物的重要病原線蟲(彭德良等，我國小麥孢囊線蟲的新發生分布地區.中國線蟲學研究第二卷，2008，2:344-345;黃文坤，葉文興，王高峰，龍海波，歐師琪，彭德良，寧夏地區禾穀孢囊線蟲的發生與分布.華中農業大學學報，2011, 30(1) :74-77)。據調查，一般病田可減產20%_40%，嚴重地塊減產達70%以上[彭德良，張東升，齊淑華，陳品三等，我國小麥孢囊線蟲(Heterodera avenae)發生分布區域和防治初步研究.植物保護研究進展，1995，p53-56.中國科學技術出版社]。禾穀孢囊線蟲可寄生禾本科植物的27屬34種，對小麥、大麥、燕麥、黑麥等禾穀類作物危害嚴重[劉維志.病原植物線蟲學[M].北京中國農業出版社，1998. 294-303.]。目前小麥禾穀孢囊線蟲病已經對我國的麥類作生產構成了嚴重威脅，嚴重製約著麥類作物生產的發展，對該線蟲做出快速準確的鑑定是當前麥類作物生產急需解決的問題。傳統的孢囊線蟲檢測方法為形態學檢測。禾穀類孢囊線蟲組(Heteroderaavenae group)包括12個孢囊線蟲種，其中禾穀孢囊線蟲(H. avenae)和菲利普孢囊線蟲(H. filipjevi)形態特徵差異較小，主要差異為菲利普孢囊線蟲具有明顯的下橋(underbrige)結構。傳統的形態學鑑定,耗時較多且需要很豐富的專業知識,很難滿足目前的高通量快速檢測的要求。隨著分子生物學的發展，PCR等快速檢測技術已經廣發運用到植物線蟲的快速檢測中。目前運用到孢囊線蟲的檢測技術主要包括ITS-RFLP，PCR，real time PCR等。zheng等(2000)用Hinf I酶切歐洲H. avenae (A型)和印度群體(B型)後的結果與中國禾穀孢囊線蟲均不相同，稱其為「C型」 (Zheng, J.，Subbotin S. A.，WaeyenbergeL.，Moens Μ. , Molecular characterization of Chinese Heterodera glycines andH.avenae populations based on RFLPs and sequences of rDNA—ITS regions. RussianJournal ofNematology2000，8:109-113.)。彭德良等(2003)擴增了中國小麥禾穀孢囊線蟲群體的核糖體基因的內轉錄間隔區，用AluI和RsaI酶切ITS擴增產物證明中國禾穀孢囊線蟲ITS屬於「B型」，HinfI酶切揭示出中國與摩洛哥禾穀孢囊線蟲ITS之間存在明顯差異(彭德良，Subbotin S. Α·，M. Moens.小麥禾穀孢囊線蟲(Heterodera avenae)的核糖體基因(rDNA)限制性片段長度多態性研究.植物病理學報，2003，33 (4): 323-329)。Guiping Yan 和 Richard W. Smiley (2011)運用 rDNA-1TS 區域 RFLP 結合形態學鑑定的方法對美國部分地區的禾穀孢囊線蟲進行了檢測，該方法釆用6種限制性內切酶能夠區分禾穀抱囊線蟲和菲利普抱囊線蟲(Yan，G. P.，SmileyR. W.，Distinguishing Heteroderafilipjevi and H. avenae Using Polymerase Chain Reaction-Restriction FragmentLength Polymorphism and Cyst Morphology. Nematology2010, 3:216-224. )。Fu 等對我國黃淮海麥區的禾穀孢囊線蟲進行了 ITS和RFLP分析(Fu Boj Ian T. RileyiLi Honglianj etal. Molecular characterisation of cereal cyst nematodes in winter wheat on theHuang-Huai floodplain of China using RFLP and rDNA-1TS sequence analyses.Australasian Plant Pathol2011，40:277285)。在孢囊線蟲模式線蟲甜菜孢囊線蟲的檢測中，Amiri等通過對H. betae、H. cicer1、H. gly cines 和 H. medicaginis、H. schachti1、H. trifolii 的 ITS 序列進行分析，篩選出特異性引物SHF6，將此引物與AB28 (或ri)NA2)引物結合，構建了甜菜孢囊線蟲一步雙重 PCR 的檢測方法(Amiri S.，Subbotin S. A.，Moens Μ·，An efficient meth od foridentification of the Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR withspecific primers. Nemato1. medit. 2001，29:241-246)。Subbotin S A, Peng D Lj Moens M_ (2001)運用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個PCR反應體系中同時運用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和ri)NA2，從52個大豆孢囊線蟲群體中均擴增出兩個DNA片斷(181bp and345bp)，檢測的敏感度高達單個抱囊、單頭二齡幼蟲的微量 DNA(Subboton S. A.，Peng D L，Moens Μ·，A rapid methodforthe identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines usingduplex PCR. Nematology 2001，vol. 3 (4) : 365-371 )。0u，S. Q.和 Peng D. L 釆用 RAPD 技術，獲得了基於大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標記，同時和D2A和D3B相結合，發明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲。在PCR擴增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 500bp 的特異性 SCAR 標記片段和 800bp 片段(0u S. Q.，Peng D. L，Li Y.，MoensM.，Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region (SCAR)primers. Nematology2008, 10(3):397-403)。
亓曉莉等採用RAPD的方法，研究出禾穀孢囊線蟲特異性SCAR分子標記，該方法能夠特異的將禾穀孢囊線蟲與菲利普孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲和豌豆孢囊線蟲區分開，檢測靈敏度高達1/80條2齡幼蟲(亓曉莉，彭德良，彭煥，龍海波，黃文坤，賀文婦.基於SCAR標記的小麥禾穀孢囊線蟲(Heterodera avenae)快速分子檢測技術.中國農業科學，2012,45(21) :4388-4395)。同時，Ophel-Keller等開發出蟲土壤中直接檢測禾穀孢囊線蟲的real time PCR檢測技術,靈敏度達I個卵/lg(Ophel_Keller Kathy,McKayAlan, Hartley Di，Herdina and Curran, John. Development of a routine DNA—basedtesting servicefor soilborne diseases in Australia. Australian Plant Pathology,2008，37 :243-253)。以PCR為基礎的分子鑑定方法一定程度上彌補了傳統形態鑑定上的缺陷。但PCR檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(紫外儀)等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以檢測，需要較長的時間，限制了 PCR檢測方法在生產中的推廣應用，在禾穀孢囊線蟲發生分布調查中，迫切需要一種簡便快捷的檢測手段。循環恆溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification of DNA, LAMP)是2000年日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恆溫核酸擴增技術。(NotomiT,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T, Watanabe K, Amino N and Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification ofDNA [J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28 (12) : e63.),該技術通過識別靶序列上6個特異區域的引物和利用具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶，在恆溫條件下能特異、高敏、快速地擴增靶序列。該技術技術有如下特點1)特異性強、靈敏度高。LAMP反應正針對靶基因序列的6-8個特異性位點設計出4-6條引物，相比普通其他分子檢測方法具有更強的特異性。2)擴增反應時間短、設備要求簡單。LAMP反應具有極高的擴增效率，30-90分鐘內可將靶基因擴增IO9-1Oltl,同時擴增過程無需專業的PCR儀等設備，簡單的水浴即可完成反應。3)檢測結果可以肉眼直接觀察，簡便快捷。由於該檢測方法具有特異性強，靈敏度高，快速簡便等特點，目前已廣泛引用於人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測中。但在植物病原線蟲檢測中的運用剛剛起步，2008年日本科學家首次利用LAMP技術建立了從病木中直接檢測松材線蟲LAMP檢測的方法(Kikuchi T, AikawaT,OedaY, Karim N, Kanzaki N. A Rapid and Precise Diagnostic Methodfor Detectingthe Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated IsothermalAmplification. Nematology, 2009，12:1365-1369)。2011 年 Niu et al 等建立了南方根結線蟲LAMP檢測技術，能夠從土壤和根結中檢測出南方根結線蟲(Niu J H, Guo Q X，JianH,Chen C L, Yang D,Liu Q, Guo Y D. Rapid detection of Meloidogyne spp.by LAMPassay in soil and roots. Crop Protection, 2011，8:1063-1069)和象耳豆根結線蟲(NiuJ H, Jian H, Guo Q X, Chen C L, Wang X Y,Liu Q, Guo Y D. Evaluation of loop-mediatedisothermal amplification(LAMP)assays based on5S rDNA_IGS2regionsfor detectingMeloidogyne enterolobi1. Plant Pathology, 2011，02562. x)。2012 年彭德良首次以象耳豆根結線蟲ITS為靶標，建立了象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測技術，檢測靈敏度達到1/200000 條幼蟲(專利號201110034960)。2012 年彭煥等(Peng H, Peng D L, Hu X Q, He XF，Wang Q, Huang W K, He W T. Loop-mediated isothermal amplification for rapid andprecise detection of the burrowing nematode, Radopholus similis, directly fromdiseased plant tissues. Nematology, 2012, 14 (8) :977-986.)研究出從摧病植物組織中用LAMP快速和特異性檢測香蕉穿孔線蟲的方法，檢測極限達1/20000條幼蟲，靈敏度比常規PCR檢測高100倍。除此之外，LAMP檢測技術在禾穀孢囊線蟲上尚無相關報導，本發明首次建立了禾穀孢囊線蟲LAMP快速檢測方法。

發明內容
本發明的目的是建立循環恆溫擴增技術(LAMP)檢測禾穀孢囊線蟲的LAMP快速檢測方法，該方法具有靈敏度高、特異性強等特點，適用於各種實驗條件下檢測工作的使用，也適合在實驗條件不足的室外檢測。一種禾穀孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特徵在於其中LAMP反應體系所使用的引物是①HA5-F3 :5' -TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5' -TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGCTTCATTTGAGAACAATG-3' ;④HA5-FIP :5' -ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCATGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB :5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3' ;其中的LAMP反應體系包括 I)引物混合液外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L,內引物HA5-FIP和HA5-BIP 各1. 4 μ mol/L,環引物 HA5-LB 為 O. 4 μ mol/L ;2)反應混合液3.2mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/LKCl, 3mmol/LMgS04, lOmmol/L (NH4)2S04, 0. l%Triton x-100，8U Bst DNA 聚合酶大片段;3) I μ IDNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。其中LAMP反應條件如下將引物混合液和反應混合液混合均勻後加入I μ IDNA模板，61 65°C保溫 30 90min，85°C保溫 lOmin。LAMP反應的最終產物中加入顯色劑，輕甩離心管後觀察。所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1:9。所述DNA模板的提取方法為挑取單個禾穀孢囊放入裝有10 μ IddH2O的0. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出後置於冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8 μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然後在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理後上清液作為線蟲DNA模板直接用於 LAMP 和 PCR 反應，所述 LB 溶液為 500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT, 4. 5%Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。上述任一檢測方法在診斷植物、土壤的禾穀孢囊線蟲感染情況或鑑別禾穀孢囊線蟲中的應用。本發明利用循環恆溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamp Ii feat ion, LAMP)建立針對禾穀孢囊線蟲的檢測方法。本方法具有多條引物的擴增，並在兩端形成了帶有引物功能的環狀結構，這種多引物結合和可自產生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強等特點，由於LAMP反應操作步驟簡單及反應產物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉澱，螢光劑顯色後可以用肉眼觀察判定反應結果，適用於各種實驗條件下檢測工作的使用，也適合在實驗條件不足的室外檢測。本發明的方案具體實施步驟如下1.線蟲DNA提取試劑配製I) LB (Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCI, 10mmo I /I, Tris-HCl, 1 Smmol /I,MgCl2,1. Ommol/L DTT, 4. 5%Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。2)蛋白酶 K :600 μ g/ml 蛋白酶 K。2. DNA 的提取挑取單個禾穀孢囊放入裝有10 μ I ddH20的O. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出後置於冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然後在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理後上清液作為線蟲DNA模板直接用於LAMP和PCR反應。3.禾穀孢囊線蟲RAPD擴增及序列分析應用SCAR 標記弓丨物 0PD13-HaFl(5'-TGACGAGAACATATGATGGGGATGAT-3')和0PD13-HaRl (5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT—3')擴增禾穀孢囊線蟲 SCAR 片段。PCR 擴增反應體系為50μ 1，PCR反應體系為10 X Buffer (含Mg2+) 5 μ I, IOmM dNTP4 μ 1，引物0PD13-HaFl 和 0PD13_HaRl (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) 0. 5μ I,模板DNA5y 1，滅菌(1(1!120補足至5(^ I。PCR擴增條件為95°C預變性5min，59°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ;35個循環；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴增後，取5 μ I擴增產物加I μ I加樣緩衝液在1. 5%瓊脂糖 凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相回收、克隆和測序，序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。4.禾穀孢囊線蟲LAMP引物設計根據禾穀孢囊線蟲RAPD測序結果為模板，設計以下5條引物，序列如下①HA5-F3 :5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG-3' ;④HA5-FIP :5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCA TGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB 5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3' ;5. LAMP反應體系配置外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L,內引物HA5-FIP和 HA5-BIP 各1. 4 μ mol/L,環引物 HA5-LB 為 0. 4 μ mol/L, 3. 2mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 8)，I Ommol/L KCl, 3mmol/L MgSO4, I Ommol/L (NH4)2S04, 0. l%Triton x-100 和8U Bst DNA聚合酶大片段，I μ IDNA模板，用滅菌雙蒸餾水補足25 μ I。6. LAMP反應擴增條件將以上混合液置於65°C恆溫水浴中等溫擴增75min，再85°C保溫lOmin，反應結束後加入I μ I配製好的顯色劑混勻後觀察結果。7. LAMP結果檢測結果可以採用以下兩種檢測方法I)將上述反應完的體系中加入I μ I的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；2)取3 μ I擴增產物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；本發明所提供的禾穀孢囊線蟲LAMP快速檢測方法具有以下優點一、靈敏度高。對禾穀孢囊線蟲的檢測極限可達到1/200000條幼蟲水平，比常規PCR檢測禾穀孢囊線蟲的檢測靈敏度高100倍，也說明本發明設計的引物特異性非常好。二、特異性強。所用的特異引物根據禾穀孢囊線蟲的RAro片段六個不同區域設計出5條引物，特異性比常規PCR要強。三、檢測時間短。I小時左右可獲得檢測結果，比常規PCR檢測縮短2 4h。四、不需要PCR儀。對儀器設備要求低，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統，只需要一個水浴鍋或者保溫瓶就可以完成檢測。五、操作簡單、結果明顯。整個檢測過程不涉及複雜儀器和設備，一般技術人員即可完成檢測，結果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。六、對人和環境友好。檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環境非常安全。綜上所述，本發明具有比現有PCR技術檢測禾穀孢囊線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實際生產中現場應用檢測。該技術可應用於對禾穀孢囊線蟲田間土壤樣品及小麥孢囊線蟲病的發生早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。


圖1為禾穀孢囊線蟲RAPD序列的LAMP弓丨物設計示意圖，圖2為禾穀孢囊線蟲LAMP方法檢測，

A為加螢光染料檢測結果，1:陽性結果，具有綠色螢光，2 :陰性對照，為紅褐色。B檢測結果為電泳圖，M:D2000DNA標準分子量(Takara)1:陽性結果，為LAMP擴增梯形條帶，2 :陰性對照，無擴增產物。圖3為禾穀孢囊線蟲LAMP檢測方法特異性檢測結果圖A為LAMP加螢光染料檢測結果圖，I為陽性，2 11為陰性，B為LAMP檢測結果電泳圖，圖4為禾穀孢囊線蟲靈敏度檢測結果A為LAMP加螢光染料檢測結果圖，I 7分別為:單頭線蟲，10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和陰性對照。B為LAMP檢測結果電泳圖，M :D2000DNA標準分子量(Takara)，I 7分別為單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、I O-4、I O-5、10_6 和陰性對照。C為普通PCR法檢測結果電泳圖，M D2000DNA標準分子量(Takara)，I 7分別為單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、陰性對照。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。所述試劑均為市售，所用禾穀孢囊線蟲本申請人實驗室均有保存，可以免費向公眾發放。主要試劑Taq DNA聚合酶購自天根公司；DNA marker購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；pGEM_T EasyVector購於美國promega Pro K(蛋白酶K)購自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購自New England Biolabs公司；SYBR green I購自 Invitrogen 公司。
實施例1禾穀孢囊線蟲DNA的提取、RAPD擴增及序列分析1.1禾穀孢囊線蟲DNA的提取挑取單個禾穀孢囊放入裝有10 μ IddH2O的O. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出後置於冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然後在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理後上清液作為線蟲DNA模板直接用於LAMP和PCR反應。1. 2禾穀孢囊線蟲RAPD擴增及序列分析應用SCAR 標記引物 0PD13-HaFl(5'-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-GAT-3')和0PD13-HaRl (5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3' )擴增禾穀孢囊線蟲特異性 SCAR 片段。PCR擴增反應體系為50 μ 1，PCR反應體系為10XBuffer (含Mg2+) 5 μ l,10mMdNTP4y 1，引物 0PD13-HaFl 和 0PD13-HaRl (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) O. 5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補足至50 μ I。PCR擴增條件為95°C預變性5min，59°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ;35個循環；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴增後，取5 μ I擴增產物加I μ I加樣緩衝液在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相回收、克隆和測序，序列測定由北 京六合華大基因科技有限公司完成。實施例2LAMP技術檢測禾穀孢囊線蟲方法的建立2.1LAMP 引物設計根據禾穀孢囊線蟲 RAH)擴增序列測序結果，設計並篩選下述LAMP引物(見圖1)，引物交上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下①HA5-F3 :5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP :5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG—3' ;④HA5-FIP :5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCA TGGCAAAGA—3' ;⑤HA5-LB :5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG—3' ;2. 2LAMP反應體系配置引物混合液外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L，內引物HA5-FIP和HA5BIP各1. 4 μ mol/L,環引物 HA5-LB 為 O. 4 μ mol/L ；反應混合液3.2mmol/LdNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/LKCl, 3mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04, 0. l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。2. 3LAMP反應擴增條件將以上混合液置於65°C恆溫水浴中等溫擴增75min，85°C保溫lOmin，反應結束後加入I μ I配製好的顯色劑混勻後觀察結果(圖2中Α)。取2 μ I產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相，可看到有LAMP的特徵性梯形帶(圖2中B)。實施例3禾穀孢囊線蟲LAMP特異性檢測收集禾穀孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲、豌豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、香蕉穿孔線蟲(見表1)，分別提取其DNA作為模板與禾穀孢囊線蟲DNA模板一起進行LAMP檢測，以檢測禾穀孢囊線蟲LAMP檢測方法的特異性。
表I供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源
權利要求
1.一種禾穀孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特徵在於其中LAMP反應體系所使用的引物是①HA5-F3 5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5'-GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG-3';④HA5-FIP 5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCATGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB 5'-CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3'。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其中的LAMP反應體系包括1)引物混合液:外引物HA5-F3和HA5-B3各O.2ymol/L,內引物HA5-FIP和HA5-BIP 各1. 4ymol/L,環引物 HA5-LB 為 O. 4 μ mol/L ;2)反應混合液3.2mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8)，IOmmoI/L KCl, 3mmol/L MgSO4, IOmmoVL(NH4)2SO4, 0. l%Triton χ-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段;3)I μ I DNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其中LAMP反應條件如下將引物混合液和反應混合液混合均勻後加入I μ I DNA模板，61 65°C保溫30 90min，85°C保溫lOmin。
4.根據權利要求1-3任一所述的檢測方法，LAMP反應的最終產物中加入顯色劑，輕甩離心管後觀察。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1:9。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，所述DNA模板的提取方法為挑取單個禾穀孢囊放入裝有10 μ I ddH20的O. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出後置於冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的eOOyg/ml 蛋白酶K溶液，然後在-80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應 IOmin處理後上清液作為線蟲DNA模板直接用於LAMP和PCR反應，所述LB溶液為500mmol/ L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT，4. 5%Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。
7.如權利要求1-6所述的任一檢測方法在診斷植物、土壤的禾穀孢囊線蟲感染情況或鑑別禾穀孢囊線蟲中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種禾穀孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應用。根據克隆得到的禾穀孢囊線蟲RAPD序列，設計篩選5條LAMP引物HA5-F3、HA5-B3、HA5-FIP、HA5-BIP和HA5-LB；配製並優化了LAMP反應體系。通過對禾穀孢囊線蟲DNA提取，環介導等溫擴增、擴增產物顯色和觀察，從而快速檢測出禾穀孢囊線蟲。本發明的檢測方法特異性強、靈敏度高、成本低廉、操作簡便，在禾穀孢囊線蟲快速檢測和禾穀孢囊線蟲病的早期和田間診斷方面具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103045751SQ20131002038
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月20日 優先權日2013年1月20日
發明者彭德良, 徐小琴, 彭煥, 亓曉莉, 黃文坤, 賀文婷, 姜道宏 申請人:中國農業科學院植物保護研究所