一種黑莓組培苗葉片高效循環再生的方法

2023-12-02 12:21:21 3

專利名稱：一種黑莓組培苗葉片高效循環再生的方法
技術領域：
本發明涉及一種用黑莓組培苗葉片反覆循環再生的方法，屬於植物組織培養技術領域。
背景技術：
黑莓(Rubus spp.)為薔薇科懸鉤子屬半灌木漿果類果樹，果實為聚合果，營養豐富，富含糖、果酸及多種維生素，有防衰老和提高人體免疫力等功效，尤其是過氧化物歧化酶(SOD)含量為水果之最，是近年來國內外興起的第三代水果之一，具有很高的經濟價值。優良黑莓品種的培育和推廣具有重要的應用和經濟價值。目前，黑莓育種上多採用實生選優、雜交育種、輻射育種等常規育種手段為主，有一定的局限性，而且選育進程較慢，嚴重製約了黑莓優良品種的快速發展。

隨著分子生物學的發展，基因工程技術為黑莓育種開闢了新途徑。可以通過基因工程的方法，有針對性地引入特定基因，從而獲得具有優良性狀的轉基因植株。而基因成功實現轉化的關鍵在於擁有一個高效而穩定的不定芽離體再生體系。已有的黑莓組織培養的研究中，以莖尖、腋芽培養等快繁研究居多，但這些組織或器官多因取材時間或受農桿菌侵染的限制未能用於實踐。葉片具有易於取材和培養操作的優勢，而組培苗的葉片具有分生能力強、無菌不易汙染等特點，有助於提高葉片的再生頻率和遺傳轉化效率。目前黑莓離體再生研究已取得了較好成果，但都是單向的ー輪再生方法，國內外尚未見到有通過瓶外一次性取材，而達到瓶內永久循環再生黑莓苗的報導。

發明內容
發明目的本發明的目的是針對現有黑莓離體再生技術的不足，提供ー種利用黑莓試管苗葉片進行植株離體再生的方法，一方面為黑莓基因工程育種提供技術支撐，一方面為規模化生產快速提供優質苗木。本發明所述循環再生體系是指通過組織培養的手段，由不同培養階段的不定芽提供葉片，多重循環獲得再生苗的植物組織培養體系。具體內容為實現上述目的，本發明採用的解決方案是(1)瓶外獲得黑莓莖段誘導產生初代試管苗；(2)黑莓試管苗葉片離體再生為完整植株；(3)愈傷組織分化所得不定芽葉片的離體循環再生；(4)繼代増殖所得不定芽葉片的離體循環再生；(5)壯苗培養所得不定芽葉片的離體循環再生。(I)瓶外獲得黑莓莖段誘導產生初代試管苗的方法是以黑莓一年生枝條的半木質化莖段為外植體，用濃洗衣液浸泡衝洗後，於體積比為(70 75) %的酒精中浸(30 60) S，用無菌水衝洗3 5次，再用(O. I O. 2) %升汞浸泡(5 8)min ;然後將外植體切成(I. O I. 5) cm長的帶芽莖段，接種於不定芽誘導培養基上，培養(20 40) d，進行不定芽的繼代増殖，每隔(20 30)d繼代I次，繼代2次以上的試管芽苗作為葉片離體再生的材料。
所述的莖段誘導不定芽培養基為MS+6-BA(0 O. 5)mg/L+ZT(O. 5 I. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;所述的不定芽繼代增殖培養基為MS+6-BA(0 O. 2)mg/L+TDZ (O O. l)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;所述的培養條件為培養室溫度(25±3)で，光照度(1500 3000) lx，光照時間(12 14)h/d。上述解決方案中，誘導莖段形成不定芽的最佳培養基為MS+6-BA O. 3mg/L+ZT
O.5mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5. 6g/L，ZT濃度過高會使不定芽出現玻璃化，並且抑制不定芽的生長；不定芽繼代增殖最佳培養基為MS+TDZ0. 05mg/L+蔗糖(25 30) g/L+瓊脂5. 6g/
し
(2)黑莓組培苗葉片離體再生為完整植株的方法包括以下步驟①組培苗及其葉片的選擇當組培苗長至3葉以上時，選擇最長邊X最寬邊為
O.5cmX0. 5cm以上的葉片，去掉邊緣，修剪成(O. 4 O. 8) cm X (O. 4 O. 8) cm大小的葉塊；②誘導葉片形成愈傷組織將步驟①修剪好的葉片在接種時背面緊貼於培養基表面；愈傷組織誘導培養基為MS+TDZ(0. I I. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+瓊脂5. 6g/L，pH值5. 8 6.2 ;培養時先在溫度(25 ± 3) °C的條件下暗培養(10 15) d，當葉片邊緣開始捲曲膨大產生少量愈傷顆粒時，轉到光照度(1000 2000) lx、光照時間(12 14)h/d的條件下，培養(15 20) d後形成淡黃色、緻密的愈傷組織；③誘導愈傷組織分化不定芽將步驟②所得愈傷組織取下，切成(O. 3 O. 6)cmX (O. 3 O. 6) cm的塊狀，接種到愈傷組織分化培養基上；愈傷組織誘導分化不定芽培養基為MS+6-BA(O. 5 2. 0)mg/L+TDZ(O I. 0)mg/L+IAA(0 O. 5)mg/L+ 蔗糖(25 30)g/L+瓊脂5. 6g/L，pH值5. 8 6. 2 ;培養條件為培養室溫度(25±3)で，光照度(1500 3000) lx，光照時間(12 14)h/d，培養時間為(25 35) d ;④不定芽的繼代増殖將步驟③獲得的不定芽轉接於繼代增殖培養基中；繼代增殖培養基為MS+6-BA (O. 5 2. O) mg/L+ 蔗糖(25 30) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;培養條件為培養室溫度(25±3) °C，光照度(1500 3000) lx，光照時間(12 14)h/d，培養時間為(20 30) d;⑤不定芽的壯苗培養將步驟④中株高大於I. 5cm的不定芽轉接於壯苗培養基中；壯苗培養基為MS+6-BA (O. 3 O. 5)mg/L+NAA(0. 05 O. 2) mg/L+ 蔗糖(20 25) g/L+瓊脂5. 68/し？!1值5.8 6.2;培養條件為:培養室溫度(25 ±3) °C，光照度(1500 3000)lx，光照時間(12 14)h/d，培養時間為(15 20)d ;⑥不定芽的生根誘導將步驟⑤中獲得的組培苗轉接於生根培養基中；生根誘導培養基為1/2MS+NAA(0.03 O. l)mg/L+蔗糖(20 25) g/L+瓊脂 5. 6g/L, pH 值 5. 8 6.2 ;培養條件為培養室溫度(25±3) °C，光照度(1500 2000) lx，光照時間(12 14) h/山培養時間為(15 20) d;⑦生根苗的煉苗將步驟⑥獲得的黑莓生根苗置於室內散射光處，煉苗(3 5)d，然後打開培養瓶蓋，使組培苗於室內空氣接觸，(3 5) d後移栽至穴盤；⑧生根苗的移栽將步驟⑦煉好的黑莓生根苗從培養瓶中取出，挑選葉數為3 6個，生根數達3條以上，根系長達2. Ocm的生根苗，用水衝洗根部殘留的培養基，移栽入蛭石泥炭土 珍珠巖園土= 1:1:1:2的混合基質(經過高壓滅菌)中，移栽時應將組培苗的根系完全埋入基質中；澆足水後，保持溫度(20 25)で，溼度(70 80) %，放置於陰涼處，每周澆I次透水，(35 45) d後，黑莓組培苗的移栽成活率可達97%以上。上述解決方案中，其中幾個步驟的最佳優選培養基分別如下誘導葉片形成愈傷的最佳培養基為MS+TDZ O. 5mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5. 6g/L，高濃度的TDZ誘導形成的愈傷過於緊實，不利於不定芽的分化，還會使愈傷組織變紅，成為無分化能力的愈傷；愈傷組織分化的最佳培養基為MS+6-BAl. 5mg/L+IAA0. 3mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5. 6g/L，添加TDZ的分化率較高，但是不定芽極易產生玻璃化，添加IAA有助於不定芽的分化和生長；
不定芽繼代增殖的最佳培養基為MS+6-BAl. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5. 6g/L，黑莓不定芽的繼代増殖中只要添加一定濃度的6-BA即可達到較高的増殖係數，6-BA濃度高於I. 5mg/L時，所得不定芽雖然較多，但是芽體較小，當6-BA濃度高於2. Omg/L時，増殖係數開始下降，不定芽還出現不同程度的玻璃化；不定芽壯苗的最佳培養基為MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5. 6g/L，較低濃度的細胞分裂素和一定濃度的生長素進行搭配有利於不定芽的壯苗培養；不定芽生根的最佳培養基為1/2MS+NAA0. 05mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 6g/L，黑莓屬於較易生根的植物，其組培苗在低鹽的培養基中只要較低濃度的生長素即可快速生根，生根率達95%以上。(3)愈傷組織分化所得不定芽葉片的離體循環再生方法挑選(2)中由愈傷組織分化所得優質不定芽苗，把不定芽苗上大於O. 5cmX0. 5cm的葉片剪切下來，修剪成(O. 4
O.8) cmX (O. 4 O. 8) cm大小的葉塊，接種於(2)中步驟②的愈傷組織誘導培養基中，進入下ー輪的循環再生，後續步驟同(2)中所述；修剪過葉片的不定芽苗和不符合條件的不定芽苗，轉接於繼代增殖培養基中，繼續進行繼代増殖培養。(4)繼代増殖所得不定芽葉片的離體循環再生方法挑選(2)中繼代増殖所得優質不定芽苗，把不定芽苗上大於O. 5cmX0. 5cm的葉片剪切下來，修剪成(O. 4 O. 8)cmX (O. 4 O. 8) cm大小的葉塊，接種於(2)中步驟②的愈傷組織誘導培養基中，進入下一輪的循環再生，後續步驟同(2)中所述；修剪過葉片的不定芽苗和不符合條件的不定芽苗，轉接於壯苗培養基中，繼續進行組培苗的壯苗培養。(5)壯苗培養所得不定芽葉片的離體循環再生方法挑選(2)中壯苗培養所得優質不定芽苗，把不定芽苗上大於O. 5cmX0. 5cm的葉片剪切下來，修剪成(O. 4 O. 8)cmX (O. 4 O. 8) cm大小的葉塊，接種於(2)中步驟②的愈傷組織誘導培養基中，進入下一輪的循環再生，後續步驟同(2)中所述；修剪過葉片的不定芽苗和不符合條件的不定芽苗，轉接於生根培養基中，繼續進行組培苗的生根誘導。本發明的技術方案是瓶外獲取黑莓莖段，瓶內誘導產生不定芽，以繼代培養獲得不定芽的葉片為外植體，誘導形成愈傷組織，由愈傷組織誘導分化不定芽，對不定芽進行繼代増殖和壯苗培養，最後誘導生根，煉苗、移栽。由實施案例I可知，愈傷組織誘導率可以達到100%，愈傷組織的分化率可以達到64. 4%以上，分化得到的不定芽的増殖倍數可達5. 74，生根誘導的生根率最高可達100%，平均生根數3. 61，移栽成活率96. 9%。
植株再生體系是獲得轉基因純合體的關鍵環節，本發明提供了一種黑莓試管苗葉片離體循環再生的方法，成功解決了黑莓葉片愈傷分化及再生難的問題，為黑莓基因工程育種提供了技術支撐。本發明的獨特在於利用試管苗葉片建立了黑莓植株循環離體再生體系，具有節本、高效、循環再生的優點。


圖I本發明黑莓葉片循環再生技術路線圖2本發明中修剪好的黑莓組培苗葉片圖3本發明中組培苗葉片誘導的愈傷組織圖4本發明中愈傷組織分化不定芽圖5本發明中不定芽的繼代増殖 圖6本發明中生根組培苗圖7本發明中移栽成活的黑莓組培苗
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進ー步詳細說明，但實施例僅是示例性的，對本發明不構成任何限制。本領域的技術人員應該理解的是在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，而這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。以下實施例所採用的黑莓栽培品種為「Kiowa」，如無特殊要求，所用植物組織培養的培養基的配製方法均按常規植物組織培養培養基的配製方法配製。實施例一誘導大田植株莖段產生不定芽以「Kiowa」一年生枝條的半木質化莖段為外植體，用濃洗衣液浸泡衝洗後，於體積比70%的酒精中浸45s，用無菌水衝洗3 5次，再用O. I %升汞浸泡8min ;然後將外植體切成(I. O I. 5) cm長的帶芽莖段，接種於MS+6-BA0. 3mg/L+ZT0. 5mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂
5.6g/L，pH值6. O的培養基上，並在(25±3)°C，光照度25001x，光照時間12h/d的條件下培養，30d後不定芽的誘導率為85%以上，每莖段可產生2 4個不定芽。實施例ニ黑莓組培苗葉片離體再生為完整植株當組培苗長至3葉以上時，選擇最長邊X最寬邊為O. 5cmX0. 5cm以上的葉片，去掉邊緣，修剪成O. 5cmX0. 5cm左右大小的葉塊；將修剪好的葉片背面緊貼於MS+TDZO. 75mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂5. 6g/L，pH值6. 2的培養基上，先在(25 ±3) V的溫度條件下，暗培養14d，葉片邊緣開始捲曲膨大產生少量愈傷顆粒，然後轉到光照度15001x，光照時間12h/d的條件下，培養20d後形成淡黃色、緻密的愈傷組織，愈傷組織誘導率為100% ；將愈傷組織取下，切成(O. 3 O. 6) cmX (O. 3 O. 6) cm的塊狀，接種到MS+6-BA1. 0mg/L+IAA0. 2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 的培養基上，在(25±3)°C，20001x，光照時間12h/d的條件下培養，30d後不定芽的分化率為53. 3%，每塊愈傷分化的平均不定芽數為2. 4個；將不定芽轉接於MS+6-BA2. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5. 6g/L，pH值6. O的培養基上，在(25±3)°C，30001x，光照時間14h/d的條件下培養，30d後不定芽的增殖倍數達6. 44，但是有少量不定芽出現輕微玻璃化；將株高大於I. 5cm 的不定芽轉接於 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+ 鹿糖 25g/L+瓊脂5. 6g/L，pH值6. O的培養基上，在(25±3)°C，30001x，光照時間12h/d的條件下培養15d即可轉入生根培養基；將經過壯苗培養的組培苗轉接於1/2MS+NAA0. 05mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 6g/L，pH值6. O的培養基上，在(25 ±3) V，2000x,光照時間12h/d的條件下培養，20d後的生根率達93. 3 %，平均生根數為3. 18 ；
將黑莓生根苗，置於室內散射光處，煉苗5d，然後打開培養瓶蓋，使組培苗於室內空氣接觸，3d後挑選葉數為3 6個，生根數達3條以上，根系長達2. Ocm的生根苗，用水衝洗根部殘留的培養基，移栽入蛭石泥炭土 珍珠巖園土= 1:1:1:2的混合基質(經過高壓滅菌)中，移栽時應將組培苗的根系完全埋入基質中；澆足水後，保持溫度(20 25)で，溼度70%左右，放置於陰涼處，每周澆I次透水，40d後，黑莓組培苗的移栽成活率可達93. 8%以上。
權利要求
1.一種黑莓組培苗葉片高效循環再生的方法，其特徵在於包括以下步驟①大田黑莓莖段外植體的獲取、消毒，②莖段不定芽的誘導發生，③不定芽的繼代培養；④不定芽苗葉片的循環使用不定芽的生根誘導；⑥試管苗的煉苗、移栽。
2.權利要求I所述的步驟①，其特徵在於外植體莖段的獲取、消毒的方法以黑莓一年生枝條的半木質化莖段為外植體，用濃洗衣液浸泡衝洗後，在體積比為(70 75) %的酒精中浸(30 60) s,用無菌水衝洗3 5次,再用(O. I O. 2) %升萊浸泡(5 8)min。
3.權利要求I所述的步驟②，其特徵在於誘導莖段產生不定芽的方法將外植體切成(I. O I. 5) Cm長的帶芽莖段，接種於不定芽誘導培養基上，培養(20 40) d ;所述的誘導莖段形成不定芽的培養基為MS+6-BA(0 O. 5)mg/L+ZT (O. 5 I. 0)mg/L+蔗糖(25 30)g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2。
4.權利要求I所述的步驟③，其特徵在於不定芽的繼代培養的方法將步驟②誘導產生的不定芽接種在繼代増殖培養基上増殖，每隔(20 30)d繼代I次；所述的不定芽的繼代增殖培養基為MS+6-BA(0 O. 2)mg/L+TDZ(0 O. l)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+瓊脂5. 6g/L, pH 值 5. 8 6. 2。
5.權利要求I所述的步驟④，其特徵在於包括以下步驟(1)組培芽苗及其葉片的選擇選步驟③中繼代2次以上的組培芽苗作為循環使用的葉片離體再生材料，當組培芽苗長至3葉以上時，選擇最長邊X最寬邊為O. 5cmX O. 5cm以上的葉片，去掉邊緣，剪成(O. 4 O. 8) cm X (O. 4 O. 8) cm大小的葉塊；(2)誘導葉片形成愈傷組織將步驟(I)修剪好的葉片背面緊貼於培養基表面，先在溫度(25±3) °C的條件下暗培養(10 15) d，當葉片邊緣開始捲曲膨大產生少量愈傷顆粒時，轉到光照度(1000 2000) lx、光照時間(12 14)h/d的條件下，培養(15 20) d後形成淡黃色、緻密的愈傷組織；所述的誘導葉片形成愈傷的培養基為MS+TDZ(0. I I. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;(3)誘導愈傷組織分化不定芽將步驟(2)所得愈傷組織取下，切成(O.3 O. 6)cmX (O. 3 O. 6) cm的塊狀，接種到愈傷組織分化培養基上，在培養室溫度(25±3)で、光照度(1500 3000) lx、光照時間(12 14)h/d的條件下培養(25 35) d ;所述的愈傷組織分化的培養基為MS+6-BA (O. 5 2. 0)mg/L+TDZ (O I. 0)mg/L+IAA(0 O. 5)mg/L+ 蔗糖(25 30) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;(4)不定芽的繼代増殖將步驟(3)獲得的不定芽轉接於繼代增殖培養基中，在培養室溫度(25±3)で、光照度(1500 3000) lx、光照時間(12 14)h/d的條件下培養(20 30) d ;所述的不定芽繼代增殖培養基為MS+6-BA(0. 5 2. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+瓊脂 5. 68/し？!1值5.8 6.2;(5)不定芽的壯苗培養將步驟(4)中株高大於I.5cm的不定芽轉接於壯苗培養基中，在培養室溫度(25±3)で、光照度(1500 3000) lx、光照時間(12 14)h/d的條件下培養(15 20) d ;所述的不定芽壯苗的培養基為MS+6-BA (O. 3 O. 5)mg/L+NAA(0. 05 O. 2)mg/L+ 鹿糖(20 25) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L, pH 值 5. 8 6. 2。
6.權利要求I所述的步驟④中愈傷組織分化所得不定芽苗的葉片離體循環再生，其特徵在於選擇繼代2次以上的組培芽苗的葉片作為循環使用的離體再生材料。
7.權利要求I所述的步驟④中壯苗培養所得不定芽苗的葉片離體循環再生，其特徵在幹選擇壯苗培養所得優質不定芽苗的葉片作為循環使用的離體再生材料。
8.權利要求I所述的步驟⑤，其特徵在於不定芽的生根誘導將步驟④中獲得的組培芽苗轉接於生根培養基中，在培養室溫度(25±3)°C、光照度(1500 2000) lx、光照時間(12 14)h/d的條件下培養(15 20) d ;所述的生根培養基為1/2MS+NAA(0. 03 O. I)mg/L+ 鹿糖(20 25) g/L+ 瓊脂 5. 6g/L, pH 值 5. 8 6. 2。
9.權利要求I所述的步驟⑥，其特徵在於生根苗的煉苗將步驟⑤獲得的生根試管苗，置於室內散射光處煉苗(3 5) d，然後打開培養瓶蓋，使組培苗於室內空氣接觸，(3 5)d後即可移栽至穴盤；生根苗的移栽將煉苗後的試管苗從培養瓶中取出，挑選葉數為3 6個，生根數達3條以上，根系長達2. Ocm的生根苗，用水衝洗根部殘留的培養基，移栽入蛭石泥炭土 珍珠巖園土= I : I : I : 2的混合基質(經過高壓滅菌)中，移栽時應將組培苗的根系完全埋入基質中；澆足水後，保持溫度(20 25)で，溼度(70 80) %，放置於陰涼處，每周澆I次透水，(35 45) d後，黑莓組培苗的移栽成活率可達97%以上。
全文摘要
本發明涉及一種用黑莓組培苗葉片離體循環再生的方法。其特徵在於以黑莓試管苗的葉片為外植體，誘導形成愈傷組織，從愈傷組織誘導分化不定芽，對不定芽進行繼代增殖、壯苗培養和生根誘導，最後進行煉苗移栽。此解決方案愈傷組織誘導率達100％，分化率達64.4％以上，不定芽的增殖倍數可達5.74，生根率最高可達100％，平均生根數3.61，移栽成活率達96.9％。本發明利用取材方便和材料豐富的組培苗的葉片為外植體，建立黑莓葉片離體再生體系，同時利用不同階段形成的不定芽苗為母本，多方位獲取葉片，從而形成黑莓葉片多重循環離體再生體系，成功解決了黑莓組培苗葉片再生難的問題。
文檔編號A01H4/00GK102823505SQ20121036395
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者王小敏, 胡淑英, 吳文龍, 張春紅, 李維林 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所