O－羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法

2023-12-02 16:23:56

專利名稱：O－羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，屬於電化學分析檢測技術領域。
背景技術：
多巴胺(DA)又名3-羥酪胺，是哺乳動物和人類中樞神經系統一種非常重要的信息傳遞物質。腦內多巴胺神經功能失調是精神分裂症和帕金森病的重要原因。因此，對其測定方法的研究對探討其生理機制和相關疾病的診斷具有重要意義，DA的測定一直是電分析化學、生物和醫學領域的研究熱點。目前測定DA的方法主要有螢光法、化學發光法和毛細管電泳法。其電化學測定方法中，由於與DA共存於腦和體液中的抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)在固體電極上的氧化電位與DA的氧化電位接近，且AA和UA濃度高於DA，對DA含量的測定會產生嚴重幹擾，因此難以實現同時排除或者降低AA和UA對DA的測定的影響。
電化學修飾電極能有效地提高某些物質的響應電流並且催化其氧化還原反應，從而達到提高檢測靈敏度、減少幹擾的目的。

發明內容
本發明的目的就是要提供一種O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，製作一種新型的電化學傳感器，用於準確快速地測定血清中的DA，可以同時排除AA和UA的幹擾。
本發明的目的是這樣實現的，O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，其特徵是包括以下步驟(1)將玻碳電極表面用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，用HNO3、無水乙醇、水中超聲波清洗預處理；(2)將預處理好的玻碳電極在氧化液中浸泡40～80min，取出用二次蒸餾水清洗，再用2～4％的H2O2溶液浸泡20～40min取出在紅外燈下烘乾，烘乾後放在氯化亞碸中浸泡40～80min，再取出用甲酸洗淨，轉移到修飾液中浸泡20～60min後，用甲酸和二次水依次衝洗以洗掉粘附在表面的未化學鍵合的O-羧甲基殼聚糖；再用紅外燈烘乾後放入pH＝6.0的PBS緩衝溶液中在0～+0.6V的電位窗口中掃循環伏安至穩定，再用二次蒸餾水洗淨後用氮氣吹乾製得O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極。
所述的用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，是先用0.3μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，後用0.05μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光。所述的氧化液由0.3g NaNO3與4.5g KMnO4混合後溶於40mL濃H2SO4中製成；所述的PBS緩衝溶液濃度為0.025M。
本發明工藝先進，選材科學，製作方便。先將玻碳電極表面預處理後置於含一定濃度的O-羧甲基殼聚糖-甲酸溶液中浸泡修飾，然後依次用甲酸和二次蒸餾水衝洗，製得O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極，是一種新型的電化學傳感器。在一般生理pH條件下，DA為陽離子而AA和UA為陰離子，在電極表面修飾一層帶有負電荷的O-羧甲基殼聚糖膜，利用該膜表面羧酸根陰離子與AA和UA陰離子的靜電排斥作用可較好地消除AA和UA的幹擾。由於O-羧甲基殼聚糖分子中帶有豐富的顯負電荷的羧基，所以O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極既能較好地提高DA的檢測靈敏度，又能有效地同時排除AA和UA對測定的影響。該修飾電極可以實現準確快速地測定血清中的DA。O-羧甲基殼聚糖價廉易得、電極成本低，並且生物相容性好；該電極測定血清中的多巴胺(DA)靈敏度和準確度高，速度快，有很好的穩定性和重現性；電極修飾層牢固，使用壽命長，可達6個月以上。
試驗證明PBS緩衝溶液中，進行伏安測定，多巴胺在該修飾電極上出現一對可逆氧化還原峰，峰電流明顯增加，峰解析度和檢測限都大大高於裸電極，峰的可逆性也遠好於裸電極。雖然AA和UA在該電極上出峰都與多巴胺的相近，但該修飾膜能同時靜電排斥AA和UA，抑制它們出峰，因而可以很好地排除AA和UA對多巴胺的測定的影響。該電極用於血清中多巴胺的電化學快速測定，結果令人滿意。
該電極適用於實際樣品中多巴胺的常規測定，為臨床分析檢測和疾病診斷提供一條新途徑。因為O-羧甲基殼聚糖價廉易得，所以電極修飾材料成本低，並且其生物相容性好；適合於各種生物體液的分析。該電極製作簡單、實驗操作方便、快速；樣品使用量小，對被測人員影響小。


圖1是濃度為2.0×10-5M多巴胺在不同修飾電極上循環伏安圖，圖中(a)裸電極；(b)O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極，掃速0.10V·s-1，靈敏度1.0×10-5A·V-1，掃描範圍-0.2～+0.6V，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，底液0.025M的PBS緩衝液(25℃，pH 6.0)。
圖2是不同濃度的多巴胺在O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾玻碳電極上的示差脈衝伏安圖，圖中(a)0.06，(b)0.2，(c)0.65，(d)1.3，(e)2.5，(f)4.5，(g)5.5，(h)6.5μM，掃速0.10V·s-1，靈敏度1.0×10-5A·V-1，富集電位-0.2V，富集時間60s，靜置時間30s，底液0.025M的PBS緩衝液(25℃，pH 6.0)。插入圖是多巴胺在修飾電極上的示差脈衝伏安圖的氧化峰電流與濃度的線性關係圖。
圖3血清中不同濃度的多巴胺在O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾玻碳電極上的示差脈衝伏安圖，(a)0.2，(b)0.6，(c)1.0，(d)1.5，(e)3.0，(f)4.5，(g)8.5，(h)1.05，(i)1.25μM，富集電位-0.2V，富集時間60s，靜置時間30s，底液血清溶液。插入圖血清中多巴胺在修飾電極上的示差脈衝伏安圖的氧化峰電流與濃度的線性關係圖。
具體實施例方式
O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備將玻碳電極表面分別用0.3μm、0.05μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，分別用1∶1HNO3、無水乙醇、水中超聲波清洗5min。然後在室溫下將GC電極在氧化液(0.3g NaNO3與4.5g KMnO4混合後溶於40mL濃H2SO4中)中浸泡60min，取出用二次水清洗後，用3％的H2O2溶液浸泡30min，以還原過剩的KMnO4，再把電極在紅外燈下烘乾，然後在氯化亞碸中浸泡60min，取出電極後用甲酸洗淨，再轉移到修飾液中浸泡40min，最後再用甲酸和二次水依次衝洗以洗掉粘附在表面的未化學鍵合的O-羧甲基殼聚糖，紅外燈烘乾後放入pH＝6.0的PBS緩衝溶液(0.025M)中在0～+0.6V(vs.Ag/AgCl)的電位窗口中掃循環伏安至穩定。最後，電極經二次蒸餾水洗淨後用氮氣吹乾即得羧甲基殼聚糖修飾電極。修飾電極密封好後放入冰箱保存。
O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的特性將裸電極和O-羧甲基殼聚糖修飾電極分別與Ag/AgCl電極和鉑絲對電極組成三電極系統置於含一定濃度DA的10.0ml pH＝6.0的PBS(0.025M，25℃)底液中，電位從-0.2V掃描至+0.6V，採用循環伏安法記錄i-E曲線(圖1)。由圖可見，該修飾電極的靈敏度更高，使DA的氧化還原峰可逆性更好，ΔEp從110mV減小至52mV。
將O-羧甲基殼聚糖修飾玻碳電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲電極三電極系統置於裝有含一定濃度多巴胺的0.025M PBS緩衝溶液的反應池中，在-0.2V電位下磁力攪拌富集60s，然後靜置30s，從0V到0.6V(vs.Ag/AgCl)進行示差脈衝伏安法掃描。每次測定後，將修飾電極放入6M HNO3中在-0.1V～+0.6V(vs.Ag/AgCl)的電位窗口中掃循環伏安10圈從而更新電極表面。在根據氧化峰電流值採用標準加入法定量測定DA。峰電流響應靈敏並且不易受AA和UA的幹擾，可適用於快速準確測定血清樣品中的多巴胺。
圖2是不同濃度的多巴胺在O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極上的示差脈衝伏安圖和多巴胺的氧化峰電流與濃度的線性關係圖。由圖可見在6.0×10-8～7.0×10-6M的範圍內多巴胺的氧化峰電流與濃度是成線性關係的，線性方程為Ip(μA)＝0.9725+0.7496C(10-7M)，且檢測限是1.5×10-9M(信噪比≥3)，相關係數為r＝0.998。
血清中測定多巴胺的線性和檢測下限取50μl的健康人的血清用pH＝6.0的PBS緩衝溶液(0.025M)稀釋至10ml，放於電解池中，攪拌混合均勻，這樣可製得血清溶液。
在上述選定的最佳實驗條件下，進行示差脈衝伏安掃描(DPV)，DA的氧化峰電流與DA的濃度在2.0×10-7～1.4×10-5M範圍內呈良好的線性關係，線性方程為Ip(10-7A)＝0.2471+5.6054C(μM)，相關係數為r＝0.999(見圖3)。本方法的檢出下限為1.0×10-7M(信噪比S/N＝3)。從圖中也能看出，血清底液中的AA和UA在此修飾電極上不出峰，對血清樣品中DA的測定不幹擾。將上述的濃度都乘以200倍可以換算成血清中的濃度，可得檢測的線性範圍為4.0×10-5～2.8×10-3M，檢出下限為2.0×10-5M。由該表可見該法能同時減小AA和UA對DA測定的幹擾，可適用於簡單、快速、準確地檢測血清中的DA。
血清中多巴胺回收率的測定用本法在現配的血清溶液中用標準加入法依次測定五份不同濃度的DA樣液(見表1)，可得其回收率範圍為96.8～103.3％，相對標準偏差為2.1％。由此結果可看出本法在血清溶液中檢測DA具有較高的準確性和可靠性。
表1

權利要求
1.一種O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，其特徵是包括以下步驟(1)將玻碳電極表面用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，用HNO3、無水乙醇、水中超聲波清洗預處理；(2)將預處理好的玻碳電極在氧化液中浸泡40～80min，取出用二次蒸餾水清洗，再用2～4％的H2O2溶液浸泡20～40min取出在紅外燈下烘乾，烘乾後放在氯化亞碸中浸泡40～80min，再取出用甲酸洗淨，轉移到修飾液中浸泡20～60min後，用甲酸和二次水依次衝洗以洗掉粘附在表面的未化學鍵合的O-羧甲基殼聚糖；再用紅外燈烘乾後放入pH＝6.0的PBS緩衝溶液中在0～+0.6V的電位窗口中循環伏安掃描至圖形穩定，再用二次蒸餾水洗淨，用氮氣吹乾製得O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極。
2.根據權利要求1所述的O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，其特徵是所述的用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，是先用0.3μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，後用0.05μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光。
3.根據權利要求1所述的O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，其特徵是所述的氧化液由0.3g NaNO3與4.5g KMnO4混合後溶於40mL濃H2SO4中製成。
4.根據權利要求1所述的O-羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，其特徵是所述的PBS緩衝溶液濃度為0.025M。
全文摘要
本發明公開了一種O－羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極的製備方法，屬於電化學分析檢測技術領域。是先將玻碳電極進行處理後置於O－羧甲基殼聚糖—甲酸溶液中浸泡修飾，修飾好的玻碳電極取出後依次用甲酸和二次蒸餾水衝洗，製得O－羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極。O－羧甲基殼聚糖共價鍵合化學修飾電極既能較好地提高多巴胺(DA)的檢測靈敏度，又能有效地排除抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)對測定的影響。O－羧甲基殼聚糖價廉易得、電極成本低，並且生物相容性好；該電極測定血清中的DA靈敏度和準確度高，速度快，有很好的穩定性和重現性；電極修飾層牢固，使用壽命長。
文檔編號G01N27/30GK1865967SQ20061004001
公開日2006年11月22日 申請日期2006年4月29日 優先權日2006年4月29日
發明者王赬胤, 王志賢, 胡效亞 申請人:揚州大學