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製備抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法

2023-12-02 16:15:21 2

專利名稱:製備抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法
技術領域:
本發明涉及一種製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法。
背景技術:
肉毒毒素(Botulinum Toxin, BoNT)是目前已知毒力最強的蛋白,l.Og肉毒毒 素結晶物足以殺死100萬人,由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在厭氧環境中 產生的外毒素有7個血清型(A-G),其中,A、B型肉毒毒素是致人中毒的常見型,E、 F型偶爾引起食物中毒流行,C、 D型則僅引起動物、禽類中毒,G型引起中毒的報 道較少。臨床觀察表明,A型肉毒毒素相比其它型可引起更嚴重的中毒症狀,並導 致更高的死亡率。肉毒毒素中毒在人群中發病機率小,但其毒性大,致死率高,對 公共衛生安全危害極大,必須引起人們的高度重視。由於產生肉毒毒素的肉毒梭菌 在自然界廣泛存在,並且其芽孢對外界環境具有較強的抵抗力,肉毒毒素中毒仍然 是一個十分嚴重的公共衛生問題。近年,我國許多地區均發生數例肉毒中毒的疫情, 甚至有群體肉毒毒素中毒事件發生。尤其是A型肉毒毒素還被數十個國家(如前蘇 聯和伊拉克)用於製造生物武器,同時其也可被恐怖組織利用以製造生物恐怖。因 此,進行肉毒毒素的防治研究無論是對國家生物安全,公共衛生安全,還是 對人們群眾的生命健康安全都具有重要的實際意義。
對於肉毒毒素中毒的預防,現有的疫苗為類毒素(PBT)疫苗,存在工藝複雜、 副作用大、保護性不好、免疫周期長,未能獲得FDA批准。我國目前也尚無有效的 疫苗,因此肉毒毒素中毒治療藥物的研究就顯得尤為重要。中毒治療藥物的研究主 要集中在中和抗體和毒素拮抗劑,其中中和抗體是最有效的治療藥物。中和抗體可 分為多克隆抗毒素和單克隆抗體。目前國際上基因工程中和單抗的研究均處於實驗 室階段。因此,儘管多克隆抗毒素可能存在過敏、動物病毒汙染等問題,但仍是目 前肉毒毒素中毒治療藥物的最佳選擇。目前, 一些發達國家均有肉毒毒素抗毒素產 品上市。我國蘭州生物製品研究所研製的A、 B、 C、 D、 E、 F 6個血清型的單價抗 毒素也均已通過SFDA認證上市。然而世界各國肉毒毒素抗毒素的儲備嚴重不足, 為了應對在泰國爆發的肉毒毒素中毒事件,分別從四個國家(美國、英國、加拿大 和日本)緊急調集抗毒素才避免了中毒人員的死亡就說明了這個問題。
4國際上和國內肉毒毒素抗毒素(抗肉毒毒素免疫球蛋白抗體)均是採用類毒 素免疫動物而製備的。類毒素的一些表位,尤其對抗體識別與中和作用至關重要的 表位可能在毒素滅活過程中發生改變,無論是作為免疫原或是抗原,類毒素與毒素 之間都存在顯著差異。同時,類毒素本身還存在過多的非中和表位,導致免疫產生 的抗體雖然滴度可以很高,但有效成分中和抗體的比例較低,即比活性相對較低, 抗毒素的中和活性受到影響,而衡量抗毒素藥效的最重要指標為中和抗體的活性
(比活性)。因此, 一個理想的免疫原應該是保持其自身結構的最小的非毒性部分, 能產生完全的免疫保護,同時缺乏整個毒素的生物學特性。肉毒毒素保護性抗原為
重鏈受體結合區(Hc),它包含保護性抗原基本決定簇(PPADs),在動物體內能夠
誘發中和抗體,對於毒素的攻擊具有保護效果。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種製備A型肉毒毒素免疫原的方法。 本發明所提供的製備A型肉毒毒素免疫原的方法,包括如下步驟
1) 將序列表中序列l所示基因轉入宿主菌中,得到含有所述基因的重組菌;
2) 發酵步驟l)得到的重組菌,得到含有A型肉毒毒素免疫原的產物;
3) 將步驟2)得到的產物進行陽離子交換層析,得到一次純化產物;
4) 將步驟3)得到的一次純化產物進行陰離子交換層析,得到二次純化產物;
5) 將步驟4)得到的二次純化產物進行疏水層析,得到A型肉毒毒素免疫原。 其中,所述陽離子交換層析使用SP陽離子交換柱,所用的洗脫緩衝液為含300 mM
NaCl、 pH值為7.4的20 mM磷酸鈉溶液。
所述陰離子交換層析中使用Q陰離子交換層析柱;所述疏水層析使用辛基HIC
疏水層析柱,所用的洗脫緩衝液為含50 mM NaCl的20 mM磷酸鈉溶液。 所述基因是通過重組表達載體pTIG-Trx-AHc轉入所述宿主菌中的; 所述重組表達載體pTIG-Trx-AHc是通過將序列表中序列1所示基因插入原核
表達載體pTIG-Trx的£coW I和J力o I位點得到的;
所述原核表達載體pTIG-Trx是通過將序列表中序列2所示的硫氧還蛋白基因
插入載體pET-22b(+)的7W/e I和^co/ I位點得到的。
本發明的另一個目的是提供一種製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法。 本發明所提供的製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法,包括如下步驟
用上述方法製備得到的A型肉毒毒素免疫原免疫動物,製備得到抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體。
所述方法還包括如下步驟在所述免疫後,取動物免疫血清,用胃蛋白酶消化, 得到切除副作用片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體。
所述方法中,在所述取動物免疫血清後,所述用胃蛋白酶消化前,還包括滅活 所述血清的步驟。
所述方法中,在所述用胃蛋白酶消化後,還包括用硫酸銨沉澱所述切除副作用
片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的步驟。
所述方法中,在所述硫酸銨沉澱後,包括用DEAE陰離子交換劑進行純化的步驟。
所述動物具體可為馬。
本發明的製備A型肉毒毒素免疫原的方法製備得到的A型肉毒毒素免疫原不含 組氨酸標籤,純度高,可達95%,其免疫效果好,可以實際應用於人的免疫治療; 實驗證明,由該A型肉毒毒素免疫原免疫馬,可以製備得到高滴度免疫血清,免疫 6次後,其抗體滴度可達l: 745000,其中和抗體的滴度可達16000IU/ral;另外本 發明製備方法操作簡單、成本低廉。
本發明的製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法,去除了抗體中能引起副 作用的Fc片段,得到馬抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab' )2抗體。實驗證明,將 五免和六免得到的血清混合後,進一步純化得到的半成品中,F(ab' )2含量(純度) 可達80.2%,其中和抗體的滴度可達8000IU/ml,該抗體對A型肉毒毒素具有很好 的特異性及靈敏性,其純度和比活性高於傳統類毒素免疫馬匹製備的抗毒素,而且 穩定性好、安全。
基於以上,本發明的製備A型肉毒毒素免疫原的方法及製備抗A型肉毒毒素抗 體的方法在預防和治療A型肉毒毒素中毒領域會有廣闊的應用前景。


圖1為rAHc在大腸桿菌BL21 (DE3)表達及純化的SDS-PAGE檢測和Western
blot鑑定結果。
圖2為重組蛋白rAHc免疫馬後不同階段的IgG抗體滴度。
圖3為非還原蛋白電泳鑑定A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab' )2。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。具體如
6《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook, J. , Russell, David W. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)和《中華人民共和國藥典》(國家藥典委員會編,2005年三部,化學工 業出版社)中所述。
下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
所用引物由上海英俊生物技術有限公司合成。
實施例l、 A型肉毒毒素免疫原的製備
下述中,AHc表示基因,rAHc表示AHc基因編碼的蛋白。
一、重組原核表達載體pTIG-Trx-AHc的構建
硫氧還蛋白(Trx)是參與新生蛋白肽鏈摺疊的輔助蛋白,當重組蛋白rAHc與 之共表達時(一條mRNA、 二個閱讀框,結果表達先翻譯Trx,後翻譯目的蛋白rAHc, 並不融合,成為獨立蛋白),它可促進下遊正在摺疊的目的蛋白通過異構反應獲得 正確的摺疊,另外,也能夠增強胞內蛋白質的二硫鍵的形成,使表達產物不易形成 包涵體,能夠以可溶性形式表達,因此用下述方法構建含有Trx基因和AHc基因的原 核表達載體
1、重組載體pTIG-Trx的構建
首先,通過普通PCR方法克隆(以載體pET-32a(+)為模板)硫氧還蛋白基因序 列(來源於Novagen公司的pET-32a(+)載體中的Trx基因序列,位於該載體的自5' 端第366-692位鹼基處,其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: 2,編碼109個氨基 酸殘基),然後將獲得的Trx基因序列連接入質粒載體pET-22b (+) (Novagen公司) 的M/e I和AcoWI酶切位點之間,得到含有Trx基因的重組載體,命名為pTIG-Trx, 多克隆位點的結構如下
5' -A^el-Trx-GCGGGATCCGG[fAAGGAGGkATTCGA…-&cl-歷/ c/
RBS 腸y I
III—淑I—勘1—3,
2、原核表達載體pTIG-Trx-AHc的獲得
AHc基因序列如序列表中序列l所示,基因上遊帶有;5boy I識別位點、Trx基因 的終止密碼子TAA和AHc基因的起始密碼子ATG,基因下遊帶有終止密碼子TAA和化oI 識別位點,使後續菌表達產物不含有組氨酸標籤。將序列表中序列l所示AHc基因用fc^ I和J力o I雙酶切,再用fcoy I和/力o I雙 酶切載體pTIG-Trx,連接,將連接產物轉化大腸桿菌(Acoh') DH5a感受態細胞, 篩選陽性克隆,提質粒,測序,測序結果表明得到了基因序列及插入位置均正確的 AHc基因的重組原核表達載體,命名為pTIG-Trx-AHc。
二、 AHc在大腸桿菌中的表達及表達產物的純化與鑑定
1、 AHc在大腸桿菌中的表達及表達產物的SDS-PAGE檢測 將步驟一構建的AHc的原核表達載體pTIG-Trx-AHc轉化大腸桿菌BL21 (DE3)
感受態細胞(TIANGEN公司),篩選陽性重組子,以轉化有pTIG-Trx空載體的重組 菌為陰性對照,然後按1:100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨苄青黴素的 500mLLB液體培養基中,在37。C、 250rpm下進行大量培養,培養至對數生長期(0D, 約為0. 4-0. 6)時加入化學誘導劑IPTG(Promega公司)至終濃度為0. 2mmol/L,在 28-3(TC下繼續誘導培養4小時。
培養結束後,離心收集菌體,重懸於20 mM磷酸鈉緩衝液中(pH7.4),超聲 打碎細胞,離心收集上清進行12XSDS-PAGE檢測,結果顯示經誘導表達的重組蛋 白以可溶性方式表達,分子量約為50KD,與預期的分子量一致(圖1B,泳道5), 而未誘導的菌株和誘導的空載體對照未出現該目的蛋白帶,說明所表達的蛋白就是 目的蛋白rAHc;再經薄層掃描分析,表達產物約佔細菌可溶性總蛋白的25%,達 到一個較高水平。
2、 表達產物的純化
步驟1所表達的重組蛋白rAHc沒有標籤,其PI二9. 1,採用如下三步純化法分離 重組蛋白rAHc。第一步採用SP陽離子交換柱純化重組蛋白rAHc,獲得初步純化的 產物;第二步採用Q陰離子交換柱吸附SP產物中雜蛋白,收集過柱液獲得更高純 度重組蛋白rAHc;第三步採用苯基HIC疏水層析精製純化,經洗脫後收集重組蛋白 rAHc產物。
以上層析柱均購自法瑪西亞公司(Pharmacia Biotech, Sweden),並參照說明書對可 溶性表達產物進行純化。
第一步SP陽離子交換柱(SP-Sephadex ion exchange media)純化方法為先將 細菌上清與經平衡液(20 mM磷酸鈉緩衝液,pH7.4)平衡後的SP層析柱結合, 然後用含300mMNaCl的平衡液洗脫層析柱收集洗脫液,得到一次純化蛋白。第二步Q陰離子交換層析柱(QAE-Sephadex ion exchange media)純化方法為 首先用平衡液透析第一步產物,將透析後產物過經平衡液平衡後的Q層析柱,柱吸 附大量的雜蛋白,收集流出液,為二次純化蛋白。
第三步HIC疏水層析純化方法為使用辛基HIC疏水層析柱(介質為辛基瓊脂 糖凝膠(octyl s印harose) (Pharmacia Biotech, Sweden)),將第二步產物調鹽 濃度為2.6 M NaCl,過用含2. 6 M NaCl的20 mM磷酸鈉緩衝液平衡後的層析柱, 用含50 mM NaCl的20 mM磷酸鈉緩衝液洗脫層析柱,收集洗脫液,得到精製純化 目的蛋白。
對上述各步純化產物進行12%SDS-PAGE電泳檢測,檢測結果如圖l-A所示(泳 道M為低分子量蛋白Marker,分子量範圍25-116KD,泳道1為經第二步純化後產 物,泳道2為第三步純化後產物,泳道3為第一步純化後產物),結果表明經過三
步純化後獲得了高純度的目的蛋白。
收集產物經PBS透析後,12%SDS-PAGE電泳,結果如圖IB (泳道M為低分子 量蛋白Marker,分子量範圍25-116KD,泳道4為第三步純化後產物經PBS透析脫 鹽後的產物,泳道5為表達載體pTIG-Trx-AHc重組BL21 (DE3)誘導表達的細菌上 清),採用薄層掃描定量檢測蛋白質純度達95%以上。HLPC分析最後的產物純度 也大於95%,表明獲得了高純度的蛋白,可作為免疫原用於免疫馬或作為人用候選 疫苗。用BCA蛋白分析試劑盒(Sigma)測定蛋白含量,產量可達10mg/L,最終產物 保存於一70。C或一2(TC備用。
3、表達產物的鑑定
以馬源抗B0NT/A多抗(購自中國藥品生物製品檢定所)為一抗,以HRP標記 兔抗馬IgG (購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗,對空載體對照、誘導表達 的超聲上清及純化的重組蛋白進行Western blot分析,結果顯示誘導表達或經純 化的重組蛋白與馬源抗BoNT/A多抗均能特異性結合,條帶大小位置與電泳位置一 致,分子量約為50KD,而空載體對照無此條帶,見圖1-C (泳道6為空載體pTIG-Trx 轉入BL21 (DE3)細菌產生的上清,泳道7為第三步純化後產物經PBS透析脫鹽後的 產物,泳道8為表達載體pTIG-Trx-AHc轉入BL21(DE3)後誘導表達的細菌上清), 表明誘導表達或經純化的重組蛋白即為目的蛋白rAHc。
實施例2、重組rAHc免疫原免疫馬及馬免疫血清ELISA抗體和中和抗體水平檢將實施例l中重組蛋白rAHc在大腸桿菌中的表達與純化的方案進行放大規模,
大量純化獲得足量的重組抗原用作免疫原。
溶於PBS的重組蛋白rAHc與等體積的不完全弗氏佐劑(IFA, Sigma)乳化後免 疫馬,每匹馬5 ml,共5匹(經檢疫符合生物製品要求的馬匹),採用皮下和肌肉 多點免疫。第一和第二次重組蛋白劑量為3 rag,第三和四次重組蛋白劑量為5 rag, 第五和第六次重組蛋白劑量為8 mg,共6次免疫馬(先四次,後再加強二次),間 隔二周免疫一次。免疫前、二至六次免疫後2周分離馬血清,用ELISA法測定血清抗 體(用酶聯免疫板包被rAHc抗原,濃度為2Pg/mL,用分離的免疫馬血清為一抗,以 HRP標記兔抗馬IgG (購自Santa Cruz Biotechnology, Inc.)為二抗)。
按終末稀釋ELISA法測定免疫馬血清中的特異性抗體滴度。以空對照組馬血清 為陰性對照(即N),重組蛋白rAHc免疫組的OD艦值(即P)達到O. 5以上,並且P/N》2. 1 為陽性。每組的平均抗體滴度以每組單個血清樣品的抗體滴度的幾何平均數 (GMT士SD)表示。實驗設3次重複。ELISA檢測結果免疫馬匹產生了高滴度的特 異性抗體,免疫次數與抗體滴度成相關性,隨著免疫次數的增加,抗體滴度也得到 相應提高,免疫2次得到的馬血清平均抗體效價約為1: 51200,免疫3次得到的馬血 清平均抗體效價約為l: 145000,免疫4次得到的馬血清平均抗體效價為1 : 344000, 免疫5次得到的馬血清平均抗體效價約為1: 487000,免疫6次得到的馬血清平均抗 體效價為l: 745000。而空對照組血清與免疫前相比始終為陰性,低於200 (圖2)。 上述檢測結果表明重組蛋白rAHc免疫馬後可使其體內產生較高滴度的特異性抗體。
抗體體內中和活性及中和抗體效價
用經典的體內中和實驗測定了免疫馬血清抗體的體內中和活性及中和抗體效 價,方法為將免疫組混合血清抗體起始l: 10稀釋於磷酸鈉緩衝液(50mMNa2HP04) 中,然後以2倍梯度依次稀釋,與10LD5。A型肉毒毒素(BoNT/A, A62,國際標準株, 購自蘭州生物製品研究所)混合併室溫放置(一個LD5。定義為腹腔注射A型肉毒毒素 16-22 g小鼠死亡一半的毒素劑量),每個梯度組4隻鼠(16-22g),每隻注射500 pl上 述混合物,觀察一周,記錄統計存活率及時間。血清中中和抗體滴度以相對於標準 抗毒素(A型肉毒抗毒素標準品購自中國藥品生物製品檢定所)的,並且以每毫升 國際單位(IU/ml)報告。 一個IU定義為中和10, 000個LD5。 (i,p.)的A型肉毒毒素 的中和抗體(104 LD50 /ml=lIU/ml)。
10結果表明,隨著免疫次數的增加,中和抗體滴度也得到相應提高,重組蛋白
rAHc四次免疫後血清含有106 LD50 /ral或100IU/ml滴度的中和抗體,五次免疫後 血清含有1000IU/ml滴度的中和抗體,六次免疫後血清含有16000IU/ml滴度的中 和抗體,五和六次免疫後馬血清可用於製備抗毒素F(ab' )2。
實驗例3、製備馬抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab' )2抗體
1) 採集實施例2中五次和六次免疫馬抗A型肉毒毒素血漿,用SD (有機溶劑/ 去汙劑)滅活,SD滅活流程為加入Triton X—100和TNBP溶液至終濃度分別為 1%和0.3%, 4度6小時後,加入0.074%的硅藻土,攪拌10分鐘後壓濾,收集血漿。
2) 經SD滅活的血漿,l份血漿加2份注射水稀釋,加入胃蛋白酶,加甲苯至 終濃度為0.2%,用鹽酸調PH至3.2後3(TC消化75分鐘。IgG經胃蛋白酶切割Fc 段後為F(ab' )2。
3)胃酶消化後的血漿進行硫酸銨一次沉澱加15%固體硫酸銨,攪拌至完全溶 解,調pH5. 4,加溫至58°C,維持溫度30分鐘,降溫至45"C後,加入硅藻土至0. 8%, 攪拌均勻,壓濾。收集濾液(免疫球蛋白F(ab' )2抗體),棄沉澱。
4)硫酸銨二次沉澱上述濾液調pH7.2,加20%固體硫酸銨,攪拌至完全溶 解,靜置45分鐘,加入硅藻土至0.8%,攪拌均勻,壓濾,收集沉澱。
5) 明礬吸附、過濾收集的沉澱加2倍血漿量的注射水(水溫35。C以下)溶 解,加10%明礬液(明礬終濃度為0.8%),調pH7.8土0. 1,攪拌60分鐘,壓濾, 棄沉澱。
6) 超濾脫銨使用millipore超濾儀超濾,濾膜為50KD,加注射水超濾至硫 酸銨濃度至0.1%以下即可,獲得了純化的A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F( ab' ) 2 抗體。
7) DEAE精製純化F (ab' ) 2: DEAE為弱酸性陰離子交換劑(DEAE-Sephadex ion exchange media, Pharmacia Biotech, Sweden,購自法瑪西亞公司),經NaOH將CI—型 轉變為0H—型後,可吸附酸性蛋白。而上述純化的馬抗肉毒毒素免疫球蛋白F(ab' )2 抗體液中除F(ab' )2外其餘均屬酸性蛋白,當溶液的pH在6. 5時,酸性蛋白被 DEAE吸附,而有效成分F(ab' )2留在溶液中。因此經過超濾脫銨後的濾液,可通 過DEAE柱(購自法瑪西亞公司)層析再次純化。首先用NaOH預處理DEAE,加入濾液,除去了雜蛋白,收集原液,得到精製純化的馬抗肉毒毒素免疫球蛋白F(ab' )2抗體。
實驗例4、 抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的中和活性、穩定性檢定及安全 性評價
1) 原液半成品配製、除菌過濾向實施例3中製備得到的F(ab' )2抗體液中 加入NaCl (終濃度為O. 75 0.95%),加間甲酚(終濃度《0.25%),攪拌均勻, 調節pH至6. 0 7. 0。採用0. 22um除菌濾膜對原液除菌,獲得的原液為高純度的馬 抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab' )2抗體即A型肉毒抗毒素,置2-8t:冷庫保存。
2) A型肉毒抗毒素原液半成品的檢定按《中華人民共和國藥典》(國家藥典 委員會編,2005年三部,化學工業出版社)所述方法和要求對A型肉毒抗毒素原 液半成品進行一系列檢定,結果蛋白含量21.4g/L、 F(ab' )2含量(純度)80.2 %、 NaCl含量9.1 g/L;硫酸銨含量O. 19 g/L、 pH值6.34、間甲酚含量2.5%、 類A含量O. 12 ug/ml、白蛋白合格、無菌合格、熱源和異常毒性合格。
3) A型肉毒抗毒素原液半成品中和活性的檢定按實施例2中體內中和實驗方 法和《中華人民共和國藥典》(國家藥典委員會編,2005年三部,化學工業出版 社)所述方法測定了A型肉毒抗毒素原液半成品中和活性,與標準抗毒素(A型肉 毒抗毒素標準品來自中國藥品生物製品檢定所)對比。實驗設3次重複。結果表明 A型肉毒抗毒素原液半成品中和抗體效價為8000IU/ml。
4) A型肉毒抗毒素中和活性和F(ab' )2穩定性檢定
A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab' )2於4°。、 25°。和37。C觀察穩定性,實驗設 3次重複。實驗證實A型肉毒抗毒素放置6個月以上中和效價不減,有很好的穩定 性;並且非還原蛋白電泳(按《中華人民共和國藥典》(國家藥典委員會編,2005 年三部,化學工業出版社)所述方法)檢定表明A型肉毒抗毒素免疫球蛋白 F(ab' )2蛋白純度濃度不變、結構穩定(圖3)(泳道M為低分子量蛋白Marker, 分子量範圍18-116KD,泳道l為A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab' )2在4°(3放置6 個月的樣品,泳道2為A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab' )2在25'C (室溫)放置6 個月的樣品,泳道3為A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab' )2在37'C放置6個月的樣
5) A型肉毒抗毒素安全性評價急性毒性試驗進行了A型肉毒抗毒素單次靜脈注射給予小鼠的毒性試驗。本 試驗觀察A型肉毒抗毒素在較大容量和濃度下,單次靜脈注射給予小鼠所產生的急 性中毒反應和死亡情況。A型肉毒抗毒素單次靜脈注射給予小鼠,給藥容量為 20ml/kg,給藥劑量為428mg/kg,對照組靜脈注射等容量的生理鹽水。每組均10隻 小鼠,雌雄各半,藥後連續觀察14天,檢測指標包括臨床觀察、食量、體重和病理 檢査。結果顯示,給藥後4小時,除供試品組有一隻動物在給藥即刻出現明顯安靜 狀態, 一分鐘內恢復正常,其餘動物均未見明顯毒性反應;連續14天的觀察期間, 各組動物無死亡,未見其他異常表現;大體解剖觀察,未見異常。結論在本試 驗條件下,A型肉毒抗毒素單次靜脈注射給予小鼠的最大給藥量為428mg/kg。
安全藥理試驗進行了 A型肉毒抗毒素單次靜脈注射給予小鼠和狗的安全藥理 試驗。本試驗觀察了A型肉毒抗毒素對小鼠中樞神經系統,對狗呼吸和心血管系統 的影響。方法A型肉毒抗毒素單次靜脈注射給予小鼠,共三項試驗,每項試驗40 只小鼠,分別設A型肉毒抗毒素4、 20和60mg/kg三個劑量組和一個生理鹽水對照 組,每組5雄5雌。A型肉毒抗毒素單次靜脈注射給予狗的試驗,設2、 10、 30mg/kg 三個劑量組和一個生理鹽水對照組,每組3雄3雌。實驗設3次重複。結果給藥 後,小鼠一般行為表現、姿勢、步態等未見異常,各劑量組給藥小鼠的自主活動次 數、攀網能力及戊巴比妥鈉閾下催眠引起的翻正反射消失數、入睡時間和睡眠持續 時間與生理鹽水對照組比較均無顯著差異;狗單次靜脈注射A型肉毒抗毒素後,各 給藥劑量組動物的心電圖各參數值、呼吸頻率和呼吸幅度未見與給藥相關的毒理學 改變;各給藥劑量組動物血壓指標(收縮壓、舒張壓、平均動脈壓)與生理鹽水對 照組比較未見明顯差異。結論在本試驗條件下,單次靜脈注射A型肉毒抗毒素在 4、 20、 60mg/kg範圍內對小鼠中樞神經系統無明顯影響,與戊巴比妥鈉也無協同催 眠作用。單次靜脈注射A型肉毒抗毒素在2、 10、 30mg/kg範圍內對狗呼吸和心血 管系統無明顯影響。
溶血試驗進行了A型肉毒抗毒素溶血試驗。本試驗採用體外試管法觀察了A 型肉毒抗毒素對兔紅細胞溶血及凝集的影響。濃度為21. 4mg/ml A型肉毒抗毒素按 不同容量(0. 1 0. 5ml)加入已有不同容量(2. 0 2. 4ml)生理鹽水和2. 5ml的2% 紅細胞混懸液的玻璃試管中,同時以生理鹽水和注射用水分別作為陰性和陽性對照 品。實驗設3次重複。結果顯示該濃度的A型肉毒抗毒素無溶血作用,不引起紅 細胞凝聚。生理鹽水陰性對照品無溶血無凝聚,注射用水陽性對照品全部溶血。結論濃度為21.4mg/ml A型肉毒抗毒素體外對兔紅細胞無溶血作用,不引起紅細胞 凝聚。
以上的試驗結果為A型肉毒抗毒素臨床應用提供科學可靠的參考依據,表明A 型肉毒抗毒素是安全性的。序列表
中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
<120〉製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法
〈130〉CGGNARC92128
〈160> 2
<210〉 1
1315
〈212> DNA <213〉人工序列
<220〉 <223〉
〈400> 1
gccggaattc taatggaata catcsagaac atcatcaata cctccstcct gaacctgcgt 60
tacgaatcca atcacctgat cgacctgtct cgttacgctt ccaaaatcaa catcggttct 120
aaagttaact tcgatccast cgacaagast cagatccagc tgttcaatct ggsstcttcc 180
aaaatcgasg ttstcctgsa gaatgct3tc gtatacaact ctatgtacga aaacttctcc 240
acctccttct ggattcgtat cccsaaatac ttcaactcca tctctctgaa caatgsatac 300
accatcatca actgcatgga aaacaattct ggttggaaag tatctctgaa ctacggtgsa 360
atcatctgga ctctgcagga cactcaggaa atcaaacagc gtgttgtatt caaatactct 420
cagatgatca acatctctga ctacatcaat cgttggstct tcgttaccat caccsacsat 480
cgtctgaat3 sctccaaaat ctacatcasc ggccgtctga tcgaccagas accsstctcc 540
aatctgggts acstccscgc ttctaatsac atcatgttcs aactggacgg ttgccgtgsc 600
sctcaccgtt acatctggat caastacttc astctgttcg acaasgaact gsacga3aaa 660
gaaatcaaag atctgtacga caaccagtcc aattctggta tcctgaaaga cttctggggt 720
15gactacctgc sgtscgscas sccatsctac atgctgaatc gttgscgtca acaatgtagg tatccgtggt tscstgtacc gttatgacta ccaacatcta cctgaactct tccctgtacc aagaaatacg cgtctggtas caaggacaat atcgttcgta aatgttgtsg ttaagascsai dgs3ta_ccgt ctggctsccs gaaaaaatct tgtctgctct ggsaatcccs gacgttggta atgaaatccs agaacgacca gggtatcact aacaaatgca aatggtaacg atatcggttt catcggtttc caccagttca gcttccaact ggtacsatcg tcagatcgaa cgttcctctc gagttcatcc cagttgatga cggttggggt gaacgtccac
tgtacgatcc aaacaaatac 780
tgaaaggtcc acgtggttct 840
gtggtaccaa attcatcatc 900
acaatgatcg tgtatacatc 960
atgcttctca ggctggtgta 1020
atctgtctca ggtagttgta 1080
aaatgaatct gcaggacaac 1140
acaatatcgc taaactggtt 1200
gtactctggg ttgctcttgg 1260
tgtaactcga gctag 1315
〈210〉 2
〈211〉 327
人工序列
<220〉
〈400〉 2
agcgataaaa ttattcacct gactgacgac agttttgaca cggatgtact caaagcggac 60
ggggcgatcc tcgtcgattt ctgggcagag tggtgcggtc cgtgcaaaat gatcgccccg 120
attctggatg aaatcgctga cgaatatcag ggcaaactgg ccgttgcaaa actgaacatc 180
gatcaaaacc ctggcactgc gccgaaatat ggcatccgtg gtatcccgac tctgctgctg 240
ttcaaaaacg gtgaagtggc ggcaaccaaa gtgggtgcac tgtctaaagg tcagttgaaa 300 gagttcctcg acgctaatct ggcggga 327
1權利要求
1、一種製備A型肉毒毒素免疫原的方法,包括如下步驟1)將序列表中序列1所示基因轉入宿主菌中,得到含有所述基因的重組菌;2)發酵步驟1)得到的重組菌,得到含有A型肉毒毒素免疫原的產物;3)將步驟2)得到的產物進行陽離子交換層析,得到一次純化產物;4)將步驟3)得到的一次純化產物進行陰離子交換層析,得到二次純化產物;5)將步驟4)得到的二次純化產物進行疏水層析,得到A型肉毒毒素免疫原。
2、 根據權利要求l所述的方法,其特徵在於所述陽離子交換層析使用SP陽離子交換柱,所用的洗脫緩衝液為含300 mM NaCl、 pH值為7. 4的20 mM磷酸鈉溶液。
3、 根據權利要求1或2所述的方法,其特徵在於所述陰離子交換層析中使 用Q陰離子交換層析柱;所述疏水層析使用辛基HIC疏水層析柱,所用的洗脫緩衝 液為含50 mM NaCl的20 mM磷酸鈉溶液。
4、 根據權利要求1-3中任一所述的方法,其特徵在於所述基因是通過重組 表達載體pTIG-Trx-AHc轉入所述宿主菌中的;所述重組表達載體pTIG-Trx-AHc是通過將序列表中序列1所示基因插入原核 表達載體pTIG-Trx的多克隆位點得到的;所述原核表達載體pTIG-Trx是通過將序列表中序列2所示的硫氧還蛋白基因 插入載體pET-22b(+)的多克隆位點得到的。
5、 一種製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法,包括如下步驟用權利 要求1-4中任一方法製備得到的A型肉毒毒素免疫原免疫動物,製備得到抗A型肉 毒毒素免疫球蛋白抗體。
6、 根據權利要求5所述的方法,其特徵在於所述方法還包括如下步驟在 所述免疫後,取動物免疫血清,用胃蛋白酶消化,得到切除副作用片段的抗A型肉 毒毒素免疫球蛋白抗體。
7、 根據權利要求6所述的方法,其特徵在於所述方法中,在所述取動物免 疫血清後,所述用胃蛋白酶消化前,還包括滅活所述血清的步驟。
8、 根據權利要求7所述的方法,其特徵在於所述方法中,在所述用胃蛋白 酶消化後,還包括用硫酸銨沉澱所述切除副作用片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白 抗體的步驟。
9、 根據權利要求8所述的方法,其特徵在於所述方法中,在所述硫酸銨沉澱後,包括用DEAE陰離子交換劑進行純化的步驟。
10、 根據權利要求5-9中任一所述的方法,其特徵在於所述動物為馬。
全文摘要
本發明公開了一種製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法。該方法包括如下步驟以A型肉毒毒素重組蛋白rAHc為免疫原,免疫動物,製備得到抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體。本發明的製備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法,去除了抗體中能引起副作用的Fc片段,得到馬抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)2抗體,將五免和六免得到的血清混合後,進一步純化得到的半成品中,F(ab′)2含量(純度)可達80.2%,其中和抗體的滴度可達8000IU/ml,該抗體對A型肉毒毒素具有很好的特異性及靈敏性,其純度和比活性高於傳統類毒素免疫馬匹製備的抗毒素,而且穩定性好、安全。
文檔編號C12P21/02GK101497909SQ200910079258
公開日2009年8月5日 申請日期2009年3月5日 優先權日2009年3月5日
發明者餘雲舟, 俞煒源, 孫志偉, 韞 杜, 林建波 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所

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