一種利用組合調控策略提高5-氨基乙醯丙酸產量的方法

2023-12-06 10:12:56 2

一種利用組合調控策略提高5-氨基乙醯丙酸產量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用組合調控策略提高5-氨基乙醯丙酸產量的方法，屬於代謝工程和微生物發酵領域。本發明以EscherichiacoliBL21(DE3)作為出發菌株，使用表達載體pETDuet-1及pRSFDuet-1對ALA合成途徑中起正調控作用的關鍵酶基因hemL，hemA，hemD，及hemF進行組合優化，構建重組菌株。通過發酵驗證，採用高拷貝的質粒pRSFDuet-1表達hemA，hemL和hemF，中拷貝質粒pETDuet-1表達hemD，ALA產量產量最高，約3250mg/L。
【專利說明】一種利用組合調控策略提高5-氨基乙醯丙酸產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用組合調控策略提高5-氨基乙醯丙酸產量的方法，屬於代謝工程和微生物發酵領域。
【背景技術】
[0002]5_ 氨基乙醯丙酸(5-aminolevulinicacid, ALA),分子式為 C5O3NH9,分子量為131.13,熔點為149-151°C,它是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B12等的關鍵前體物質。ALA作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學藥物在醫學領域逐漸受到重視，已經成功應用於皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷和光動力治療中。另外，ALA作為一種環境相容性及選擇性很高的新型光活化農藥，在農藥領域應用非常廣泛，如作為一種無公害的綠色農藥、除草劑以及植物生長調節劑等。
[0003]目前，ALA合成主要採用化學法合成，最早出現在上世紀50年代，直到20世紀90年代，相關研究才大量開展，並取得了一定的成績。但是由於化學合成反應步驟繁瑣，副產物多，分離提純困難，ALA的得率也較低，並且環境汙染嚴重等問題，近年來，微生物發酵生產ALA已成為研究的熱點。自然界中，ALA的生物合成存在兩條途徑，一條是C4途徑，由5-氨基乙醯丙酸合成酶(ALAS，hemA編碼)催化琥珀醯-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反應組成，主要存在於一些光合細菌、真菌以及動物體內。另外一條是C5途徑，首先穀氨酸在穀氨醯-tRNA合成酶(GluRS，gltX編碼)催化下，生成穀氨醯_tRNA，然後，穀氨醯-tRNA在穀氨酸-tRNA還原酶(GluTR, hemA編碼)作用下生成穀氨酸-1-半醒(GSA),最後GSA由穀氨酸-1-半醛_2，1-氨基轉移酶(GSA-AM，hemL編碼)催化生成ALA。該途徑廣泛存在於植物、藻類以及細菌(如 大腸桿菌)中。
[0004]早期，人們篩選到產ALA的光合細菌類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides),通過誘變育種法對其進行誘變，篩選ALA的高產菌株，並通過發酵優化等使得ALA的產量達到
7.2g/L。但由於光合細菌的特殊性，其成本較高，不適合大規模的工業化生產。目前以C4途徑為基礎的生物轉化由於添加前體琥珀酸和甘氨酸生產ALA成本相對較高。
[0005]本發明在系統闡述分析大腸桿菌中C5途徑(圖1)調控機制的基礎上，將5-氨基乙醯丙酸C5合成途徑關鍵酶基因hemA和hemL以及血紅素生物合成途徑基因hemD及hemF利用不同拷貝數的質粒進行組合優化，實現了 ALA產量的進一步提高。

【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種高產5-氨基乙醯丙酸的大腸桿菌工程菌株，是以高拷貝質粒串聯表達ALAC5途徑關鍵基因hemA(編碼穀氨醯-tRNA還原酶)、hemL (編碼穀氨醛氨基轉移酶)，並以中拷貝質粒串聯表達hemD (編碼尿卟啉原III合酶)、hemF(編碼糞卟啉原III氧化酶)；或者以高拷貝質粒串聯表達hemA、hemL、hemD，並以中拷貝質粒表達hemF ;或者以高拷貝質粒串聯表達hemA、hemL、hemF，並以中拷貝質粒表達hemD ο[0007]所述大腸桿菌是JM109、DH5 a、W3110 或 BL21 (DE3)。
[0008]所述hemL的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
[0009]所述hemA的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0010]所述hemD的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
[0011]所述hemF的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。
[0012]所述高拷貝質粒是指拷貝數為100的質粒。所述中拷貝質粒是指拷貝數為40的質粒。
[0013]所述高拷貝數質粒優選pRSFDuet-1。
[0014]所述中拷貝數質粒優選pETDuet-1。
[0015]所述大腸桿菌工程菌株優選以pRSFDuet-1串聯表達hemA、hemL、hemF,並以pETDuet-1 表達 hemD ο
[0016]所述大腸桿菌工程菌株還優選以pRSFDuet-Ι串聯表達hemA、hemL、hemD,並以pETDuet-1 表達 hemF。
[0017]所述大腸桿菌工程菌株還優選以pRSFDuet-Ι串聯表達hemA、hemL,並以pETDuet-Ι 串聯表達 he mD、hemF。
[0018]本發明還提供一種構建所述大腸桿菌工程菌的方法，是以高拷貝質粒串聯表達ALAC5途徑關鍵基因hemA、hemL，並以中拷貝質粒串聯表達以高hemD、hemF ;或者以高拷貝質粒串聯表達hemA、hemL、hemD,並以中拷貝質粒表達hemF ;或者以高拷貝質粒串聯表達hemA、hemL、hemF,並以中拷貝質粒表達hemD。
[0019]所述方法優選將來源於傷寒沙門氏菌的hemA基因與大腸桿菌的hemL基因連接表達載體pRSFDuet-Ι,獲得hemA與hemL基因的共表達載體pRSFDuet-1-hemLA ;將來源於大腸桿菌的hemD和hemF基因連接表達載體pETDuet-Ι,獲得質粒pETDuet-1-hemD-hemF。將上述質粒轉化大腸桿菌，篩選得到陽性轉化子。
[0020]所述方法還優選將來源於傷寒沙門氏菌的hemA、大腸桿菌的hemL、hemD連接載體pRSFDuet-Ι 獲得 pRSFDuet-1-hemLA-hemD,將 hemF 連接載體 pETDuet-Ι。將上述質粒轉化大腸桿菌，篩選得到陽性轉化子。
[0021]所述方法還優選將來源於傷寒沙門氏菌的hemA、大腸桿菌的hemL、hemF連接載體pRSFDuet-Ι 獲得 pRSFDuet-1-hemLA-hemF,將 hemD 連接載體 pETDuet-Ι。將上述質粒轉化大腸桿菌，篩選得到陽性轉化子。
[0022]本發明要解決的第三個技術問題是應用所述大腸桿菌工程菌發酵生產ALA。
[0023]所述大腸桿菌工程菌優選E.coliBL21 (DE3)pRSFDuet-1-hemLApETDuet-1-hemD-hemF或E.coliBL21 (DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemDpETDuet-1-hemF或E.coliBL21 (DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemDo
[0024]所述發酵生產ALA涉及的培養基優選:
[0025]斜面培養基(g/L):蛋白腖10，氯化鈉10，酵母粉5.0，瓊脂20，ρΗ7.0 ；
[0026]種子培養基(g/L):蛋白腖10，氯化鈉10，酵母粉5.0，ρΗ7.0，裝液量20mL/250mL ；
[0027]發酵培養基(g/L): (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045.0, Na2HPO4.12H2015, MgSO4.7Η201.0，酵母提取物(Yeastextract) 1.0,葡萄糖 20, ρΗ7.0。
[0028]所述發酵生產ALA涉及的培養條件優選:[0029]菌種培養:甘油管劃線，然後挑取單菌落劃線平板37°C培養，作為種子來源；
[0030]種子培養:平板挑取菌體，37°C，200r/min，根據要求添加氨苄青黴素100 μ g/mL，卡那黴素50 μ g/mL，培養約12h，轉接發酵培養基；
[0031]發酵培養:以2%接種量轉接，Oh時添加0.1-0.5mMIPTG誘導基因表達，根據需要添加苄青黴素(100 μ g/mL)以及卡那黴素(50μ g/mL)，30-37°C，200r/min培養，周期28-36h。
[0032]本發明在表達C5途徑關鍵基因hemL和hemA的基礎上，共表達ALA代謝途徑的下遊基因hemD和hemF，取得了意料不到的技術效果。此外，本發明還通過對目的基因以及具有不同拷貝數的表達載體進行組合，對ALA代謝途徑進行了更細微的調控，所得大腸桿菌工程菌株3L發酵罐能夠積累5-氨基乙醯丙酸3250mg/L，有效地利用C5途徑促進5-氨基乙醯丙酸的合成，從而實現微生物發酵法直接發酵葡萄糖合成5-氨基乙醯丙酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1:大腸桿菌中ALAC5合成途徑。
[0034]圖2:重組質粒構建酶切電泳圖
[0035]Ml:DL5000Marker
[0036]M2:DL10000Marker
[0037]A:pETDuet-1-hem LA
[0038]B:pETDuet-l_hemD
[0039]C:pETDuet-l_hemF
[0040]D: pRSFDue t_ 1-hemD
[0041]E:pETDuet-1-hemLA-hemD
[0042]F:pETDuet-1-hemLA-hemF
[0043]G:pETDuet-1-hemD_hemF
[0044]H:pRSFDuet-1-hemLA-hemD
[0045]1:pRSFDuet-l_hemF
[0046]J:pRSFDuet-1-hemD-hemF
[0047]K:pRSFDuet-1-hemLA
[0048]L:pRSFDuet-1-hemLA-hemF
[0049]圖3:重組菌搖瓶發酵ALA產量
[0050]LADF-1:Ε.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLApRSFDuet-1-hemD-hemF
[0051]LADF-2:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemDpRSFDuet-1-hemF
[0052]LADF-3:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemFpRSFDuet-1-hemD
[0053]LADF-4:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLApETDuet-1-hemD-hemF
[0054]LADF-5:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemDpETDuet-1-hemF
[0055]LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD
[0056]圖4:重組菌LADF-6發酵過程曲線圖
[0057]LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD【具體實施方式】
[0058]ALA分析方法:
[0059]採用Mauzerall和Granick的分光光度法:將樣品稀釋至2mL,加入ImL的乙酸鹽緩衝液，0.5mL的乙醯丙酮，然後煮沸15min。冷卻至室溫，取2mL的反應液至新管中，然後加入2mL的改良Ehrlich』 s試劑,反應20min,利用分光光度計554nm下檢測。
[0060]培養基:
[0061]斜面培養基(g/L):蛋白腖10，氯化鈉10，酵母粉5.0，瓊脂20，pH7.0 ；
[0062]種子培養基(g/L):蛋白腖10，氯化鈉10，酵母粉5.0，ρΗ7.0，裝液量20mL/250mL ；
[0063]發酵培養基(g/L): (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045.0, Na2HPO4.12H2015, MgSO4.7Η201.0,yeastextractl.0，Glucose20，ρΗ7.0。
[0064]培養條件:
[0065]菌種培養:甘油管劃線，然後挑取單菌落劃線平板37°C培養，作為種子來源；
[0066]種子培養:平板挑取菌體，37°C，200r/min，根據要求添加氨苄青黴素100 μ g/mL，卡那黴素50 μ g/mL,培養約12h，轉接發酵培養基；
[0067]發酵培養:以2%接種量轉接，Oh時添加0.1-0.5mMIPTG誘導基因表達，根據需要添加苄青黴素(100 μ g/mL)以及卡那黴素(50μ g/mL)，30-37°C，200r/min培養，周期28-36h。
[0068]實施例1重組質粒的構建及鑑定
[0069](I)重組質粒的構建
[0070]以大腸桿菌基因組為模板獲取hemL,hemD,以及hemF,hemA來源於傷寒沙門氏菌，
[0071]引物如下(下劃線部分為酶切位點)
[0072]hemL-hemAF:CGCGGATCCATAAAAGGAGGAAAATATATGAGTAAGTCTGAA
[0073]hemL-hemAR:TGCACTGCAGCTACTCCAGCCCGAGGCTG
[0074]hemD-F:CGCCATATGAGTATCCTTGTCACCCGCC
[0075]hemD-R:CCGCTCGAGTTATTGTAATGCCCGTAAAAGCG
[0076]hemF-F:CGCCATATGAAACCCGACGCACACC
[0077]hemF-R:CCGCTCGAGTTACACCCAATCCCTGACCTTAAT
[0078]hemD(2)-F:CGCGGATCCATAAAAGGAGGAAAATATATGAGTATCCTTGTCACCCG
[0079]hemD(2)-R:TGCACTGCAGTTATTGTAATGCCCGTAAAAGCG
[0080]反應條件為:94°C5min ；94°C 30s,58°C 30s, 72°C 150s (hemL-hemA) /60s (hemD 和hemF) (30個循環)；72°C IOmin進行PCR反應，並以0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證並回收PCR擴增產物，用限制性內切酶雙酶切並純化後，用T4DNA連接酶與相應的表達載體於16°C過夜連接，連接產物轉化E.coliJM109,挑選陽性克隆子提取質粒並送上海生工測序驗證，質粒構建酶切電泳圖如圖2。
[0081]將所得來源於傷寒沙門氏菌的hemA基因與大腸桿菌的hemL通過擴增利用酶切位點BamHI和PstI分別連接表達載體pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι中，獲得hemA與hemL基因的共表達載體 pETDuet-1-hemLA 和 pRSFDuet-1-hemLA。
[0082]將所得來源於大腸桿菌的hemD和hemF基因分別通過擴增和利用酶切位點NdeI和XhoI分別連接表達載體pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι中，獲得質粒pETDuet-1-hemD和pRSFDuet-1-hemD 以及 pETDuet-1-hemF 和 pRSFDuet-1-hemF。
[0083]將所得來源於大腸桿菌的hemD基因通過擴增利用酶切位點BamHI和PstI連接載體 pETDuet-1-hemF 和 pRSFDuet-1-hemF 中，獲得表達載體 pETDuet-1-hemD-hemF 和pRSFDuet-1-hemD-hemF。
[0084]將所得來源於傷寒沙門氏菌的hemA基因與hemL通過擴增利用酶切位點BamHI和 PstI 分別連接載體 pETDuet-1-hemD 和 pRSFDuet-1-hemD 以及 pETDuet-1-hemF 和pRSFDuet-1-hemF，獲得表達載體 pETDuet-1-hemLA-hemD 和 pRSFDuet-1-hemLA-hemD 以及pETDuet-1-hemLA-hemF 和 pRSFDuet-1-hemLA-hemF。
[0085](2) ALA發酵重組菌株的構建
[0086]基本方法是將構建的重組質粒pETDuet-1-hemLA和pRSFDuet-1-hemD-hemF共轉化 E.coliBL21 (DE3)，獲得重組菌 E.coliLADF-lo
[0087]將構建的重組質粒pETDuet-1-hemLA-hemD 和 pRSFDuet-1-hemF 共轉化E.coliBL21 (DE3)，獲得重組菌 E.coliLADF-2。
[0088]將構建的重組質粒pETDuet-1-hemLA-hemF 和 pRSFDuet-1-hemD 共轉化E.coliBL21 (DE3)，獲得重組菌 E.coliLADF-3。
[0089]將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemLA 和 pETDuet-1-hemD-hemF 共轉化E.coliBL21 (DE3)，獲得重組菌 E.coliLADF-4。
[0090]將構建的重組質粒 pRSFDuet-1-hemLA-hemD 和 pETDuet-1-hemF 共轉化E.coliBL21 (DE3)，獲得重組菌 E.coliLADF-5。
[0091]將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemLA-hemF 和 pETDuet-1-hemD 共轉化E.coliBL21(DE3)，獲得重組菌 E.coliLADF-6。
[0092]實施例2重組菌發酵驗證
[0093]菌株:
[0094]LADF-1:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLApRSFDuet-1-hemD-hemF
[0095]LADF-2:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemDpRSFDuet-1-hemF
[0096]LADF-3:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemFpRSFDuet-1-hemD
[0097]LADF-4:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLApETDuet-1-hemD-hemF
[0098]LADF-5:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemDpETDuet-1-hemF
[0099]LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD
[0100]不同重組大腸桿菌進行發酵實驗對比。重組菌LADF-1，LADF-2，LADF-3，LADF-4，LADF-5以及LADF-6進行發酵實驗，測定ALA產量如圖3所示:通過釆用不同拷貝數的載體表達hemL和hemA以及hemD和hemF，可以看出通過釆用高拷貝的質粒表達hemL，hemA和hemF，中拷貝的質粒表達hemD，ALA的產量最高，為2100mg/L(圖3)。
[0101 ] 實施例3重組菌LADF-63L發酵罐發酵驗證
[0102]菌株:LADF_6:E.coliBL21 (DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD。
[0103]重組大腸桿菌LADF-6在3L發酵罐中發酵生產，接種量2%，初始葡萄糖濃度為33g/L，Oh添加0.1-0.5mMIPTG誘導以及相應的抗生素，隨著時間的變化，IOh後ALA開始大量積累，在30hALA產量最高，為3250mg/L (圖4)。
[0104]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種高產5-氨基乙醯丙酸的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，是以高拷貝質粒串聯表達ALAC5途徑關鍵基因hemA、hemL，並以中拷貝質粒串聯表達hemD、hemF ;或者以高拷貝質粒串聯表達hemA、hemL、hemD,並以中拷貝質粒表達hemF ;或者以高拷貝質粒串聯表達hemA、hemL、hemF,並以中拷貝質粒表達hemD。
2.根據權利要求1所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，所述hemL的核苷酸序列如SEQIDNO. I所示，所述hemA的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3.根據權利要求1所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，所述hemD的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示，所述hemF的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
4.根據權利要求1-3任一所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，所述大腸桿菌是JM109、DH5a、W3110 或 BL21 (DE3)。
5.根據權利要求1所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，所述高拷貝質粒是指拷貝數為100的質粒，所述中拷貝質粒是指拷貝數為40的質粒。
6.根據權利要求1或5所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，所述高拷貝質粒是pRSFDuet-1,所述中拷貝質粒是pETDuet-1。
7.根據權利要求1-3任一所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，以pRSFDuet-Ι串聯表達 hemA、hemL,並以 pETDuet-Ι 串聯表達 hemD 和 hemF。
8.根據權利要求1-3任一所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，以pRSFDuet-Ι串聯表達 hemA、hemL、hemD,並以 pETDuet-Ι 表達 hemF。
9.根據權利要求1-3任一所述的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於，以pRSFDuet-Ι串聯表達 hemA、hemL、hemF,並以 pETDuet-1 表達 hemD。
10.一種應用權利要求1所述工程菌株發酵法生產5-氨基乙醯丙酸的方法，其特徵在於，工程菌株活化後，轉接發酵培養基，30-37°C，200r/min培養，發酵周期28_36h。
【文檔編號】C12P13/00GK104017767SQ201410274656
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】陳堅, 堵國成, 康振, 張俊麗 申請人:江南大學