木黴sc9及利用木黴sc9製備耐冷木聚糖酶的方法

2023-11-01 13:52:42 1

專利名稱：：木黴sc9及利用木黴sc9製備耐冷木聚糖酶的方法
技術領域：
：本發明涉及一種木黴及利用這種木黴製備耐冷木聚糖酶的方法。
背景技術：
：木聚糖酶(EC.3.2丄8)能夠以內切方式作用於木聚糖主鏈的^4，4-木糖苷鍵產生不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶，可廣泛應用於生物轉化、食品、飼料、醫藥、能源、造紙、紡織等行業。近幾十年來，木聚糖酶的應用潛力一直為眾多的研究者所關注。國內外對木聚糖酶的研究已比較深入，從菌種篩選、誘導產酶、酶的分離純化、酶學特性以及木聚糖酶基因的克隆與表達等方面都有大量報導。這些報導中，關於中溫和高溫微生物產木聚糖酶的比較多，但是關於低溫微生物產木聚糖酶的研究還很少。在低溫條件下具有生長適應能力的微生物都可以稱為低溫微生物，廣泛分布於寒冷環境中，包括高山地區、深海海區、南北兩極、冰川、淡水湖泊以及冷凍食物。Morita把低溫微生物化分為兩類嗜冷菌(Psychrophiles)和耐冷菌(Psychrotrophs)。能在低溫條件下生長，在05。C可生長繁殖，但最適生長溫度>20r的微生物，稱為耐冷菌。低溫微生物的研究在近年得到較大發展，其所產生的低溫酶(Cold-adaptedenzymes)備受關注。低溫酶的i^值較低，對底物的親合力較強，提高了對底物的利用效率。這類酶催化反應最適溫度較低，可以節約能源，適合低溫長時的工藝過程，另外低溫下的酶反應也可提高一些產品的質量。低溫環境下的纖維質材料特別是半纖維的生物降解，主要是由微生物產生的耐冷木聚糖酶引起。現有已報導的可用於製備耐冷木聚糖酶的主要微生物有青黴、產黃細菌和酵母菌。Inglis等(InglisGD，PoppAP,SelengerLB.Productionofcellulasesandxylanasesbylow-temperaturebasidiomycetes.JMZcra^V/,2000,46(9):860~865)和Petrescu等(PetrescuI,LamotteBJ，ChessaJP.XylanasefromthepsychrophilicyeastQyj!7tococciwformulaseeoriginaldocumentpage5曾分別報導了酵母和擔子菌的低溫木聚糖酶，在5'C仍具有顯著酶活。劉世利等(劉世利，汪天虹，秦楠.Isolationandmutagenesisofcold-adaptivexylanase-producing戶formulaseeoriginaldocumentpage5(菌物系統)，2003，22(2):272276)報導從深海汙泥樣品中分離到產低溫木聚糖酶的青黴，其最適生長溫度為18°C。Hou等(HouYH,WangTH,LongH.Novelcold-adaptivePem'c/〃z'調strainFS010secretingthermo-labilexylanaseisolatedfromYellowSea.Jcto說formulaseeoriginaldocumentpage5從黃海中篩選出了產木聚糖酶的低溫真菌，該菌屬於產黃青黴(formulaseeoriginaldocumentpage5入利用這些微生物製備耐冷木聚糖酶的缺點是產率較低或者是所得到的耐冷木聚糖酶的酸鹼適應性較差，所得到的耐冷木聚糖酶在20。C以下，特別是0-10。C時的酶活非常低。另外，目前報導的還有一些產耐冷木聚糖酶的微生物為基因改造後的微生物(LeeCC,RenaE,GeorgeHR，etal.Cloningandcharacterizationofacold-activexylanaseenzymefromanenvironmentalDNAlibrary.Ext腿叩hiles，2006,10:295300)，這可能會導致這些菌株不穩定。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠製備耐冷木聚糖酶的木黴，以及利用這種木黴比較高效地製備性能較好的耐冷木聚糖酶的方法，所述性能包括較低溫度下的酶活和穩定性、酸鹼適應性。本發明提供的木黴是木黴SC9，是從海拔2000m以上的四川九寨溝採到的土樣中篩選得到新的木黴菌株。於2008年9月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.2680，分類命名為木黴OHc/zo血wwsp.義該保藏單位地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101。本發明提供的利用所述木黴SC9製備耐冷木聚糖酶的方法為以木聚糖為碳源，將所述木黴SC9在10-30'C發酵製得發酵液，過濾所述發酵液得到粗酶液，純化所述粗酶液得到耐冷木聚糖酶。所述發酵的發酵時間較佳為3-10天。較佳地，所述發酵為液體發酵，所述液體發酵是將所述木黴SC9接種到液體發酵培養基上進行發酵，所述液體發酵培養基的初始pH值為5-8，含有以下組分木聚糖10-40g/L，酵母提取物(含氮量為10.0-12.5%，Oxoid公司產品)5-20g/L，胰蛋白腖5-20g/L，CaCl20.1-1g/L，MgS047H200.1-1g/L，FeS040.1-1g/L，(NH4)2S040.1-1g/L。較佳地，所述木聚糖為選自樺木木聚糖、燕麥木聚糖和玉米芯木聚糖的一種或多種。較佳地，所述液體發酵培養基的初始pH值為6.5-7.5，含有以下組分玉米芯木聚糖20-30g/L，酵母提取物8-12g/L，胰蛋白腖8-12g/L，CaCl20.2-0.5g/L，MgS04'7H200.2-0.5g/L，FeS040.2-0.5g/L，(NH4)2S040.2-0.5g/L。較佳地，純化所述粗酶液包括下述步驟1)向液體發酵得到的粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至酶液中硫酸銨達到30-40%飽和度，冰水浴中攪拌30-60分鐘，然後冷凍離心，取上清液繼續添加硫酸銨粉末至酶液中硫酸銨達到50-60%飽和度，冰水浴中攪拌30-60分鐘，冷凍離心，將沉澱用少量的緩衝液溶解，溶液即為初步純化的耐冷木聚糖酶；2)將初步純化的耐冷木聚糖酶酶液，過DEAE52弱陰離子柱層析，平衡液選用pH5.5-6.5，20-30mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液，收集未吸附蛋白；3)將歩驟2)得到的未吸附蛋白(即木聚糖酶液)過SephadexG50凝膠過濾柱層析，用pH5.5-6.5，20-60mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液洗脫並收集，在280nm處測定各管的吸光值，並測定峰值附近樣品的木聚糖酶活力，酶活力較高的收集液經SDS-PAGE檢驗純度，蛋白單一的即為純酶液。收集目標蛋白峰即為純化的耐冷木聚糖酶。本發明提供的利用木黴SC9製備耐冷木聚糖酶的方法產率較高，製得的耐冷木聚糖酶具有很強的底物特異性，僅作用於木聚糖，對其它非木聚糖多糖均沒有活性，在較冷的溫度下具有較高的酶活性，穩定性和酸鹼適應性都比較好。圖1為該實施例得到的耐冷木聚糖酶純酶SDS-PAGE圖；圖2為不同反應溫度下的相對酶活的測定結果曲線；圖3為酶液的溫度穩定性曲線；圖4表示了不同pH值及體系的緩衝液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的相對酶活曲線;圖5表示了不同pH值及體系的緩衝液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的pH穩定性測定結果；圖6為木聚糖酶純酶水解樺木木聚糖和櫸木木聚糖所得產物的薄層層析圖7為木聚糖酶純酶水解木寡糖所得產物的薄層層析圖。具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例l、耐冷木聚糖酶的製備1)粗酶液的製備液體發酵培養基玉米芯木聚糖25g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白腖10g/L，CaCl20.3g/L，MgS04.7H200.3g/L，FeS040.3g/L，(NH4)2S040.3g/L，初始pH值為7的培養基。液體發酵低溫木黴菌SC9種子從保存的PDA斜面上劃線於新配製的PDA平板上，然後將平板放置於10-20。C培養箱中靜置培養2-8天。從生長良好的平板上刮下1cr^大小的低溫真菌菌絲體，接種在裝有50ml液體發酵培養基的三角瓶中，在空氣浴振蕩搖床中，20。C、160rpm振蕩培養，培養5天後將發酵液在10,000xg冷凍離心10分鐘，上清液即為含有木聚糖酶的粗酶液。木聚糖酶活力的測定方法採用DNS(3，5,二硝基水楊酸)法，參照文獻(Bailey,MJ,Biely，P，Poutanen,K.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J腸fec/wo/，1992,23:257-270)中所述的方法。具體步驟如下取0.1ml適當稀釋的上述方法製備的酶溶液，加入到0.9ml用0.05mol/L，pH5.5的檸檬酸緩衝液配製的1%樺木木聚糖底物溶液中，於3(TC下反應10分鐘，用DNS法測定釋放的還原糖量(Miller,GL.Useofdinitro-salicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.J"a/C/^m,1959,31:426-428)，同時以木糖作標準。木聚糖酶活力單位(U)定義為在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成lpmol木糖所需要的酶量。結果表明，液體發酵產木聚糖酶的產量在第4天時開始顯著增加，到第6天時達到最高，為36.7U/ml，第7天酶活力開始緩慢下降。2)耐冷木聚糖酶的純化①硫酸銨沉澱向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，使酶液中硫酸銨達到35%飽和度，冰水浴中攪拌60分鐘，然後12,000xg離心10分鐘，取上清液繼續添加硫酸銨粉末至酶液中硫酸銨達到55%飽和度，冰水浴攪拌60分鐘，10,000xg離心10分鐘取沉澱，將沉澱用少量的緩衝液溶解，溶液即為初步純化的耐冷木聚糖酶酶液；②弱陰離子柱層析經硫酸銨沉澱純化後的酶液，經弱陰離子柱層析進一步純化。選用Whatman公司的DEAE52為離子柱填料，層析柱長10cm，直徑1.0cm。平衡緩衝液為pH6.025mM檸檬酸-檸檬酸三鈉，流速lml/min。木聚糖酶液上樣後，收集未吸附的蛋白，每lmin收集一管(lml)。測定各管在280nm處的吸光值和木聚糖酶活力，酶活力較高的收集液進行超濾濃縮至lml左右，4。C冷藏備用。③凝膠過濾層析上述所得酶液經離子交換層析純化，採用Pharmacia公司的SephadexG50為凝膠柱填料，層析柱長60cm，直《5l.0cm。平衡緩衝液及洗脫緩衝液pH6.050mM檸檬酸-檸檬酸三鈉，流速0.083ml/min，12min收集lml，通過測定木聚糖酶活力來確定目標蛋白峰，最後通過電泳(SDS-PAGE)檢驗其純度，見圖l。SDS-PAGE方法按照Laemmli方法，如文獻(LaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.淑髒，1970，277:680-685)中所述進行。分離膠12.5%，濃縮膠4.5%，考馬斯亮藍染色顯示蛋白帶，低分子量標準蛋白與樣品在同一條件下電泳。蛋白含量的測定方法採用Lowry法，如文獻(Lowryetal.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent,/owrwa/o/CTzem/W^y,1951，193:265-275)中所述，以牛血清白蛋白作為標準蛋白繪製標準曲線。按照如上方法檢測粗酶液、硫酸銨沉澱得到的目標蛋白、經DEAE52離子交換層析和SephadexG50凝膠過濾得到的酶蛋白的量、酶比活，計算回收率和純化倍數。其中，回收率=各步驟總酶活/粗酶總酶活，純化倍數=各歩驟比活/粗酶比活。經過上述三步純化得到了電泳級木聚糖酶，純化過程中，按照步驟l)所述木聚糖酶活力的測定方法，比酶活達到349.2U/mg，與粗酶液相比純化了35.9倍，回收率為8.1%，具體結果如下表l。_表1液體發酵產木聚糖酶純化表_tableseeoriginaldocumentpage9圖1為該實施例得到的耐冷木聚糖酶純酶SDS-PAGE圖，其中，M:低分子量蛋白標準品；列l:純酶。實施例2耐冷木聚糖酶的性質耐冷木聚糖酶的最適溫度及不同溫度下的穩定性測定分別在不同溫度(0-80°C)下測定實施例l得到的耐冷木聚糖酶的活力，以酶活力最高點時的溫度作為耐冷木聚糖酶的最適溫度，以此酶活力作為100%。測定耐冷木聚糖酶的不同溫度下的穩定性將酶液分別在不同溫度下處理30min，冰水浴冷卻，然後測定殘餘酶活力，以未經處理的酶液做為對照(100%)來測定耐冷木聚糖酶的溫度穩定性。木聚糖酶活力的測定按照步驟l中所述方法進行。圖2為不同反應溫度下的相對酶活的測定結果曲線，該測定結果表明耐冷木聚糖酶的最適反應溫度為40-45。C，當溫度達到和高於50。C時酶活力迅速下降，50°(:時酶活力降為最高值的56%。該酶在4'C時的酶活力仍為最高值的10%左右，在20"時的酶活力為最高值的22%左右，說明該酶具有耐冷性。圖3為酶液的溫度穩定性曲線，可以看出，酶液在低於3(TC時很穩定，處理30min後酶活力損失較少，25。C時處理30min後酶活力仍保存90。/o左右，45r處理後酶活力急劇下降，損失了50%左右，說明該酶對溫度比較敏感，溫度稍高時酶活即損失較大，更說明了該酶在低溫下有較好的穩定性。耐冷木聚糖酶的最適pH值及pH穩定性測定將緩衝液分別換為不同pH值及體系的緩衝液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)加入到底物中30"C條件下測定該酶最適pH，以酶活力最高點作為100%。將不同緩衝體系下的酶液在3(TC條件下處理30min，冰水浴冷卻，測定殘餘酶活力，以未經處理的酶液作為對照(100%)測定木聚糖酶的pH穩定性。圖4表示了不同pH值及體系的緩衝液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的相對酶活曲線，結果表明該耐冷木聚糖酶的最適pH值為pH6.0，當pH處於5-7.2之間時，該酶比較穩定，酶活力能保留80%左右，當反應體系的pH偏酸或偏鹼時，酶活力受到抑制，酶活力下降較快。該耐冷木聚糖酶的pH穩定性測定結果顯示在圖5中，當pH在3.5-9.0之間時，該酶比較穩定，酶活力可以保留卯％以上，表明該酶具有廣泛的pH穩定性。實施例3、耐冷木聚糖酶的水解特性耐冷木聚糖酶的底物特異性通過在40t:條件下用不同來源的濃度為1%的天然底物進行分析。結果表明實施例2液體發酵並純化後的耐冷木聚糖酶具有很強的底物特異性，僅作用於木聚糖，對其它非木聚糖多糖均沒有活性。下表2顯示了該耐冷木聚糖酶對樺木木聚糖、燕麥木聚糖和櫸木木聚的底物特異性。表2耐冷木聚糖酶的底物特異性tableseeoriginaldocumentpage11耐冷木聚糖酶分別對樺木木聚糖、燕麥木聚糖和櫸木木聚糖在30°C下進行水解，同時以木二糖，三糖，四糖和五糖為底物進行水解。在O,0.25，0.5，1，2，4，6，12，和24h取樣進行TLC(薄層層析)分析。圖6為木聚糖酶純酶水解樺木木聚糖和櫸木木聚糖所得產物的薄層層析圖；圖7木聚糖酶純酶水解木寡糖所得產物的薄層層析圖，從左到右分別為木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。圖6和圖7中左右兩側的Xn列從上到下依此為木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。當該耐冷木聚糖酶分別以木寡糖(木二糖、木三糖、木四糖和木五糖)為底物進行水解時，水解產物主要為木二糖其次為木三糖，最終水解產物出現少量木糖。該酶不能水解木二糖，可以將木三糖，木四糖和木五糖逐漸水解為木二糖。權利要求1、木黴SC9，其特徵在於，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2680。全文摘要本發明的目的是提供一種能夠製備耐冷木聚糖酶的木黴，以及利用這種木黴比較高效地製備性能較好的耐冷木聚糖酶的方法。本發明提供的木黴是木黴SC9，保藏號為CGMCCNo.2680。本發明提供的利用所述木黴SC9製備耐冷木聚糖酶的方法為以木聚糖為碳源，將所述木黴SC9在10-30℃發酵製得發酵液，過濾所述發酵液得到粗酶液，純化所述粗酶液得到耐冷木聚糖酶。本發明提供的利用木黴SC9製備耐冷木聚糖酶的方法產率較高，製得的耐冷木聚糖酶具有很強的底物特異性，僅作用於木聚糖，對其它非木聚糖多糖均沒有活性，該酶最適反應溫度為40-45℃，在較冷的溫度下具有較高的木聚糖酶活性，穩定性和酸鹼適應性都比較好。文檔編號C12N9/42GK101381683SQ200810224159公開日2009年3月11日申請日期2008年10月24日優先權日2008年10月24日發明者鵬周,朱會芳,江正強,閆巧娟申請人:中國農業大學