使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的重組載體的製作方法

2023-11-30 23:26:51 1

專利名稱：：使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的重組載體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的功能的重組載體、通過由該載體轉化所得的蛋白水解酶基因表達、分泌亢進的麴黴、通過被轉化的麴黴生產蛋白水解酶的方法等。
背景技術：
：米麴黴(A/7erg7'〃MSO，flg)和醬油麴黴(J57^g/〃M51，'"e)麴黴在醬油、酒、豆醬等釀造食品的製造中可工業化應用。並且近年來如對其他生物一樣，人們還了解了米麴黴基因組序列(日本特開2005-176602號公報)，對其基因的功能性分析的重要性日益提高。上述麴黴生產、分泌各種酶類(蛋白水解酶、澱粉酶類等)，由於其優異的澱粉糖化能力和蛋白質分解能力等，廣泛應用於釀造食品的製造中。目前，如專利文獻l-3所述，對控制麴黴基因表達的各種轉錄因子進行了分析。專利文獻1:日本特開2003-240號公報專利文獻2:日本特開2003-70484號公報專利文獻3:日本特開2003-235584號公報專利文獻4:日本特開2005-176602號公報
發明內容本發明的目的在於提供新的使麴黴蛋白水解酶分泌增多的重組載體；以及通過使用該重組載體，在固體培養基培養和液體培養基培養下對所含蛋白質物質的分解效率提高的麴黴。本發明涉及以下各種方案的發明。(1)重組載體，該重組載體含有SEQIDNO.l、2、3或4所示的鹼基序列組成的DNA。(2)重組載體，該重組載體含有編碼具備使麴黴蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白質的DNA，上述DNA可與由下述石威基序列組成的DNA在嚴格條件下雜交，所述的i鹹基序列是與SEQIDNO.l、2、3或4所示的石威基序列組成的DNA互補的石威基序列。(3)重組載體，該重組載體含有編碼具備使麴黴蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白質的DNA，上述DNA由與SEQIDNO.l、2、3或4所示的石威基序列組成的DNA顯示80%或以上的序列同源性的鹼基序列組成。(4)麴黴，其特徵在於該麴黴被上述l、2或3的重組載體轉導或轉化，與親抹比較，其蛋白水解酶分泌能力增加。(5)蛋白水解酶的生產方法，其特徵在於將上述4的麴黴在固體培養基或液體培養基中培養，使蛋白水解酶分泌到培養基中，然後從培養基中收集蛋白水解酶。(6)蛋白質分解產物的製備方法，其特徵在於培養上述4的麴黴，將所得培養物與含有蛋白質的原料混合，分解原料中的蛋白質。(7)調味液的製備方法，其特徵在於培養上述4的麴黴，將所得培養物與含明膠的原料混合，分解原料中的明膠。(8)DNA，該DNA為以下(a)、(b)或(c)的DNA:(a)SEQIDNO.l、2、3或4所示鹼基序列組成的DNA;(b)編碼具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增加的功能蛋白質的所述的鹼基序列是與SEQIDNO.l、2、3或4所示的鹼基序列組成的DNA互補的石鹹基序列；(c)編碼具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增加的功能蛋白質的DNA，上述DNA由與(a)的鹼基序列的DNA顯示80%或以上的序列同源性的石威基序列組成。(9)蛋白質，該蛋白質為以下(a)或(b)的蛋白質(a)由SEQIDNO.l、2、3或4所示鹼基序列組成的DNA編碼的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)的胺基酸序列中通過使一個或多個胺基酸缺失、置換或附加所得的胺基酸序列組成的、具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的功能的活性的蛋白質。發明效果通過使用本發明的重組載體，可以使麴黴的蛋白水解酶分泌增多。通過使用由該重組載體轉化的麴黴，可以使在固體培養基培養和液體培養基培養中含有蛋白質的物質的分解效率提高。附圖簡述圖1是表示在本發明的轉化體(轉化菌)中，轉化用質粒插入到轉化體的基因組上的niaD基因區的、由Southern分析結果得到的電泳照片。圖2表示對麥麩培養基中的野生林和本發明的轉化林的蛋白水解酶活性的比較結果。實施發明的最佳方式本發明的重組載體中所含有的SEQIDNO.l、2、3或4所示的鹼基序列組成的DNA來自麴黴的基因組，如以下實施例具體所述，根據米麴黴全部基因組信息(日本特開2005-172206號公報)，依據同源性檢索、基序檢索、以及已知基因的註解或文獻信息、基序的種類等信息，推定其為編碼轉錄調節基因的DNA,如實施例所示，通過使用適當引物的PCR，可以由麴黴的基因組DNA等中獲得。本發明中的"SEQIDNO.l、2、3或4所示石威基序列組成的DNA，，中也包含只由編碼胺基酸區的鹼基序列(即只結合有外顯子部分的鹼基序列)組成的cDNA。上述cDNA可以使用根據本說明書中公開的鹼基序列信息製備的適當的引物，以麴黴的mRNA為模板，通過PCR等獲得。本發明相關的DNA還可以通過本領域技術人員所公知的任意方法化學合成獲得。本發明的重組載體含有編碼具備使麴黴蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白質的DNA,該DNA可以是與由互補於上述DNA的鹼基序列組成的DNA在嚴格條件下雜交的DNA,也可以由與上述DNA顯示約80%或以上、優選約95%或以上的序列同源性的石威基序列組成的DNA。這裡，雜交可才艮才居Molecularcloninngthird.ed.(ColdSpringHaeborLab.Press,2001)所記載的方法等、本領域技術人員所公知的方法或與其類似的方法進行。使用市售的文庫時，可按照所附使用說明書的方法進行。雜交可才艮才居CurrentprotocolsinMolecularbiology(editedbyErederickM.Ausubel等人.，1987)所記載的方法等、本領域技術人員所公知的方法或與其類似的方法進行。使用市售的文庫時，可按照所附使用說明書的方法進行。本說明書中，"嚴格條件下"可例舉在溫度60。C-68。C下、鈉濃度150-190mM、優選600-900mM、pH6-8的條件。如含有與該DNA的全部鹼基序列的同源性程度總體平均在約80%或以上，優選約95%或以上的鹼基序列的DNA等，所述的鹼基序列為與含有SEQIDNO.l-SEQIDN0.4表示的》威基序列的DNA互補的鹼基序列。鹼基序列間的相同性可使用本領域技術人員所熟知的算法、例如Balast確定。因此，本發明涉及編碼具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的功能的蛋白質的DNA，該DNA是含有SEQIDNO.l-SEQIDN0.4所示鹼基序列的DNA,與互補於該DNA的鹼基序列組成的DNA在嚴格條件下雜交的DNA，也可以是由與上述DNA顯示約80%或以上、優選約95%或以上的序列同源性的石鹹基序列組成的DNA;本發明還涉及由SEQIDNO.l、2、3或4所示的鹼基序列的DNA所編碼的胺基酸序列組成的蛋白質，以及與由這些胺基酸序列組成的、具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的功能的活性的蛋白質相關的蛋白質。為了確定兩種鹼基序列或胺基酸序列的序列同源性，序列在適宜狀態下進行前處理。例如，向一種序列中插入缺口(gap)，由此使其與另一序列的比對最佳化。然後對各位點的胺基酸殘基或鹼基進行比較。第一序列的某一位點與第二序列對應的位點同樣地存在某種胺基酸殘基或鹼基時，該序列在該位點為相同。兩種序列的序列同源性是以序列間相同的位點數佔總位點(全部胺基酸或全部石鹹基)數的百分比表示。根據上述原理，兩種鹼基序列或胺基酸序列的序列同源性例如通過Karlin和Altschul算法(Proc.麵.Acad.Sci.USA87:2264-2268、1990和Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877、1993)確定。使用上述算法的BLAST程序或FASTA程序主要是對於所給予的序列，從資料庫中檢索顯示高序列同源性的序列來使用。這例如可利用美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的網際網路網3佔。如上所述，顯示上述鹼基序列的序列同源性或所編碼的胺基酸序列的序列同源性的DNA可以以雜交作為指標，通過本領域研究人員通常採用的方法、例如通過使用上述BLAST軟體的檢索，從通過基因組鹼基序列分析等得到的功能未知的DNA組或公共資料庫中容易地發現。並且本發明的基因可通過各種公知的突變導入方法獲得。本發明的重組載體可以使用本領域技術人員所公知的適當的基因工程學方法，通過將上述DNA與載體連接來製備。載體只要是將上述DNA插入到要轉導或轉化的宿主微生物的基因組上適當的位置，結果與親林相比可以使宿主微生物的蛋白水解酶分泌能力增強，則其結構和種類等沒有特別限定。例如可以使用質粒、粘粒、噬菌體、病毒、染色體整合型、人工染色體等載體。公知的任意的標誌基因。標誌基因例如象URA3、niaD等，可以是與宿主的營養缺陷型互補的基因，或對氨卡青黴素、卡那黴素或寡黴素等藥物具有抗性的基因等。重組載體優選含有可在宿主細胞中表達本發明的基因的啟動子及其它調控序列(例如增強子序列、終止子序列、聚腺普酸化序列等)，進一步優選含有用於插入目標DNA插入的多克隆。這些重組載體中所含的各要素是本領域技術人員所公知的，例如具體可如實施例所示，有米麴黴的澱粉酶基因啟動子、米麴黴的澱粉酶終止子、作為標誌基因的米麴黴的niaD基因。轉導或轉化可通過公知的適當的方法進行。例如可以採用使用原生質體化後使用聚乙二醇和氯化鈣的方法(Mol.Gen.Genet.，218，99-104(1989))。轉導或轉化了本發明的重組載體的麴黴與親林相比，蛋白水解酶分泌增多。本說明書中，"使蛋白水解酶的分泌增多"或"蛋白水解酶的分泌增加，，其最終結果(現象)是蛋白水解酶分泌到菌體外的分泌量(分泌性能)增大，其原因、機理例如可能是蛋白水解酶的表達量(生產量)本身增加，以及所生產的該酶向菌體外分泌的量(分泌能力)增加等。並且，如以下實施例所述，這裡的"增大"是指可以採用用明膠或偶氮酪蛋白作為蛋白質的測定方法，由本發明的重組載體轉導或轉化的菌體培養基中的蛋白水解酶量(活性)與親抹相比顯著增加。因此如以下實施例所述，該載體所含的各序列所編碼的蛋白質可預測為轉錄調節因子，但並不僅限於具有與蛋白水解酶的轉錄調節元件結合、促進該蛋白水解酶的表達的功能，在用本發明的重組載體轉導或轉化的麴黴中，其還可以具有促進表達的蛋白水解酶分泌到菌體外的功能。麴黴是麴黴屬的微生物(菌類)的總稱，其代表性的例子除上述已述的米麴黴、醬油麴黴(As;e/^7/^sc/ae)之外，還特別有在食品、釀造領域中使用的菌泡盛麴黴G^/7^"'〃M和黑色麴黴04印wg"/wm'gw)等。另外，使用麴黴以外的在食品、釀造、化學、醫療領域中使用的工業上有用的絲菌等，實質上也可以獲得同樣的效果。這些菌的市售商品是購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)等各種7>共保藏糹幾構。"蛋白水解酶"也被稱為蛋白酶，是包含主要分解蛋白質的蛋白酶、或內肽酶、分解成小肽鏈的肽酶等的總稱。將與親林相比蛋白水解酶分泌能力增加的本發明的麴黴按照本發明領域人員所公知的任意方法進行培養，可以生產其所分泌的蛋白水解酶。例如，將本發明的麴黴在固體培養基或液體培養基中培養，使蛋白水解酶分泌到培養基中，然後由培養基中收集蛋白水解酶。上述生產方法中，培養體系、培養基的選擇、培養溫度、時間等培養條件可以以下實施例等作為參考，由本領域技術人員適當設定。根據本發明可培養麴黴，將所得培養物與含有蛋白質的原料混合，分解原料中的蛋白質，由此可製備蛋白質分解產物。在該方法中使用的原料所含的蛋白質的種類沒有特別限定，例如有明膠、膠原和麥谷蛋白等。例如含有明膠、膠原和麥谷蛋白等的原料的蛋白質分解產物可用作調味液。特徵在於通過重組載體轉導或轉化，與親抹相比，蛋白水解酶分泌能力增加的本發明的麴黴的具體例子是COO1、C002、C003和C004，於2005年9月9日保藏在郵政編碼305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所在的獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心，保藏號分別為FERMP-20659、FERMP-20660、FERMP-20661、FERMP-20662,然後於2006年8月30日根據國際承認用於專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約轉移保藏，保藏號分別為FERMBP-10668、FERMBP-10669、FERMBP-10670、FERMBP-1067L以下根據實施例進一步說明本發明，本發明的技術範圍並不限於此。實施例1(轉錄調節因子基因的推定和提取)按照以下方法，由米麴黴的全基因組信息(參照日本特開2005-176602號公報)，提取推定為編碼轉錄調節因子基因的序列。該步驟無需進行詳細的探討，具有轉錄調節因子可能性的均作為基本的提取對象。(1)提取根據同源性檢索推定為轉錄調節因子基因的序列將根據基因自動預測軟體推定為基因序列的DNA序列從米麴黴的全部基因組信息中全部提取，將這些DNA序列作為自動預測基因序列(以下稱為"自動預測基因序列")。測基因產物序列"、)作工為基礎序列，使工用同源性檢索軟體BLAST對已知蛋白質的公共資料庫(NCBI的非重複蛋白質資料庫nr)進行同源性檢索。對同源性檢索得到的序列的功能相關信息進行整理，對這些序列相關的基因功能信息進行關鍵詞檢索，選擇含有轉錄調節因子相關的關鍵詞的自動預測基因序列。(2)編碼胺基酸序列的DNA序列的^r索(該胺基酸序列被推定為轉錄調節因子結構相關的基序)對於自動預測基因產物序列，使用基序檢索軟體(HMMER)進行基序檢索(Pfam)，選擇編碼被推定包含轉錄調節因子相關基序的胺基酸序列的自動預測基因序列。(3)與已知轉錄調節因子序列具有同源性的DNA序列的檢索以麴黴或麴黴以外的絲狀菌相關的已知的轉錄調節因子的胺基酸序列作為問詢序列，使用同源性檢索軟體BLAST對本實驗得到的自動預測基因產物序列進行同源性檢索。使用同樣的問詢序列，使用BLAST(tblast)對麴黴的基因組重疊群序列進行同源性檢索，由此可以對通過自動預測未預測到的基因、或者在自動預測中以使DNA結合區等保守性高的區域有缺損的形式進行預測的基因進行檢索。由這些方法，從自動預測基因序列中提取了共667個候選基因(以下稱為"候選基因")。(候選基因的縮小範圍檢索和基因區的計算機分析)對於上述提取的被認為是轉錄調節因子基因的候選基因，依次進行基因區域的推定。在推定之前，根據相同的已知基因的註解或文獻信息、基序的種類等信息，研究是否適合作為強制表達的分析對象，將只有通過雜合複合物才能發揮功能的基因等不適合的基因排除。基因區域的推定主要是通過與相同的已知基因比較來進行。與相同的已知基因進行的比較是使用BLAST、FASTA和ALN(Bioinfomatics200016:190-202)進行。如果與已知基因的同源性受限於無法推定5，端，為了進行5，RACE,要準備同源部分的比對信息。如果預測的3，末端比原本基因區域短，則是轉錄調節因子的C末端一側被截短，預測過長時，則可以認為翻譯在原本C末端終止。因此，無法預測3，末端時，可以根據同源部分的距離、或相鄰基因的位置關係等，將自原本的3，末端至足夠的下遊的部分作為摻入到強制表達載體中的區域。通過上述方法，由在前項提取時與已知基因的同源性高的依次進行基因區域的推定。對於全長均為計算機推定的基因和部分通過5，RACE使5，末端明確的基因共300個基因，得到了的用於製備強制表達抹的預測序列。實施例2(表達用質粒的製備)作為用於使轉錄調節因子基因在麴黴內表達的表達質粒，構建了質粒pAPTLN。質粒pAPTLN中，含有米麴黴澱粉酶基因啟動子和構巢麴黴澱粉酶基因終止子、用於插入轉錄調節因子基因的多克隆位點作為表達單元，此外還含有米麴黴niaD基因的質粒作為標誌基因。挖取5x105個在瓊脂平板培養基上生長的構巢麴黴IAM2130抹孢子，使其懸浮於300ial加入到無菌樣i量管中的NucleiLysisSolution緩衝液(Promega製備)。向懸浮孢子的糹敖量管中加入1g玻璃珠BZ-06(7X7》林式會社製備)，使用TissueLyser(QIAGEN製備)，以25次/秒處理3分鐘，重複2次。在65。C下加溫15分鐘後，在室溫下》文置5分鐘。加入1.5ia1RNA酶溶液(IOmg/ml)，在37°C下加溫1小時。加入100ial蛋白沉澱溶液，劇烈振蕩20秒，然後以13,500rpm離心5分鐘。將離心後的上清轉移到另外的微量管中，加入350jul異丙醇，顛倒混合。然後以12,000rpm離心3分鐘。將所得沉澱用70%乙醇洗滌和乾燥處理，然後懸浮於100nl的TE緩沖液[10mMTris-HCl(pH7.5),lmMEDTA]，得到基因組DNA溶液。以所得基因組DNA為模板，使用下述引物進行PCR，進行構巢麴黴澱粉酶基因終止子區域的擴增。5，一gggtagtcgtacccgatgatgaaac—3，(SEQIDNO.5)5，一agcctaggccgctgcaggcag—3，(SEQIDNO.6)PCR反應是使用TaKaRaLATaq(夕力，」4才抹式會社製造)，使用PTC-200(MJResearch製備)進行。反應液的組成如下。(試劑使用量終濃度)TaKaRaLATaq:0.5|u110xLAPCR緩衝液II:5|lU:1x25mMMgCl2:5ja1:2.5mMdNTP混合液8各0.4mM模板DNA(0.5|Lig):1ja1引物1lalx2種類各0.2jnM無菌水28.5Ml合計液量50|nl將50jal上述反應液在0.2ml反應管中混合，設置於PPC-200中，通過設定以下溫度進行PCR。95°C、2分鐘1個循環95。C30秒、58。C30秒、72。C2分鐘30個循環72°C3分鐘1個循環將反應液用乙醇沉澱處理，然後將沉澱懸浮於20julTE緩沖液中。再用Pstl消化，然後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，切取目標擴增產物。切出的擴增產物用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)進行純化，得到構巢麴黴澱粉酶基因終止子。將質粒pUC19用Smal和Pstl處理，然後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)回收約2.7kb的DNA片段，將回收的DNA片段與構巢麴黴澱粉酶基因終止子連接，然後轉化大腸桿菌JM109,得到質粒pAT,該質粒pAT是在pUC19的位於多克隆位點內的Smal-Pstl位點插入構巢麴黴澱粉酶基因終止子得到的。將pAT用Smal和HindIII進行消化，用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)，回收含有構巢麴黴澱粉酶基因終止子的DNA片段。將質粒pMAR5(Biosci，Biotech.Biochem.,56(10)，1674-1675，1992)用Smal和HindIII消化，然後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)回收除去了argB基因和米麴黴澱粉酶基因終止子的DNA片段。將來自pAT和pMAR5的兩種DNA片段連接，然後轉化大腸桿菌JM109,得到含有米麴黴澱粉酶基因啟動子和構巢麴黴澱粉酶基因終止子的質粒pAPT。將100Ml含有下述兩種合成DNA(各100iuM)的TE緩衝液煮沸5分鐘，然後緩慢冷卻至室溫，製成多克隆位點接頭。將pAPT用EcoRI和Smal消化，然後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)，回收除去了多克隆位點的DNA片段。將多克隆位點接頭與回收的DNA片段連接，然後轉化大腸桿菌JM109,得到質粒pAPTL。將質粒pST14[(Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104)用HindIII消化，然後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)回收含有米麴黴niaD基因的DNA片段。將回收的含有niaD基因的DNA片段插入到pAPTL的HindIII位點，得到了轉錄調節因子基因表達用的質粒pAPTLN。(轉錄調節因子基因表達用重組載體的製備)根據預測為轉錄調節因子基因的DNA序列，通過PCR獲得各轉錄調節因子基因。首先製備米麴黴RIB40的基因組DNA。接著以製備的基因組DNA為模板，參考預測基因的起始密碼子上遊100bp的DNA序列和終止密碼子附近的DNA序列製備兩種引物，通過PCR獲得各轉錄調節因子基因。參考起始密碼子上遊的DNA序列製備引物時，導入限制酶識別序列，該限制酶識別序列位於pAPTLN的多克隆位點上，且要擴增的轉錄調節因子基因序列內不存在識別序列。擴增的轉錄調節因子基因用在製備的引物中導入了識別序列的限制酶進行處理，然後插入到pAPTLN的多克隆位點(導入的限制酶位點和Saml位點之間)，製成用於各轉錄調節因子基因表達的重組質粒載體。以下給出轉錄調節因子基因表達用質粒載體的一個製備例子。採用上述方法，以由米麴黴RIB40菌林製備的基因組DNA為模板，使用下述引物進行PCR，得到轉錄調節因子基因C001(SEQIDNO.l)。5，一atacaggcattctatcgataaaatgtttcc—3，(SEQIDNO.7)5,—gggctacatctgctgttgtagaagttgc—3，(SEQIDNO.8)PCR反應是使用TOYOBOKOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO製備)，使用PPC-200(MJResearch製備)進行。反應液的組成如下。(試劑使用量終濃度)KOD誦Plus-DNA聚合酶1jli1KOD-Plus-的10xPCR緩沖液5|i1:1x25mMMgCl2:2ja1:1mM2mMdNTP混合液5|a1:各0.2mM模板DNA(0.2jug):1ju1引物1julx2種類各0.3|aM無菌水34ilU合計液量50jul將50jul上述反應液在0.2ml反應管中混合，裝於PPC-200中，通過設定以下溫度進行PCR。94°C、2分鐘1個循環94。C15秒、58。C30秒、68。C4分鐘30個循環68°C3分鐘1個循環將反應液進行乙醇沉澱處理，然後將沉澱懸浮於20ial的TE緩衝液[IOmMTris-HCl(pH7.5),1mMEDTA]。再用Clal消化，然後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，切取目標擴增產物。切取的擴增產物用凝膠純化試劑盒(QIAGEN製備)純化，然後插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Smal位點，得到轉錄調節因子基因C001表達用質粒pCOOl。採用同樣方法得到轉錄調節因子基因C002表達用質粒pC002、轉錄調節因子基因C003表達用質粒pC003、轉錄調節因子基因C004表達用質粒pC004。擴增轉錄調節因子基因C002(SEQIDNO.2)時，使用導入了Nhel識別序列代替Clal的下述兩種引物進行擴增、純化，然後插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Smal位點。5，一tcatacaagctagcaaaatggcggaga—3，(SEQIDNO.9)S'—gggctcgataacttmactcccgtgata—S'(SEQIDNO,10)擴增轉錄調節因子基因C003(SEQIDN0.3)時，使用導入了Clal和Spel識別序列的下述兩種引物進行擴增、純化，然後插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Spel位點。5,—ccatcgataatattagtatgctgaatga—3,(SEQIDNO.11)5,—ggactagttcaggtctttcgaatgtcagga—3'(SEQIDNO.12)擴增轉錄調節因子基因C004(SEQIDNO,4)時，使用導入了Clal和Spel識別序列的下述兩種引物進行擴增、純化，然後插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Spel位點。5，一ccatcgataagtaaaaggatgttattagat—3，(SEQIDNO.13)5，—ggactagtttaatccgttctcatggccgaa—3，(SEQIDNO.14)實施例3(轉錄調節因子基因強制表達麴黴的獲得)將按照Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104記載的方法由RIB326菌抹獲得的niaD缺損菌林用轉錄調節因子基因表達用質粒pCOOl、pC002、pC003、pC004轉化。轉化方法是通過在原生質體化後使用聚乙二醇和氯化釣的方法(Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104)進行。使用各5Mg質粒進行轉化，在極限培養基中選擇轉化體，各得到約200個集落。其中，對於每種質粒，對15個集落在極限培養基中反覆進行單一分生孢子分離，使轉化穩定。接著，將各轉錄調節因子基因的成熟區域作為探針，進行DNA分析，由各轉化體中選擇以下的菌株轉化中使用的質粒插入到了轉化體的基因組上的niaD基因區域。將各選擇株命名為C001、C002、C003、C004。DNA分析的結果如圖1所示。實施例4(麴黴的培養方法和菌體外酶活性的測定)(1)明膠培養基中麴黴的培養方法和與明膠分解相關的蛋白水解酶活性的測定將各轉化體在含有明膠的液體培養基中振蕩培養，確認明膠分解能力。各轉化體的明膠分解能力的評價是與明膠分解產生的培養基中的穀氨酸濃度作為對照比較進行。在瓊脂極限培養基上生長的各轉化體的孢子用3ml的無菌水挖取，接種於裝入到150ml容量三角燒瓶中的40ml明膠培養基(2%明膠、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4、0.05%KC1、0.001%FeS047H20、0.3%NaCO3、3%麥芽糖，pH6.0)(1x107個孢子/40ml明膠培養基)。在30。C下以150rpm振蕩培養115小時，然後使用弋7廿L-穀氨酸測定試劑盒(Y^廿醬油抹式會社製備)測定培養上清中的穀氨酸量。另外，以上述明膠分解能力為指標，測定培養上清中蛋白質分解酶活性。作為對照，在每個實驗時將RIB326菌林niaD缺損林用pAPTLN轉化，培養所得的niaD+菌抹。在轉化體中，被認為明膠分解能力最高的C004培養上清中的穀氨酸量和蛋白水解酶活性以相對於對照的相對值表示。[表l]tableseeoriginaldocumentpage16(2)與麥麩培養基中麴黴野生菌抹在培養方法和本發明的轉化體蛋白水解酶活性方面的比較麥麩將去離子水以5:4的比例混合，在室溫下放置30分鐘，然後以5g分別分注到150ml容量的三角燒瓶中，高壓釜滅菌15分鐘。接著，將預先用血細胞計測定了孢子數的野生米麴黴RIB326菌林或強制表達林的孢子懸浮液接種於麥麩培養基中，1g麥麩培養基中接種5x105個孢子。在30。C下培養4天。培養開始後第24小時和第48小時進行混合，然後靜置至培養終止。酶液如下獲得。向培養結束後的麥麩培養基中加入50ml去離子水和500jil甲苯，在室溫下振蕩2小時，將懸浮液用No.2濾紙過濾(7卜"、':^^7夕製造)，得到濾液，以此作為酶液。如以下計算式表示，蛋白水解酶活性是以野生林的酶活性為1時按照比率進行比較。酶活性比率=強制表達抹(試樣的吸光度-空白的吸光度)/野生抹)(試樣的吸光度-空白的吸光度)。蛋白水解酶活性測定如下進行。求出試樣和空白的吸光度。向預先加溫至30。C的2ml底物液(P/。偶氮酪氨酸、0.05M磷酸緩沖液pH7.0)中加入20jlU酵液，混合。接著將其在30°C下反應20分鐘，然後加入21111反應中止液(10%三氯乙酸)，中止反應。在30°C下放置20分鐘，將生成的沉澱用No.5C濾紙過濾，測定濾紙的吸光度(410nm)。空白是在添加酶液之前添加反應中止液，進行同樣的揭:作。對野生株與強制表達抹的蛋白水解酶活性進行比較，結果可以確認，C002、COOl、C003顯示為野生抹的3倍的蛋白水解酶活性(圖2)。對於C004,顯示為野生抹的2.2倍的蛋白水解酶活性。由以上結果表明，用含有COOl、C002、C003、C004的各DNA序列的本發明的重組載體轉化的麴黴相對於麴黴原林，蛋白水解酶分泌顯著增加。在液體培養基的明膠培養基、固體培養基的麥麩培養基中，蛋白水解酶活性分別增大，產業實用性高。其中，本發明的COOl、C002、C003、C004的DNA序列如序列表1-4所示(從序列表最初至第101號表示起始密碼子的先頭鹼基，由結束至第101號表示終止密碼子的最終鹼基)。C001具有C2H2型鋅指基序，與構巢麴黴的steA基因在胺基酸水平顯示81%相同的同源性。有報導稱steA基因在構巢麴黴中是作為有性生殖所必須的基因(Vallim等人，MolMicrobiol.36(2):290曙301)。C002具有Zn2-Cys6(黴菌雙核鋅集群(Fungalzincbinuclearcluster))型的鋅指基序，與煙麴黴的編碼推定的C6指狀結構域蛋白的、功能未知的基因在胺基酸水平顯示67%相同的同源性。與C002顯示同源性的基因中，在已經報導了其功能並顯示最高同源性的是血紅叢赤殼(A^"n'a/aem^ococca)的與角質酶基因的轉錄相關的naf基因，其同源性在胺基酸水平不過只有31%相同。C003是Zn2-Cys6(黴菌雙核鋅集群(Fungalzincbinuclearcluster))型的zincfinger基序，與煙麴黴的編碼推定的C6指狀結構域蛋白的功能未知的基因(與上述C002中顯示最高同源性的基因為不同的基因)在胺基酸水平顯示55%相同的同源性。在與C002顯示同源性的基因中，在已經報導了其功能並顯示最高同源性的是構巢麴黴的與硝酸同化相關基因的轉錄有關的nirA基因，其同源性在胺基酸水平上不過只有22%(以上的同源性是根據BLAST(blastp)，以NCBI的nr資料庫為對象顯示同源性檢索結果)。C004具有C2H2型的鋅指基序，與構巢麴黴的amdX基因在胺基酸水平顯示73%相同的同源性。有報導稱，amdX基因在構巢麴黴作為編碼乙醯澱粉酶的amdS基因的轉錄活化因子(Murphy等人、MolMicrobiol.23(3):591-602，(1997))。因此，這些以往公知的基因中，根據其基因序列和同源基因的功能，並未顯示通過強制表達可以使蛋白水解酶活性增大。產業實用性本發明在調味品的食品製造或消化劑等藥品製造、洗滌劑用的蛋白水解酶生產等工業中極為有用。權利要求1.重組載體，該重組載體含有SEQIDNO.1、2、3或4所示的鹼基序列組成的DNA。全文摘要在調味品的食品製造或消化劑等藥品製造、洗滌劑用的蛋白水解酶生產等中，可以使固體培養基和液體培養基培養下的麴黴的蛋白水解酶活性提高。本發明提供具有使麴黴蛋白水解酶的分泌增多的功能的重組載體，由該載體轉化的使蛋白水解酶基因表達、分泌亢進的麴黴，通過轉化的麴黴生產蛋白水解酶的方法等。文檔編號C07K14/38GK101273129SQ200680035259公開日2008年9月24日申請日期2006年9月19日優先權日2005年9月26日發明者伊藤享,佐野元昭,內川知美,岡千壽,前田浩,增田力,松島健一朗,海附玄龍,田中昭光,田井中均,町田雅之,畑本修申請人:財團法人野田產業科學研究所;龜甲萬株式會社