一個可用於篩選抗結核藥物的靶點蛋白的製作方法

2023-11-30 21:45:06 2

專利名稱：一個可用於篩選抗結核藥物的靶點蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一個可用於篩選抗結核藥物的結核桿菌H37Rv 來源的藥物作用靶點蛋白吲哚一3 —甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerol phosphate synthase)(在NCBI資料庫中編號GI:15608749)，該蛋白的編碼基因trpC在 #yco6actei^'〃/ t"6erc"7osis H37Rv基因組中的編號為^V7W7。
背景技術：
結核病是由結核桿菌引起的嚴重危害人類健康的傳染病。全球接近32%的人口約 21億感染結核桿菌。每年約有280萬人死於結核病。據該組織2007發布的數據顯示， 全球新感染肺結核的患者達到每年880萬人的創紀錄水平，而且結核桿菌的抗藥性也 在不斷增強。肺結核己經成為全球最為致命、同時也是治療成本最高的傳染病之一。 我國是世界第二結核病大國，有5億以上人口受到結核菌感染，傳染性肺結核患者達 200萬，每年因結核病死亡人數有25萬之多，國民經濟損失達35億元。衛生部的統 計顯示，2006年中國的結核病發病率和死亡率高居傳染病首位。結核病疫情回升的主 要原因之一是耐藥結核桿菌的肆虐。因此，開發針對耐藥結核桿菌的新型抗結核藥物 迫在眉睫。
結核桿菌耐藥性產生的一個重要機制就是目前臨床常用抗結核藥物在細菌體內作 用靶點的突變。因此開發新型抗結核藥物尤其是針對耐藥結核桿菌的藥物，我們需要 選擇一個新的藥物作用靶點。細菌體內的重要代謝途徑是抗結核藥物的重要作用靶點。 由此，我們將研究重點定位於細菌體內的色氨酸生物合成途徑。色氨酸是細菌生命活 動中的重要胺基酸，色氨酸生物合成過程中，吲哚-3-甘油磷酸合成酶 (indole-3-glycerol phosphate synthase, IGPS)[1]催化最後一步的環形閉合反應。IGPS也 是與結核分支桿菌細胞壁糖和脂質代謝有關的酶,與結核分枝桿菌中密度脂蛋白代謝 和呼吸作用相關，由此推測IGPS對結核分枝桿菌的存活起著極其重要作用，是結核分 枝桿菌生存必需的。此外，本課題組通過雙向電泳[2]證實，IGPS在異煙肼耐藥株中的 表達顯著高於異煙肼敏感株，抗結核治療後IGPS表達顯著下調。同樣預測了該基因是 結核桿菌耐藥的關鍵基因之一。IGPS屬於芳香族胺基酸生物合成過程中的關鍵酶，而 哺乳動物和人類中均不存在該酶的編碼基因；同時，用BLAST軟體在NCBI (http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov)資料庫中進行搜索，並未發現人類基因組中存在與IGPS同源的蛋白質或部分胺基酸序列[3]。因此，IGPS有望作為篩選抗結核藥物的候選靶位，尤其對異煙
肼耐藥菌株。

發明內容
本發明的目的是提供一個能夠用於篩選抗結核藥物的結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv來源的藥物作用靶點蛋白吲哚一3 —甘油磷酸合成酶 (indole-3-glycerol phosphate synthase)。
本發明藉助計算機輔助藥物高通量篩選技術從化合物資料庫中篩選到2個IGPS 酶有效抑制劑。我們以晶體結構1VC4(PDB ID)為模板，同源模建結核桿菌H37Rv來 源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)的三維結構。藉助計算機輔助藥物設計技術與生 物學實驗技術的結合，從化合物資料庫中篩選與IGPS結合較好的化合物2個。l號化 合物N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三嗪-2,4-二胺(英文名 N'-[l-(2-hydroxyphenyl)ethylidene] —4，5誦dihydro-lH-benzo[g] indazole-3-carbohydrazide， 以下簡稱化合物I)，在體外能夠與IGPS酶的結合(平衡解離常數1.2e-6)。在體外 能夠有效抑制結核桿菌H37Ra (最小抑菌濃度0.625pg/ml) ， H37Rv (最小抑菌濃度 0.1嗎/ml)和耐藥結核桿菌(最小抑菌濃度0.1嗎/ml)的生長。2號化合物5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-^-苯甲基)卩引哚-3-羧酸(英文名 5-[3-[(3，5-dimethyl-lH
-pyrazolyl)]-2勿droxy-propoxy]-2-methyl-1 -(p-tolyl)-1 H-indole-3-carboxylic， 以下 簡稱化合物II)與IGPS的結合平衡解離常數為1.2e-7，能夠有效抑制IGPS酶活性的 化合物，在體外能夠有效抑制結核桿菌H37Ra (最小抑菌濃度0.2pg/ml) ， H37Rv(最 小抑菌濃度0.1ng/ml)和耐藥結核桿菌(最小抑菌濃度0.1pg/ml)的生長。由此兩個 實例證明，結核桿菌體內的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycero1 phosphate synthase: IGPS)是一個有效的篩選抗結核藥物的作用靶點蛋白。 化合物I和化合物I的結構式如下formula see original document page 5
化合物II
結核桿菌H37Rv來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycero1 phosphate synthase, IGPS)的蛋白質序列見SEQ.IDNOl。
本發明利用體外化合物I和II對化合物與IGPS的結合實驗，以及體外對結核杆 菌的抑制試驗來篩選IGPS抑制劑的方法，包括下述內容
1、化合物I:N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物與IGPS 的體外結合能力的測定
將IGPS蛋白〔720|ag/ml)溶於1%DMS0的PHBS緩衝液。然後在晶片上進行固定。將化合物I配置成1(T5M、 0.5xl(T5M、 0.25xl(T5M、 0.125xl(T5M、 0.625x10—6M、 0.3125xlO-6M、 0.15625xlO-6M、 0.78125><l(r7M、 0.390625xl0-7M、 0.1953125x 10-7M等 濃度。在biacore3000與蛋白質發生結合作用，測定平衡解離常數(KD)。
2、 化合物II: 5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基) 吲哚-3-羧酸化合物與IGPS的體外結合能力的測定
將IGPS蛋白(720|iig/ml)溶於1%DMS0的PHBS緩衝液。然後在晶片上進行固 定。將化合物II配置成1x10—5M、 lxlO—6M、 Ixl0—7M、 0.1x10—7M等濃度。在大分子互 作儀biacore3000上與蛋白質發生結合，測定平衡解離常數(Kd)。
3、 化合物I: N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l，3,5-三嗪-2，4-二胺化合物體外抑 制結核桿菌生長測定
(1)結核桿菌的接種方法取製備好的lmg/ml結核桿菌菌懸液5)al，含菌數量1 一5xl05，分別接種於每支含500ul7H9的液體培養基(7H9乾粉4.7g / L，含2ml / L (v/v)甘油和10%ADC，)中。
(2) N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物體外最小抑菌 濃度(MIC)的測定將N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5- 三-2,4-二胺化合物稀 釋成不同濃度梯度，並於按上述方法接種完結核桿菌的培養管中添加各濃度梯度的化 合物I。接種完畢後，置37'C恆溫孵箱內培養，3周觀察結果。將能抑制培養基中細菌生 長的最低濃度定為該化合物的最小抑菌濃度(MIC)。
4、 化合物II 5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-P比唑)-2-羥基-丙氧基卜2-甲基-l-(p-苯甲基)口引 哚-3-羧酸化合物體外抑制結核桿菌生長測定
(1)結核桿菌的接種方法取製備好的lmg/ml結核桿菌菌懸液5pl，含菌數量l 一5xl05，分別接種於每支含500ul7H9的液體培養基(7H9乾粉4.7g / L，含2ml / L (v/v)甘油和10%ADC，)中。
(2) 5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-卩比唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)卩引哚-3-羧 酸化合物體外最小抑菌濃度(MIC)的測定將N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三-2,4-二胺化合物稀釋成不同濃度梯度，並於按上述方法接種完結核桿菌的培養管中 添加各濃度梯度的化合物II。接種完畢後，置37'C恆溫孵箱內培養，3周觀察結果。將能 抑制培養基中細菌生長的最低濃度定為該化合物的最小抑菌濃度(MIC)。
本發明基於結核分枝桿菌H37Rv吲哚-3-甘油磷酸合成酶篩選到兩種化合物I (N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三嗪-2,4-二胺)和化合物II(5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫—批唑) -2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-^-苯甲基)卩引哚-3-羧酸)，能夠有效抑制結核桿菌的生長。證明結核分枝桿菌H37Rv吲哚-3-甘油磷酸合成酶是一個用於篩選抗結核藥物
的有效作用靶點。


圖l、化合物I與IGPS酶的相互作用。反應曲線由下向上，依次代表濃度由低到 高變化時，化合物與IGPS的結合反應曲線。結果說明，隨著化合物濃度的升高化合 物與IGPS酶的結合能力增加。
圖2、化合物II與IGPS酶的相互作用。反應曲線由下向上，依次代表濃度由低到 高變化時，化合物與IGPS的結合反應曲線。結果說明，隨著化合物濃度的升高化合 物與IGPS酶的結合能力增加。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發現作進一步闡述，但不限制於本發現。
下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括
H37Ra、 H37Rv和臨床耐藥菌株均為上海市肺科醫院樂軍博士惠贈，而且H37Rv 和臨床耐藥菌株的抑菌實驗在上海市肺科醫院進行； 7H9乾粉和7H10乾粉購自DIFCO公司。 實施例1化合物I ( N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l，3，5-三嗪-2，4-二胺)與 IGPS相互作用分析實驗
(一) 試驗方法
將IGPS蛋白(720pg/ml)溶於1%DMS0的PHBS緩衝液。然後在晶片上進行固 定。將化合物I配置成1(T5M、 0.5xl(T5M、 0.25xl(T5M、 0.125xlO-5M、 0.625xl(T6M、 0.3125xl(T6M、 0.15625xlO-6M、 0.78125xlO-7M、 0.390625xl0-7M、 0.1953125xl0-7M等 濃度。化合物I在biacore3000分析儀上與蛋白質發生結合，測定平衡解離常數(Kd)。
(二) 試驗結果
實驗結果證明，N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三嗪-2，4-二胺化合物與 IGPS酶具有較強的結合能力(圖3)。不同濃度時化合物I與IGPS的結合曲線表明， 隨著化合物濃度的升高，化合物I與IGPS酶的結合能力也在提高，即化合物I與IGPS 酶的結合能力跟化合物濃度存在一定的正相關性。化合物I與IGPS的平衡解離常數 (Kd)為1.2e-6。上述實驗結果有力的證明，化合物I在體外可以很好的與IGPS酶結 合°
實施例2化合物II (5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-( -苯甲基)H引哚-3-羧酸)與IGPS相互作用分析實驗
(一) 試驗方法
將IGPS蛋白(720pg/ml)溶於1%DMS0的PHBS緩衝液。然後在晶片上進行固 定。將化合物II配置成lxl(T5M、 Ixl0—6M、 Ixl0—7M、 0.1xl0—7M等濃度。化合物II 在biacore3000分析儀上與蛋白質發生結合，測定平衡解離常數(Kd)。
(二) 試驗結果
實驗結果證明，N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物與
IGPS酶具有較強的結合能力(圖4)。不同濃度時化合物II與IGPS的結合曲線表明，
隨著化合物濃度的升高，化合物II與IGPS酶的結合能力也在提高，即化合物與IGPS
酶的結合能力跟化合物濃度存在一定的正相關性。化合物II與IGPS的平衡解離常數
(Kd)為1.2e-7。上述實驗結果有力的證明，化合物II在體外可以很好的與IGPS酶 妙a
￡口 a o
實施例3:化合物I (N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l，3，5-三嗪-2，4-二胺)體外 抑制結核桿菌生長測定 (一)試驗方法
(1) 結核桿菌的接種方法取製備好的lmg/ml結核桿菌(H37Ra、 H37Rv禾口臨床 耐藥菌株)株菌懸液5ul，含菌數量l一5xl05，分別接種於每支含500ul7H9的液體培 養基(7H9乾粉4.7g/L，含2ml/L (v/v)甘油和10%ADC，)中。
(2) N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3，5-三嗪-2,4-二胺化合物體外最小抑菌 濃度(MIC)的測定將N-苯基-6-哌啶基-N，-奎寧-8-並噠嗪-l,3,5-三-2,4-二胺化合物 稀釋成不同濃度梯度(200ng/ml， 100|ag/ml， 50pg/ml， 25pg/ml， 12. 5 ng/ml,6.25 |ig/ml,0.625 |ig/inl， 0.5 pg/ml、 0.4 |ig/ml、 0.3 pg/ml、 0.2 ^g/ml、 0.1 ng/ml)，並於按 上述方法接種完結核桿菌的培養管中添加各濃度梯度的化合物1。接種完畢後，置37°C 恆溫孵箱內培養，3周觀察結果。將能抑制培養基中細菌生長的最低濃度定為該化合物 I的最小抑菌濃度(MIC)。
(二)試驗結果
結果發現，N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l,3，5-三嗪-2,4-二胺化合物能夠在較 低濃度下顯著抑制結核桿菌的生長。其中，化合物I對結核桿菌H37Ra的最小抑菌濃 度(MIC)為0.625ng/ml;化合物I對標準有毒株的最小抑菌濃度(MIC)為0.1|ag/ml; 化合物I對結核桿菌臨床耐藥菌株的最小抑菌濃度(MIC)為0.1pg/ml。實驗結果重複3次(表l)。
實施例4:化合物II (5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-B比唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯 甲基)吲哚-3-羧酸)體外抑制結核桿菌生長測定
(一)試驗方法
(1) 結核桿菌的接種方法取製備好的lmg/ml結核桿菌(H37Ra、 H37Rv和臨床 耐藥菌株)株菌懸液5ul，含菌數量l一5xl05，分別接種於每支含500ul7H9的液體培 養基(7H9乾粉4,7g/L，含2ml/L (v/v)甘油和10%ADC,)中。
(2) 5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)口引哚-3-羧酸 化合物體外最小抑菌濃度(MIC)的測定將5-[3-(3， 5-二甲基-1-氫-卩比唑)-2-羥基-丙 氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物稀釋成不同濃度梯度(200貼/ml， 100pg/ml， 50(ig/ml， 25|ig/ml， 12. 5 ng/ml,6.25 ng/ml，0.625 ng/ml， 0.5 |ig/ml、 0.4 |ig/ml、 0.3 pg/ml、 0.2 pg/ml、 0.1 pg/ml)，並於按上述方法接種完結核桿菌的培養管中添加 各濃度梯度的化合物II。接種完畢後，置37'C恆溫孵箱內培養，3周觀察結果。將能抑 制培養基中細菌生長的最低濃度定為該化合物的最小抑菌濃度(MIC)。
(二)試驗結果
結果發現，5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-卩比唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)H引哚 -3-羧酸化合物能夠在較低濃度下顯著抑制結核桿菌的生長。其中，化合物II對結核杆 菌H37Ra的最小抑菌濃度(MIC)為0.2|_ig/ml;化合物對標準有毒株的最小抑菌濃度 (MIC)為0.1ng/ml;化合物對結核桿菌臨床耐藥菌株(8株)的平均最小抑菌濃度(MIC) 為0.1^ig/ml。實驗結果重複3次(表2)。
上述4個實施例的結果都有力的說明，化合物I (N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠 嗪-l,3,5-三嗪-2,4-二胺)和化合物II (5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)(l引噪-3-羧酸)通過與結核桿菌來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS) 結合抑制IGPS酶的催化活性，從而有效的抑制了結核桿菌的生長。化合物I對H37Ra 的MIC為0.625pg/ml;化合物I對有毒株和臨床耐藥菌株的MIC為0.1pg/ml。化合物 II對H37Ra的MIC為0.2ng/ml;化合物II對有毒株和臨床耐藥菌株的MIC為0.1|ig/ml。 結核分枝桿菌H37Rv體來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶可作為有效的篩選抗結核藥物 的作用耙點蛋白。表l化合物I抑制結核桿菌生長的部分實驗結果 化合物濃度Og/ml) 12.5 6.25 0.625 0.5 0.4 0,3 0.2~~^"i ^~對照
耐藥株 = Z = ^~~11 ~~Z~"= Z ^ ^
H37Rv _一一_一—一— + +
H37Ra —_ — + + + + + + +
表2化合物II抑制結核桿菌生長的部分實驗結果
化合物濃度Oig/ml) 12.5 6.25 0.625 0.5 0.4 0.3 0.2~51 ^~~對照
耐藥株*= = = = ~~=~~="~=~^ ^
H37Rv —一一 + +
H37Ra— — 一__一一 + + +
*實驗中採用的耐藥菌株共8株，實驗數據為8株的平均值。 參考文獻 H Zalkin, JL Paluh， M van Cleemput, WS Moye and C Yanofsky, Nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae genes TRP2 and TRP3 encoding bifunctional anthranilate synthase: indole-3-glycerol phosphate synthase, J. Biol, Chem., 1984, 259 ， 3985-3992 。樂軍，劉麗蓉，謝建平，劉蓓，梁莉，王洪海，異煙肼耐藥和敏感結核分 枝桿菌的比較蛋白質組學研究，中華微生物學和免疫學雜誌，2004,24: 258-262。
3] Yang YP， Zhang M, Zhang HM, Lei JQ, Jin RL, Xu SF, Bao JL, Zhang L, Wang H, Purification, characterization and structural study of Mycobacterium tuberculosis indole-3-glycerol phosphate synthase. Biochemistry (Moscow) 2006, 71:s38-s43 。
序列表
SEQ IDNOl:
1 mspatvldsi legvradvaa reasvslsei kaaaaaappp ldvmaalrep gigviaevkr 61 aspsagalat iadpaklaqa yqdggarivs wteqrrfqg slddldavra svsipvlrkd 121 fwqpyqihe arahgadmll livaaleqsv lvsmldrtes lgmtalvevh teqeadralk 181 agakvigvna rdlmtldvdr dcfariapgl pssviriaes gvrgtadlla yagagadavl 241 vgeglvtsgd praavadlvt agthpscpkp ar
權利要求
1、一個用於篩選抗結核藥物的靶點蛋白，其特徵在於為結核桿菌H37Rv來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶，其蛋白質序列為SEQ.ID NO1。
2、 一種結核桿菌H37Rv來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶作為篩選抗結核桿菌藥物 的作用靶點的應用。
3、 一種與IGPS結合能抑制IGPS催化活性的結核桿菌生長抑制劑，其特徵在於 為化合物I: N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-並噠嗪-l，3,5-三嗪-2,4-二胺，或化合物II: 5-[3-(3， 5-二甲基-l-氫-卩比唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-^-苯甲基)餵哚-3-羧酸。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，具體為一個可用於篩選抗結核藥物的靶點蛋白。該靶點蛋白是結核桿菌H37Rv來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶IGPS。其抑制劑化合物I(N-苯基-6-哌啶基-N′-奎寧-8-並噠嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和化合物II(5-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸)在對結核桿菌生長的體外抑制試驗中，能夠顯著的抑制結核桿菌的生長。其中，化合物I對結核桿菌H37Ra的最小抑菌濃度為0.625μg/ml；化合物II對結核桿菌H37Ra的最小抑菌濃度為0.2μg/ml；化合物I和化合物II對標準有毒株H37Rv的最小抑菌濃度都為0.1μg/ml；化合物I和化合物II對結核桿菌臨床耐藥菌株的最小抑菌濃度都為0.1μg/ml。
文檔編號C12Q1/25GK101307306SQ20081003960
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者徐勝鳳, 楊豔萍, 沈洪波, 王洪海, 王菲菲, 胡海榮, 強 黃 申請人:復旦大學