一種雪蛤抗氧化肽的製備方法與流程
2023-12-01 08:58:51
本發明涉及抗氧化鈦製備技術領域，具體是一種雪蛤抗氧化肽的製備方法。
背景技術：
近年來大量的研究表明，從各種海洋生物蛋白水解液中分離得到的多肽，具有潛在的抗氧化能力。目前國內外報導已從烏賊、牡蠣、藍貽貝、長尾鱈、竹莢魚及鱈魚等海洋動物中分離得到抗氧化活性肽。這些海洋生物抗氧化活性肽能有效地清除機體內的自由基和活性氧或者通過阻斷脂質過氧化過程中的自由基鏈式反應來預防因氧化而造成的機體損傷。
目前海洋生物活性肽的提取方法主要有3 種：溶劑萃取、微生物發酵和酶水解。由於酶水解法沒有有機溶劑及有毒的化學品的殘留已成為食品和製藥工業的首選方法。
現有技術如授權公告號為CN103540638B的中國發明專利，公開了一種利用鰹魚加工副產物製備抗氧化肽的方法，其方法是：將富含蛋白的頭尾段等副產物與蒸煮液組合粉碎，然後經同步三相分離，獲得可直接酶解的蛋白源後，添加風味蛋白酶，在pH=6.5，50℃條件下酶解4h，酶解液再經超濾、活性炭吸附、脫鹽進行純化，並經噴霧乾燥製備肽粉，檢測其多種抗氧化活性，通過上述工藝獲得的肽粉對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基具有良好的清除率，其IC50 分別為3.55mg/ml、1.39mg/ml 和0.61mg/ml，是優異的抗氧化劑。該方法製備的肽粉為淡黃色、無苦味、微魚腥味，分子量（>90.1%）可控制為≤ 10000Da，多肽總蛋白質（以幹基計）為88.6%，灰分為7.2%。該方法製備的肽粉中含油脂等雜質，抗氧化肽純度不理想，沒有採取保護多肽活性的措施，有一部分多肽結構會被破壞，失去活性；授權公告號為CN103497985B的中國發明專利，公開了一種核桃粕抗氧化肽及其製備方法，該方法利用核桃粕蛋白，通過酶法水解，得到蛋白酶解液，再利用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜對其進行分離純化得到十四種新的抗氧化肽產品，並測定其胺基酸序列。該方法所製得的抗氧化肽具有很強的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都約為粗肽的4 倍，而且肽具有分子量小、可被人體直接吸收的特點，因此可以廣泛應用於食品、保健品及化妝品等領域。該方法操作繁瑣，製備成本高，不適合工廠化生產。
技術實現要素：
本發明提供一種提取率高，操作簡單，提取的雪蛤抗氧化肽純度高，多肽活性強，抗氧化性強的製備方法。
本發明為解決上述背景技術中提出的問題所採取的技術方案為：
1）預處理：將雪蛤用冰水清洗3~5次，將泥沙和雪蛤表面的汙漬清潔乾淨，在烘箱中乾燥，乾燥溫度為70~90℃，乾燥時間為40~60min，再用粉碎機粉碎，過200~300目篩。將雪蛤粉碎成粉末增大了比表面積，可以使脫脂和酶解反應更充分，也可縮短反應時間；
2）脫脂：在雪蛤粉中按照固液比1:2~1:5加入石油醚，並且石油醚中含有2~4%的丙酮和1~5%仲辛基酚聚氧乙烯醚，脫脂溫度為60~80℃，攪拌速率為300~400r/min，反應時間為20~40min，得到固液分離液，用布氏漏鬥進行抽濾，得到脫脂後的雪蛤粉。如果不進行脫脂的話，雪蛤粉中的油脂會和抗氧化鈦一起提取出來，影響抗氧化鈦的純度，降低產品的抗氧化性；石油醚只溶油脂不溶蛋白質，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，從而提高雪蛤粉的脫脂率；
3）酶解：在脫脂後的雪蛤粉中按固液比1:3~1:5加入蒸餾水，攪拌均勻後加入酶解劑和添加劑，水浴加熱，酶解溫度為40~50℃，pH為6.0~7.1，攪拌速率為300~400r/min，反應時間為1.5~3h。使用酶水解雪蛤蛋白具有溫和性，專一性和高效性的特點，酶解劑酶解後得到的多肽，空間結構不會被破壞，具有明顯的抗氧化性；添加劑能保護水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞；
4）滅酶：酶解結束後，對酶解液進行沸水浴加熱滅酶，滅酶時間為10~15min，，自然冷卻終止酶解反應，過濾；
5）抗氧化肽製備：經反向高效液相色譜得到多種雪蛤蛋白水解後的產物，通過清除DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子自由基實驗，挑選出抗氧化性強的幾種多肽，測定其分子量。根據測定的分量大小選擇適合的超濾膜進行超濾。真空低溫濃縮濾液後噴霧乾燥成多肽粉末，液體濃縮溫度為20~30℃，真空度為-5~5pa，反應時間為30~50min。得到的多肽粉末中抗氧化肽含量高，抗氧化性強，能有效地清除機體內的自由基和活性氧或者通過阻斷脂質過氧化過程中的自由基鏈式反應來預防因氧化而造成的機體損傷，經濟效益高。
酶解劑成份及其重量份為：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份風味蛋白酶，1~3份硫酸鎂，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氫鈣，0.5~1.5份維生素A、2~5份十二烷基磺酸鈉和和0.001~0.05份鯨蠟硬脂醇異壬酸酯。上述酶解劑酶解雪蛤蛋白條件溫和，不會破壞多肽活性；酶解效率高，縮短了製備時間。
添加劑成分及其重量份為2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯醯胺，0.5~2份脂肪醇硫酸鈉和3~6份山梨酸。上述添加劑能保護酶水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞。
與現有技術相比，本發明的優點在於：將石油醚作為雪蛤粉的脫脂劑，石油醚只溶油脂不溶蛋白質，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，從而提高雪蛤粉的脫脂率；酶解劑成份及其重量份為：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份風味蛋白酶，1~3份硫酸鎂，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氫鈣，0.5~1.5份維生素A和2~5份十二烷基磺酸鈉，上述酶解劑酶解雪蛤蛋白條件溫和，不會破壞多肽活性；酶解效率高，縮短了製備時間；添加劑成分及其重量份為2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯醯胺，0.5~2份脂肪醇硫酸鈉和3~6份山梨酸，上述添加劑能保護酶水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞。上述方法製備的雪蛤抗氧化肽提取率高，純度高，多肽活性強，抗氧化性強，操作簡單，適合工廠化生產。
具體實施例
下面通過實施例對本發明方案作進一步說明：
實施例1：
一種雪蛤抗氧化肽的製備方法，具體步驟為：
1）預處理：將雪蛤用冰水清洗3~5次，將泥沙和雪蛤表面的汙漬清潔乾淨，在烘箱中乾燥，乾燥溫度為70~90℃，乾燥時間為40~60min，再用粉碎機粉碎，過200~300目篩。將雪蛤粉碎成粉末增大了比表面積，可以使脫脂和酶解反應更充分，也可縮短反應時間；
2）脫脂：在雪蛤粉中按照固液比1:2~1:5加入石油醚，並且石油醚中含有2~4%的丙酮和1~5%仲辛基酚聚氧乙烯醚，脫脂溫度為60~80℃，攪拌速率為300~400r/min，反應時間為20~40min，得到固液分離液，用布氏漏鬥進行抽濾，得到脫脂後的雪蛤粉。如果不進行脫脂的話，雪蛤粉中的油脂會和抗氧化鈦一起提取出來，影響抗氧化鈦的純度，降低產品的抗氧化性；石油醚只溶油脂不溶蛋白質，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，從而提高雪蛤粉的脫脂率；
3） 酶解：在脫脂後的雪蛤粉中按固液比1:3~1:5加入蒸餾水，攪拌均勻後加入酶解劑和添加劑，水浴加熱，酶解溫度為40~50℃，pH為6.0~7.1，攪拌速率為300~400r/min，反應時間為1.5~3h。使用酶水解雪蛤蛋白具有溫和性，專一性和高效性的特點，酶解劑酶解後得到的多肽，空間結構不會被破壞，具有明顯的抗氧化性；添加劑能保護水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞；
4）滅酶：酶解結束後，對酶解液進行沸水浴加熱滅酶，滅酶時間為10~15min，，自然冷卻終止酶解反應，過濾；
5）抗氧化肽製備：經反向高效液相色譜得到多種雪蛤蛋白水解後的產物，通過清除DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子自由基實驗，挑選出抗氧化性強的幾種多肽，測定其分子量。根據測定的分量大小選擇適合的超濾膜進行超濾，將濾液先用10000~15000Da 的膜超濾，其透過液再用1000~2000Da 的膜超濾，取滯留液。真空低溫濃縮後噴霧乾燥成多肽粉末，液體濃縮溫度為20~30℃，真空度為-5~5pa，反應時間為30~50min。得到的多肽粉末中抗氧化肽含量高，抗氧化性強，能有效地清除機體內的自由基和活性氧或者通過阻斷脂質過氧化過程中的自由基鏈式反應來預防因氧化而造成的機體損傷，經濟效益高。
酶解劑成份及其重量份為：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份風味蛋白酶，1~3份硫酸鎂，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氫鈣，0.5~1.5份維生素A和2~5份十二烷基磺酸鈉。上述酶解劑酶解雪蛤蛋白條件溫和，不會破壞多肽活性；酶解效率高，縮短了製備時間。
添加劑成分及其重量份為2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯醯胺，0.5~2份脂肪醇硫酸鈉和3~6份山梨酸。上述添加劑能保護酶水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞。
實施例2：
一種雪蛤抗氧化肽的製備方法，最優選步驟為：
1）預處理：將雪蛤用冰水清洗4次，將泥沙和雪蛤表面的汙漬清潔乾淨，在烘箱中乾燥，乾燥溫度為80℃，乾燥時間為50min，再用粉碎機粉碎，過250目篩。將雪蛤粉碎成粉末增大了比表面積，可以使脫脂和酶解反應更充分，也可縮短反應時間；
2）脫脂：在雪蛤粉中按照固液比1:4加入石油醚，並且石油醚中含有3%的丙酮和4%仲辛基酚聚氧乙烯醚，脫脂溫度為80℃，攪拌速率為300r/min，反應時間為30min，得到固液分離液，用布氏漏鬥進行抽濾，得到脫脂後的雪蛤粉。如果不進行脫脂的話，雪蛤粉中的油脂會和抗氧化鈦一起提取出來，影響抗氧化鈦的純度，降低產品的抗氧化性；石油醚只溶油脂不溶蛋白質，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，從而提高雪蛤粉的脫脂率；
3）酶解：在脫脂後的雪蛤粉中按固液比1:3加入蒸餾水，攪拌均勻後加入酶解劑和添加劑，水浴加熱，酶解溫度為45℃，pH為6.5，攪拌速率為300r/min，反應時間為2h。使用酶水解雪蛤蛋白具有溫和性，專一性和高效性的特點，酶解劑酶解後得到的多肽，空間結構不會被破壞，具有明顯的抗氧化性；添加劑能保護水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞；
4）滅酶：酶解結束後，對酶解液進行沸水浴加熱滅酶，滅酶時間為15min，，自然冷卻終止酶解反應，過濾；
5）抗氧化肽製備：經反向高效液相色譜得到多種雪蛤蛋白水解後的產物，通過清除DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子自由基實驗，挑選出抗氧化性強的幾種多肽，測定其分子量。根據測定的分量大小選擇適合的超濾膜進行超濾，將濾液先用13000Da 的膜超濾，其透過液再用1200Da 的膜超濾，取滯留液。真空低溫濃縮後噴霧乾燥成多肽粉末，液體濃縮溫度為26℃，真空度為-2pa，反應時間為40min。得到的多肽粉末中抗氧化肽含量高，抗氧化性強，能有效地清除機體內的自由基和活性氧或者通過阻斷脂質過氧化過程中的自由基鏈式反應來預防因氧化而造成的機體損傷，經濟效益高。
酶解劑成份及其重量份為：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份風味蛋白酶，1~3份硫酸鎂，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氫鈣，0.5~1.5份維生素A、2~5份十二烷基磺酸鈉和0.001~0.05份鯨蠟硬脂醇異壬酸酯。上述酶解劑酶解雪蛤蛋白條件溫和，不會破壞多肽活性；酶解效率高，縮短了製備時間，可能是鯨蠟硬脂醇異壬酸酯對上述成份的作用產生了耦合，提高了終產物的活性，其機理尚不明確。添加劑成分及其重量份為2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯醯胺，0.5~2份脂肪醇硫酸鈉和3~6份山梨酸。上述添加劑能保護酶水解產生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金屬離子對其結構造成破壞。
以上實施方式僅用於說明本發明，而並非對本發明的限制，本領域的普通技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，還可以做出各種變化和變型。因此，所有等同的技術方案也屬於本發明的範疇，本發明的專利保護範圍應由權利要求限定。