一種檢測與補骨脂肝毒性有關的代謝產物的方法及其用途
2023-11-30 20:42:41
一種檢測與補骨脂肝毒性有關的代謝產物的方法及其用途
【專利摘要】本發明提供一種檢測與補骨脂肝毒性有關的代謝產物的方法。所述代謝產物為補骨脂素和/或異補骨脂素的二氫二醇代謝產物;所述方法包括補骨脂素和/或異補骨脂素的二氫二醇代謝產物的獲取,利用串聯質譜,以多反應監測法檢測所述代謝產物。本發明還提供所述方法在監測補骨脂素、異補骨脂素、含有補骨脂素和/或異補骨脂素的組合物致肝毒性中的應用,為安全用藥和藥物毒性的早期預警提供依據。
【專利說明】一種檢測與補骨脂肝毒性有關的代謝產物的方法及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物代謝和毒性研究領域,具體涉及補骨脂產生肝毒性的代謝產物的 檢測方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 肝臟作為最重要的藥物代謝器官,同時也是最主要的藥物毒性靶器官。在藥物使 用過程中,因藥物本身或其代謝產物、或由於特殊體質對藥物的超敏感性所導致的肝臟損 傷稱為藥物性肝損傷(Drug-induced Liver Injury, DILI),據世界衛生組織統計,DILI已 上升為全球死亡原因的第五位。越來越多的報導顯示許多常用中藥,甚至一些傳統補益藥 具有肝毒性,如補骨脂、吳茱萸、何首烏等。中藥所致肝損傷最初多以臨床病例發現為主,其 肝毒性發現晚,一旦發現,通常已經給患者造成不可逆轉的損傷。但是,迄今仍然缺乏早期 發現藥物的肝毒性的技術及評價指標。
[0003] 研究發現,當藥物在肝臟經CYP450酶代謝產生親電性活性代謝產物(Reactive Metabolites,RMs)後,由於其電子密度低,親核性強,能與肝細胞內大分子(如CYP450酶)、 細胞器膜(如線粒體膜)等相結合,造成細胞應激、細胞器膜功能損害,最終導致肝毒性發 生。Lammert et al.對207種常用口服藥物的統計發現,能生成RMs的藥物中約62-69%具 有肝毒性。可見活性代謝產物在DILI發生過程中起著重要作用,監測RMs的產生對藥物肝 毒性的早期發現具有重要意義。
[0004] 補骨脂為豆科植物補骨脂的乾燥成熟果實,主要有溫腎助陽,納氣,止瀉之功效。 補骨脂本身以及含有補骨脂的中成藥如壯骨關節丸均有肝毒性報導。譚沛等研究顯示 2. lg/kg補骨脂能使得鼠肝重肝係數顯著升高,同時大鼠血清中AST、ALT、ALP的值與對照 組比較亦有升高趨勢(《補骨脂灌胃30天對大鼠肝毒性的實驗研究》;譚沛,趙超,周昆,屈彩 芹,胡利民;《新疆中醫藥》,2010年第28卷第2期:11-13)。而在國家食品藥品監督管理局 公布的第16期藥品不良反應信息通報中,也警惕了壯骨關節丸引起的肝損害。
[0005] 在已經分離、鑑定的補骨脂化學成分中,由於補骨脂素和異補骨脂素(結構式分別 如I和II所示)具有呋喃環這一活性官能團,有可能在體內經肝臟代謝後產生活性代謝產 物(RMs)。
[0006]
【權利要求】
1. 一種檢測與補骨脂肝毒性有關的代謝產物的方法,其特徵在於:所述代謝產物為補 骨脂素和/或異補骨脂素的二氫二醇代謝產物;所述方法包括補骨脂素和/或異補骨脂素 的二氫二醇代謝產物的獲取,利用串聯質譜檢測所述代謝產物;具體包括如下步驟: 1) 血漿樣品中加入甲醇和乙腈組成的沉澱劑,所述血漿樣品和沉澱劑的體積比為 1:2-4,離心,得到上清液;或 將補骨脂素和/異補骨脂素,肝微粒體,還原型輔酶II混合,得到反應溶液;在所述反 應溶液中,使各物質的濃度滿足以下條件: 補骨脂素和/或異補骨脂素為20-50 μ M, 肝微粒體為l-2mg/ml, 補骨脂素和/或異補骨脂素:還原型輔酶11=50:1 ; 37°C孵育60-120min後加入終止液終止反應,渦旋,離心,得到上清液; 2) 取步驟1得到的上清液,氮氣吹乾,甲醇-水溶液復溶; 3) 步驟2得到復溶溶液離心,取上清液注射入液相色譜/串聯質譜儀,以多反應監測法 進行監測,[M+H]+母離子峰m/z221,碎片離子峰出現m/z203和m/zl75的,即是所述的代謝 產物。
2. 根據權利要求1所述的方法,其特徵在於:所述步驟2中,液相色譜條件為: 色譜柱:C18柱,規格2. 1_X 100mm,粒徑1. 7 μ m ; 流動相:A液0. 1%CH3C00H和B液100%ACN,梯度洗脫:0-12min,洗脫溶劑中B液的體積 百分比由5%增加到80%,餘量為A液;12-15min,洗脫溶劑中B液的體積百分比為5%,餘量 為A液。
3. 根據權利要求1或2所述的方法,其特徵在於:所述步驟2中,質譜條件為: 全掃描質譜條件:離子模式:ES+;毛細管電壓:3. 20kV;錐孔電壓:20.0V;源溫度: ll〇°C ;去溶劑溫度:350°C ;碰撞能量:2 ;蠕動泵流速:40μ L/min ;碰撞氣流速:0. 17mL/ Min; [M+H]+m/z221的子離子掃描質譜條件:離子模式:ES+ ;毛細管電壓:3. 20kV ;錐孔電 壓:20. 0V ;源溫度:11(TC ;去溶劑溫度:350°C ;碰撞能量:20 ;蠕動泵流速:40μ L/min ;碰 撞氣流速:〇. 17mL/Min; [M+H]+m/z221的多反應監測質譜條件:離子模式:ES+ ;監測離子對:221. 00>174. 90 ; 錐孔電壓:30. 0 ;碰撞能量:20. 0。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的方法,其特徵在於:所述步驟1中,所述反應溶 液中,補骨脂素和/或異補骨脂素的濃度為12. 5 μ M。
5. 根據權利要求1至4中任一項2所述的方法,其特徵在於:所述步驟1中,終止液選 自冰甲醇或冰乙腈;終止液的體積為所述反應溶液的兩倍。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的方法,其特徵在於:所述步驟1中,所述反應溶 液的渦旋時間為l〇s。
7. 根據權利要求1至6中任一項所述的方法,其特徵在於:所述步驟1中,所述血漿樣 品或所述反應溶液的離心條件為14000r/min,10-15min。
8. 根據權利要求1至7中任一項所述的方法,其特徵在於:所述步驟3中,復溶用溶液 中甲醇和水體積比為1:1。
9. 根據權利要求1至7中任一項所述的方法,其特徵在於:所述步驟3中,離心條件為 14000r/min,5min〇
10. 權利要求1至9中任一項所述的方法在檢測藥物與肝毒性有關的代謝產物中的應 用,所述藥物含有補骨脂、補骨脂素或異補骨脂素中的一種或幾種。
【文檔編號】G01N30/06GK104251890SQ201310264955
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2013年6月27日
【發明者】何新, 俸珊, 馬葉濤, 顏晶晶, 翟毅然 申請人:天津中醫藥大學