一種莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-12-01 02:05:21

專利名稱：一種莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
鈣離子信號在許多細胞活動，如細胞代謝、基因表達、細胞骨架動態變化、細胞周期、細胞死亡、信號傳導等過程中有重要作用。在植物細胞中，鈣離子的作用之一是作為第二信使，很多外界環境信號，如光、生物脅迫、非生物脅迫、植物激素等都會刺激胞液中Ca2+濃度的增加，從而引發鈣離子信號傳導。鈣離子信號傳導途徑中首先響應的即是鈣離子結合蛋白，其結合Ca2+以後會發生構想變化，使疏水面外露，從而激活或抑制其它蛋白的活性，從而引發信號傳導。高鹽、乾旱和低溫等非生物脅迫環境對作物的產量及生長發育有很大影響，因此，有關植物抗逆性基因的研究一直是植物學研究領域的熱點之一。莖瘤芥(Brassicajuncea var.tumida Tsen et Lee),又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續有生物學方面研究的報導，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。

對於莖瘤芥，目前還未見其鈣離子結合蛋白的序列以及基因功能的報導，本發明克隆了第一個莖瘤芥鈣離子結合蛋白，且經大量實驗研究表明，該蛋白具有提高植物抗逆性的作用，為植物抗逆性基因的研究和應用提供了新內容和新基礎。

發明內容
鑑於此，本發明的目的之一是提供莖瘤芥(英文:Brassica juncea var.tumidaTsen et Lee)來源的I丐離子結合蛋白(英文:calcium_binding protein)基因，將其命名為BjCBPl，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，該基因長627bp。本發明的目的之二是提供莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白BjCBPl，其胺基酸序列為SEQ ID N0.3所示,有208個胺基酸,且序列通過NCBI的保守結構域(conserved domains)檢測知具有4個EFh結構域。本發明的目的之三是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl的重組原核表達載體pET32a-BjCBPl，其由SEQ ID N0.1序列與原核表達載體pET_32a(+)構成。本發明的目的之四是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl，其由SEQ ID N0.1序列與植物表達載體pCAMBIA1302構成。本發明的目的之五是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl在提高植物耐逆境特性的應用，尤其是提高植物在高鹽條件的耐受力。本發明通過莖瘤芥轉錄組測序獲得序列片段SEQ ID N0.4，然後根據片段SEQ IDN0.4設計巢式引物並通過RACE方法擴增獲得莖瘤芥第一個鈣離子結合蛋白基因BjCBPl，基因編碼208個胺基酸，NCBI比對預測具有4個EF-hand結構域，屬於鈣離子結合蛋白家族成員；通過構建BjCBPl基因的原核表達載體進行原核表達和蛋白純化，發現BjCBPl能夠結合鈣離子，證明是鈣離子結合蛋白；通過構建BjCBPl基因植物表達載體，可直接用於農桿菌介導的遺傳轉化，創製耐逆境新種質，提高植物的逆境耐受力特性，尤其是耐鹽特性，可進行植物品種改良。


圖1為本發明BjCBPl基因編碼區序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為本發明原核表達純化後的BjCBPl蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖；圖3為本發明重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl的構建流程圖；圖4為本發明轉基因型擬南芥和野生型的BjCBPl基因表達水平檢測圖；圖5為本發明NaCl、Mannitol和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥種子發芽率結果圖；圖6為本發明NaCl、Mannitol和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥的生長情況攝影圖；圖7為本發明NaCl和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥的抗逆基因的表達水平檢測結果圖

圖8為本發明NaCl下野生型與轉基因型擬南芥的存活率統計圖。
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，並不局限於本發明的應用範圍。本發明不限於下述實施方式或實施例，凡不違背本發明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發明範圍之內。實驗例1:莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl的克隆I主要試劑:柱式小量植物總RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物技術有限公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；5』 -Full RACE Kit試劑盒、M-MLV反轉錄酶、Premix Ex Taq>DL2000DNA Marker、pMD19_T載體均購自大連寶生物工程有限公司。2實驗方法與步驟:BjCBPl基因序列片段SEQ ID N0.4的獲取:採用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，總RNA取小部分通過紫外分光光度計檢測0D260/0D280的比值為1.92，通過瓊脂糖凝膠電泳28S的亮度約是18S的2倍，說明RNA的純度高且無降解，達到實驗要求。將總RNA樣品送北京華大基因研究中心進行轉錄組測序(RNA-seq)，方法為用帶有Oligo (dT)的磁珠富集莖瘤芥總RNA中的mRNA,加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六鹼基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然後加入緩衝液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成第二條 cDNA 鏈,在經過 QiaQuick PCR 試劑盒(Qiagen公司)純化並加EB緩衝液洗脫之後做末端修復、加poly (A)並連接測序接頭，然後用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，最後進行PCR擴增，建好的測序文庫(200bp)用Illumina HiSeqTM2000進行測序。通過對測序結果進行注釋，選取可能的鈣離子結合蛋白片段序列SEQ ID N0.4，然後根據該片段序列進行基因全長的克隆以及功能分析。2.1BjCBPl基因5』端未知序列擴增2.1.1總RNA提取和反轉錄:採用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，然後取約IygS RNA通過5』-Full RACE Kit試劑盒方法去磷酸化、去帽子、加接頭，最後反轉錄獲得cDNA第一鏈。2.1.2引物設計:根據轉錄組測序得到的已知序列SEQ ID N0.4設計兩個反向巢式引物:BjCBPl-AOUT:5』 -TCGTCTCCAATAGCCGAGAAAACT-3』BjCBPl-AIN:5』 -TACCGTCTCCGTCGCAGTCCAC-3』2.1.3 巢式 PCR 擴增:首先為OUT擴增:以步驟2.1.1中cDNA第一鏈為模板，採用引物BjCBPl-AOUT和5，RACE Outer Primer (此引物為5』 -Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增，反應體系為:ddH207.4 μ L7Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下遊引物各0.8 μ L。PCR程序為:94°C 3min,94°C 30s,56°C 30s,72°C lmin，30 個循環；72°C延伸 lOmin。再做IN擴增:以OUT擴增的PCR產物為模板，採用引物BjCBPl-AIN和5』 RACEInner Primer (此引物也為5』-Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增。20 μ L反應體系為:ddH207.4 μ L7Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下遊引物各0.8 μ L。PCR程序為:94°C 3min，94°C 30s,58°C 30s,72°C lmin，32 個循環；72°C延伸 IOmin02.1.4電泳:將IN擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在450bp左右有一特異條帶。2.1.5TA克隆:將IN擴增做3個20 μ L反應體系，電泳後用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶並連接至PMD19-T載體，然後轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.1.6測序結果:測序獲得的序列的3』端序列與SEQ ID N0.4的5』端序列完全吻合，兩者成功拼接，說明成功獲得BjCBPl基因的5』端序列。2.2BJCBP1基因3』端未知序列擴增2.2.1總RNA提取和反轉錄:採用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，然後取約IygS RNA為模板，採用接頭引物5』 -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30ΜΝ-3』(N=A, G, C 或 T;M=A, G 或 C)(此接頭引物來自 Clontech 公司的SMART RACE cDNA Synthesis Kit試劑盒)以及M-MLV反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈。2.2.2引物設計:根據轉錄組測序得到的已知序列SEQ ID N0.4設計兩個正向巢式引物:BjCBPl-SOUT:5，-ATGCTCAGGGAGGTGGACT-3』 BjCBPl-SIN:5』 -GCTATTGGAGACGAGCGGTGC-3』2.2.3 巢式 PCR 擴增:首先為OUT擴增:以步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板，採用引物BjCBPl-SOUT和3』RACE Primer (此 引物為步驟2.2.1中接頭引物的前部分，即5』 -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3』)做 PCR 擴增，20 μ L 反應體系為:ddH207.4 μ L, Premix Ex TaqlOy L，模板 I μ L,上下遊引物各 0.8μ L。PCR 程序為:94 °C 3min,94°C 30s, 54 °C 30s, 72 °C 60s, 30 個循環；72°C延伸 lOmin。再做IN擴增:以OUT擴增的PCR產物為模板，採用引物BjCBPl-SIN和3』 RACEPrimer 做 PCR 擴增。20 μ L 反應體系為:ddH207.4 μ L，Premix Ex Taq 10yL，模板 lyL，上下遊引物各 0.8 μ L。PCR 程序為:94°C 3min,94°C 30s,59°C 30s,72°C 50s，32 個循環；72°C延伸IOrnin02.2.4電泳:將IN擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在300bp左右有一特異條帶。2.2.5TA克隆:將IN擴增做3個20 μ L反應體系，電泳後用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶並連接至PMD19-T載體，然後轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.2.6測序結果:測序獲得的序列的5』端序列與SEQ ID N0.4的3』端序列完全吻合，兩者成功拼接，說明成功獲得BjCBPl基因的3』端序列。2.3BJCBP1基因編碼區序列擴增2.3.1序列拼接:將2.1.6獲得的5』端序列、2.2.6獲得的3』端序列和已知序列SEQ ID N0.4進行拼接，得到BjCBPl基因全長序列SEQ ID N0.2，其全長905bp，編碼區即SEQ ID N0.1序列有627bp，5』端非編碼區有92bp，3』端非編碼區有186bp。為進一步驗證拼接的全長是否為真實的全長序列，於是從5』端和3』端的非編碼區設計引物進行PCR驗證。2.3.2引物設計 :根據2.3.1的序列SEQ ID N0.2，從兩端的非編碼區設計一對上下遊引物:上遊引物BjCBPl-F:5』 -TTCCCCATCAAAAATAAATCTT-3』下遊引物BjCBPl-R:5』 -CAAACGATACTCATAACCCTCA-3』2.3.3全長序列的PCR擴增:以步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板，採用引物BjCBPl-F和BjCBPl-R做PCR擴增。20 μ L反應體系為:ddH207.4 μ L,Premix Ex Taq 10 μ L,模板 I μ L，上下遊引物各 0.8 μ L。PCR 程序為:94°C 3min，94°C 30s,60°C 30s,72°C lmin,32個循環；72°C延伸IOmin。2.3.4電泳:將2.3.3擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶如圖1所示，M為MarkerIII, I為擴增條帶,可見在750bp左右有一特異條帶,與預期結果相符。2.3.5TA克隆:將2.3.3中的擴增做3個20 μ L反應體系，電泳後用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶並連接至PMD19-T載體，然後轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.3.6測序結果:測序獲得的序列與拼接序列的相應片段完全一致，說明成功獲得BjCBPl基因。BjCBPl基因編碼的蛋白含有208個胺基酸，如SEQ ID N0.3序列所示，在NCBI上進行保守結構域預測其含有4個EF-hand基序，EF-hand基序可能具有結合鈣離子的能力，因此預測BjCBPl蛋白能結合鈣離子，進一步的實驗驗證見實驗例2。實驗例2:莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl在大腸桿菌BL21 (DE3)中的原核表達及特性檢測1、主要試劑:His-Tag蛋白純化試劑盒購自北京康為試劑生物科技有限公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶BamH I和HindmiI購自大連寶生物工程有限公司；含原核表達質粒pET_32a(+)的DH5a菌種、大腸桿菌菌株由本實驗室保存。2、重組原核表達載體pET32a_BjCBPl的構建2.1引物設計:根據BjCBPl基因的編碼區序列SEQ ID N0.3設計上下遊引物，並分別引入酶切位點BamH I (GGATCC)和HindIII (AAGCTT)序列，引物為:上遊引物pET-F:5』 -CGGATCCATGAAATTCGCAAAACTG-3』下遊引物pET-R: 5，-CAAGCTTTCATCGCTGGAGATCCA-3 』2.2PCR擴增:以實驗例I中步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板，引物ρΕΤ-F和pET_R做PCR擴增:體系為ddH207.4 μ L, Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下遊引物各0.8 μ L。PCR 程序為:94°C 3min，94°C 30s,60°C 30s,72°C lmin，32 個循環；72°C延伸 IOmin02.3電泳:將2.2擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在630bp左右有一特異條
帶，與預期結果相符。2.4TA克隆 獲得重組載體pMD-T-BjCBPl:將2.2中的擴增做3個20 μ L反應體系，電泳後用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶並連接至pMD19-T載體得重組載體pMD-T-BjCBPl，然後轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經PCR篩選，將含重組載體PMD-T-BjCBPl的陽性DH5a菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.5測序結果:與預期結果完全一致。2.6重組原核表達載體pET32a_BjCBPl的構建:將2.4含重組載體pMD-T-BjCBPl的陽性DH5ci菌液擴大培養，並採用普通質粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質粒pMD-T-BjCBPl ;將實驗室保存的含原核表達質粒pET-32a(+)的DH5 α菌種擴大培養，並用同樣的方法提取質粒pET-32a(+)。用BamH I和Hindm雙酶切質粒pMD-T-BjCBPl和pET-32a(+)，參照酶的說明書兩種質粒各做2個50 μ L酶切體系。酶切後電泳，並切下pMD-T-BjCBPl質粒的小片段和pET-32a(+)質粒的大片段，利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為:小片段7 μ L，大片段I μ L，T4DNA連接酶1μ ，10ΧΤ40ΝΑ Ligase Bufferl μ L)至少24小時，然後利用熱擊法轉化大腸桿菌感受態DH5 a ；PCR篩選陽性克隆，再進行測序驗證，得到序列完全正確的重組原核表達載體pET32a-BjCBPl及含該表達載體的大腸桿菌。2.7pET32a-BjCBPl重組原核表達載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株及進行誘導表達、純化蛋白和蛋白特性檢測:從2.6中含pET32a-BjCBPl載體的菌株中提取重組質粒，用熱激法轉化BL21(DE3)菌株感受態，PCR篩選得到陽性克隆。將此陽性克隆在含50mg/L氨苄青黴素的LB液體培養基中37°C、180rpm轉速振搖培養至菌液濃度0D600為0.4-0.8，然後加入IPTG (中文名:異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷；終濃度為ImM)誘導5小時使表達BjCBPl蛋白。然後根據His-Tag蛋白純化試劑盒說明書純化獲得BjCBPl蛋白。將獲得的BjCBPl蛋白分別於含IOmM鈣離子和IOmM EGTA金屬離子螯合劑條件下進行的12%聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，電泳結果如圖2所示，BjCBPl蛋白在含Ca2+的條件下電泳的遷移速率更快，說明BjCBPl蛋白能夠結合Ca2+，是鈣離子結合蛋白。實驗例3:莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl 的構建I主要試劑:普通質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶BamH 1、Bgl II和BstE II購自大連寶生物工程有限公司；含質粒pCAMBIA1302的囷種由本實驗室保存。2重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl的構建2.1引物設計:根據BjCBPl基因的編碼區序列SEQ ID N0.3設計上下遊引物，並分別引入酶切位點BamH I (GGATCC)和BstE II (GGTCACC)序列，引物為:上遊引物BjCBPl-Bam:5』 -GGATCCATGAAATTCGCAAAACTG-3，下遊引物BjCBPl-Bst:5』 -GGTCACCTCATCGCTGGAGATCCA-3』2.2PCR擴增:以實驗例I中步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板，引物BjCBPl-Bam和 BjCBPl-Bst 做 PCR 擴增:體系為 ddH207.4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L,模板 I μ L,上下遊引物各 0.8 μ L。PCR 程序為:94°C 3min，94°C 30s,60°C 30s,72°C lmin，32 個循環；72°C延伸 IOmin02.3電泳:將2.2擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在630bp左右有一特異條
帶，與預期結果相符。2.4TA克隆獲得重組載體pMD19-T-B jCBPl:將2.2中的擴增做3個20 μ L反應體系，電泳後用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶並連接至pMD19-T載體得重組載體pMD19-T-BjCBPl，然後轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將含重組載體PMD19-T-BJCBP1的陽性DH5a菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.5測序結果:與預期結果完全一致。2.6重組植物 表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl的構建:構建方法如圖3所示，將
2.4含重組載體pMD19-T-BjCBPl的陽性DH5 α菌液擴大培養，並採用普通質粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質粒pMD19-T-BjCBPl ;將實驗室保存的含有植物表達質粒PCAMBIA1302的DH5 α菌種擴大培養，並用同樣的方法提取質粒pCAMBIA1302。用BamH I和 BstE II 雙酶切質粒 pMD19-T-BjCBPl、用 Bgl II (Bgl II 與 BamH I 為同尾酶)和 BstEII雙酶切質粒PCAMBIA1302，參照酶的說明書兩種質粒各做2個50 μ L酶切體系。酶切後電泳，並切下pMD19-T-BjCBPl質粒的小片段和pCAMBIA1302質粒的大片段，利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為:小片段7 μ L，大片段I μ L，T4DNA連接酶I μ L，10XT4DNA Ligase Bufferl μ L)至少24小時，然後利用熱擊法轉化大腸桿菌感受態DH5 a ；PCR篩選陽性克隆，再進行測序驗證，得到序列完全正確的重組表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl及含該重組表達載體的大腸桿菌。2.7pCAMBIA1302-BjCBPl 重組質粒轉化農桿菌:從 2.6 中含 pCAMBIA1302_BjCBPl載體的菌株中提取重組質粒，用液氮冷激法轉化根瘤農桿菌GV3101，方法為:①200 μ L根瘤農桿菌GV3101感受態細胞中加入2μ g (5-10 μ L )重組質粒DNA，冰浴5min，然後轉至液氮中冷凍8min 迅速與37°C水浴中溫浴5min後，加入800 μ L LB液體培養基③28°C、250rpm 預培養 4_5h，然後塗布於含有 Kan (50mg/l)、Gent (50mg/l)的 LB 平板，28°C培育24-28小時後可出現菌落；④挑取菌體做菌體PCR鑑定，確定正確後保存於_70°C，即為植物遺傳轉化的工程菌株。實施例3:擬南芥的遺傳轉化I主要試劑:螢光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq Kit購自大連寶生物工程有限公司；柱式小量植物總RNA抽提試劑盒W7021，購自上海華舜生物技術有限公司；DNA酶購自Promega公司。2擬南芥的培養及農桿菌侵染實驗①取野生型擬南芥種子，用75%乙醇消毒Imin後無菌水清洗；再用5%NaC10滅菌IOmin,無菌水清洗5次，去盡NaClO殘留液。加一定量無菌水，於4°C條件下春化3_4天；②將春化3-4天的擬南芥種子在MS空白培養基上光照培養7天，待長出幼苗，移栽至蛭石培養基(蛭石:營養土:珍珠巖=3:1:1)，1/2MS液體培養基澆灌；③待植物培養至初生花序10-15cm，次生花序剛剛形成花芽狀時，去除初生花序；培養至可進行侵染實驗；④將實驗例2步驟2.7中製備好的已轉化pCAMBIA1302-BjCBPl質粒的農桿菌菌液擴大培養，即在轉化前I天晚上轉入大瓶過夜培養；至菌液濃度為0D600=2.0 ;離心，棄上清，將農桿菌沉澱懸浮於約3倍體積的滲透培養液中，使0D600在0.8左右；⑤將植物的地上部分浸入農桿菌懸浮液中侵染5分鐘；用保鮮膜將侵染過的植物(T0代植物)罩起來以保持溼度，置培養箱中黑暗培養12小時後正常條件培養；2-3天揭去保鮮膜，7天後可澆水；並定期侵染幾次；⑥繼續培養至植物成熟，收種子(Tl代種子)。MS培養基由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質、激素等按一定比例組成。MS培養基作為目前使用最廣的離體細胞培養基，由於其中無機鹽濃度較高，為外植體的生長提供了足夠的礦質營養並 能使愈傷組織加速生長。為便於溶液配製及減小誤差，先按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質配製一定體積的母液。待用時再按一定比例稀釋混合。3擬南芥轉基因純合體的篩選Tl代種子經消毒、滅菌和春化處理後均勻地塗布在含有潮黴素(25mg/L)抗生素的MS培養基上，至人工氣候培養箱中培養，觀察幼苗(Tl代植物)的生長狀況。10-12天後明顯可以觀察到非轉基因擬南芥只能長出2片子葉、沒有真葉、根非常短，而轉基因擬南芥長出2-4片真葉、根長，於是將轉基因苗移栽至蛭石培養基中，成熟後分別收取各個轉基因苗種子(T2代種子λΤ2代種子經消毒、滅菌和春化處理後均勻地塗布在含有潮黴素(25mg/L)抗生素的MS培養基上，抗性苗與非抗性苗的數量比約為3:1的，再將抗性苗(T2代植物)移栽至蛭石培養基中，成熟後分別收取各個轉基因苗種子(T3代種子)。取各個T2代植物的小部分T3代種子，經消毒、滅菌和春化處理後均勻地塗布在含有潮黴素(25mg/L)抗生素的MS培養基上，若全為抗性苗的即為純合體，則相應的T3代種子可以用於後續實驗，相應的T2代植物為純合體。隨機選取純合體T2代植物6株，分別命名為TL1、TL2、TL3、TL4、TL5和TL6，採用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取各株植物葉片的總RNA，經DNA酶去除DNA，根據定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq Kit說明書操作檢測各個轉基因擬南芥中的BjCBPl基因的表達量，BjCBPl基因的引物為:上遊引物:5』 -CGTTAGAGGAGTGCGAGCGTATG-3 』下遊引物:5』 -CGAGAACTCAGTGAAGCACACGAAT-3，，內參基因為擬南介18S基因,其引物為:上遊引物:5』-CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3』下遊引物:5』 -CGAACACTTCACCGGATCATT-3 』，
定量PCR結果如圖4所示，橫坐標WT表示野生型擬南芥，TLl至TL6表示隨機選取的6株轉基因擬南芥植株，縱坐標表示BjCBPl基因的相對表達量，知TL3和TL4表達量較高，於是選取TL3和TL4的T3代種子用於後續實驗，TL3和TL4的T3代種子及其發芽後生長的植株均簡稱為轉基因TL3和轉基因TL4。實驗例4:轉BjCBPl基因擬南芥的逆境反應實驗將轉基因TL3和TL4種子和野生型種子經消毒、滅菌和春化處理後均勻地塗布在MS培養基上，至人工氣候培養箱中培養，觀察發芽率情況和植物生長情況，轉基因型和野生型沒有明顯差異。將轉基因TL3和TL4種子和野生型種子經消毒、滅菌和春化處理後分別均勻地塗布在含IOOmM NaCl、250mM甘露醇(英文mannitol)或0.5μΜ脫落酸(簡稱ABA)的MS培養基上，觀察發芽率情況和植物生長情況。發芽率情況如圖5所示，A為在0.5 μ MABA條件下的從0-9天發芽率統計，B為在0.5 μ M ABA條件下的第5天的發芽率圖片，C為在IOOmM NaCl條件下的從0_9天發芽率統計，C為在250mM mannitol條件下的從0_9天發芽率統計，A、C、D中黑方塊、黑圓、白圓分別代表野生型、轉基因TL3、轉基因TL4。發芽率實驗圖5顯示轉基因型種子在2-6天比野生型發芽率明顯低，即轉基因型種子發芽率對逆境條件(NaCl、mannitol和ABA)具有超過敏現象，說明BjCBPl基因在植物逆境條件生長時起重要作用。另外，當轉基因TL3和TL4種子和野生型種子在MS培養基上發芽3天後取部分轉移至含IOOmM NaCl、250mM甘露醇(英文mannitol)或0.5 μ M脫落酸(簡稱ABA)的MS培養基上繼續生長，10天後觀察植物生長情況，如圖6所示，轉基因型TL3、TL4和野生型在正常的MS培養基上生長無明顯區別，但轉基因型在逆境條件下生長比野生型明顯受抑制，即轉基因型種子發芽後生長對逆境條件(NaCl、mannitol和ABA)也具有超過敏現象，再次說明BjCBPl基因在植物逆境條件生長時起重要作用。實施例4:轉BjCBPl基因擬南芥的抗逆境實驗I轉BjCBPl基因擬南芥中抗逆基因RD29B和RD22表達檢測擬南芥RD29B和RD22基因為脅迫誘導基因，具有提高植物逆境耐受力的作用。將野生型和轉基因型種子於MS培養基發芽並長出4片真葉時移栽至蛭石中生長，當植物有3周大時，對植物全株噴灑水、NaCl (200mM)水溶液或ABA (10 μ Μ)水溶液，3小時後，提取各自的總RNA，螢光定量PCR檢測抗逆基因RD29B和RD22的表達情況。RD29B基因的引物為:上遊引物:5』 -AAGATTTTCCGACAAGAGGTGAT-3 』下遊引物:5』 -TTGGGACGAGATAGTTCTGGTGA-3 』，RD22基因的引物為:上遊引物:5，-GTGGCTAAGAAGAACGCACCGAT-3』下遊引物:5』 -TGGCATACCGCAACTGCTTTAG-3，，內參基因仍為擬南芥18S基因,其引物為:上遊引物:5』 - CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3，下遊引物:5』 -CGAACACTTCACCGGATCATT-3 』，定量PCR結果如圖7所示，橫坐標CK為對照，即噴灑水的條件，縱坐標為抗逆基因的相對表達水平，結果表明抗逆基因RD29B和RD22在對照條件下，野生型和轉基因型的表達水平基本相同，但在逆境條件時，轉基因型中RD29B和RD22基因的表達均比野生型顯著升高。由此說明逆境條件下，BjCBPl基因具有提高植物耐逆境生長的能力。2鹽脅迫下BjCBPl基因對擬南芥的存活率的影響將野生型WT種子和轉基因型種子TL3、TL4經消毒、滅菌和春化處理後均勻地塗布在含300mM的NaCl的MS培養基上生長2周後移栽至無鹽脅迫的蛭石中繼續培養使恢復生長，12天後觀察仍然存活的植株數量(植株全部白化被認為死亡)。結果如圖8所示，高鹽脅迫生長2周後於正常狀態下培養12天後，野生型植株死亡率高，存活率不到10%，而轉基因型的存活率達到30%以上，具有顯著性差異。說明BjCBPl基因有助於植物在高鹽下的生長，即提高了植物的抗逆性。綜上所述，BjCBPl基因具有提高植物抗逆性的作用，促進植物在逆境下的適應能力和生長能力。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當 中。
權利要求
1.莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl，其特徵在於，其基因序列為SEQID N0.1。
2.莖瘤芥鈣離子結合蛋白BjCBPl，其特徵在於:其胺基酸序列為SEQID N0.3所示。
3.莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl的重組原核表達載體pET32a-BjCBPl，其特徵在於:由權利要求1所述SEQ ID N0.1序列與原核表達載體pET-32a(+)構成。
4.莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBPl，其特徵在於:由權利要求1所述SEQ ID N0.1序列與植物表達載體pCAMBIA1302構成。
5.莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl在提高植物耐逆境特性的應用。
6.根據權利要求5所述的莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBPl在提高植物耐逆境特性的應用，其特徵在於，所述 耐逆境特性為耐鹽特性。
全文摘要
本發明公開了莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其基因與應用。本發明鈣離子結合蛋白基因BjCBP1，其鹼基序列如SEQ ID NO.1；本發明所構建的重組原核表達載體pET32a-BjCBP1是由SEQ ID NO.1序列和原核表達載體pET-32a(+)構成，重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBP1是由SEQ ID NO.1序列和植物表達載體pCAMBIA1302構成；所述植物表達載體用於植物遺傳轉化，BjCBP1基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達，大量合成BjCBP1蛋白，從而提高植物耐逆境特性。
文檔編號C12N15/29GK103243108SQ20131016896
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月6日 優先權日2013年5月6日
發明者向瀏欣, 蔡應繁, 劉吉軍, 王小豔, 付於銀 申請人:重慶郵電大學