一種分離的核苷酸分子及在布尼亞病毒檢測中的應用的製作方法
2023-12-01 00:16:11 2
專利名稱：一種分離的核苷酸分子及在布尼亞病毒檢測中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種分離的核苷酸分子及在布尼亞病毒檢測中的應用，以及布尼亞病毒的檢測試劑盒。
背景技術：
布尼亞病毒科(Bunyaviridae)具有300多個病毒成員，分為5個屬，包括布尼亞 (Orthobunyavirus)(Hantavirus) >(Nairovirus) > S^f^f
毒屬(Wilebovirus)和番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)。布尼亞科病毒粒子通常為具有包膜的球形，直徑約80 120nm，表面具有長5 IOnm的糖蛋白突起，這些突起被包埋在厚度約為5nm的雙層脂質膜中。該科病毒的所有成員為三節段基因組，分別是大(Large, L)、中(Medium, Μ)、小(Small, S)3種反義或雙義線形ssRNA，編碼4種結構蛋白，包括兩種外膜糖蛋白(&i/Gc)、一種核蛋白(N)和一種超大的 RNA多聚酶(L)。每個基因組RNA片段的末端核苷酸鹼基配對，形成非共價閉環RNA。儘管布尼亞科病毒5個成員屬之間在結構上有很多相似的地方，但它們之間仍存在很多差異該科4個屬主要感染脊椎動物和節肢動物，通常對脊椎動物寄主是溶細胞性的，而對無脊椎動物僅引起不顯著的細胞病理變化。自然感染見於許多脊椎動物和節肢動物(蚊、蜱、白蛉等)，可感染小鼠，並能在一些哺乳類、鳥類和蚊細胞培養中生長；對人可引起類似流感或登革熱的疾病、出血熱(立夫特谷熱和克裡米亞一剛果出血熱等)及腦炎 (加利福尼亞腦炎)等。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒3種傳播類型。有些病毒在其節肢動物媒介中，可經卵、交配或胚胎期傳播。番茄斑萎病毒屬是布尼亞科病毒中唯一能感染植物的一個屬，它通過薊馬的繁殖傳播，其寄主範圍很廣，可感染80個科，1000多種植物.引起植物廣泛褪綠、壞死、矮化和耳突等症狀。2009年5月至2010年9月，湖北、河南等地醫院陸續收治多例疑似人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis, HGA)的感染性病例，病人的臨床表現主要為急性發熱，伴有不同程度的乏力、頭痛、肌肉酸痛、噁心、嘔吐、腹瀉等，部分病例可出現牙齦出血、消化道出血及瀰漫性血管內出血。實驗室檢查主要是白細胞減少、血小板減少及不同程度的肝臟腎臟等多器官功能損害，部分重症患者救治無效死亡。這類病例均以疑似人粒細胞無形體病作為臨床診斷，但實驗室檢測人粒細胞無形體均為陰性，同時對漢坦病毒等能引起類似臨床症狀的已知病原檢測亦均為陰性。發明人利用Vero E6細胞從採自病人的血液樣本中成功地分離出了一種新的病毒。對分離的病毒進行透射電子顯微鏡觀察顯示病毒顆粒呈球形，直徑約lOOnm，外有脂質包膜，表面有棘突。基因組包含三個單股負鏈RNA片段(L、M*Q。其中，L片段全長為 6368個核苷酸，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶(長度為2084個胺基酸)。 病毒基因組末端序列高度保守，通過對該分離病毒基因組序列的分析，發現其符合布尼亞病毒科的基因組特徵。根據基因組序列所構建的系統發生樹也表明新病毒屬於布尼亞病毒科，與該科中的白蛉病毒屬最接近。
由於上述感染疫情在我國許多地方陸續出現，並且對人們的生命健康構成嚴重的威脅。但目前臨床醫生、各級疾病預防控制中心人員及相關微生物領域的技術人員對該病毒還缺乏一個基本的了解，對於由該病毒感染引起的疾病缺乏診斷和檢測方法，以及與其它微生物感染鑑別診斷的信息，這對於該病毒感染的預防與控制是極為不利的。為此，本發明在發現該病毒的基礎上，旨在尋求一種對該新發現病毒的快速、特異、敏感的核酸檢測方法。
發明內容
基於以上目的，本發明人對新分離的病毒進行了全基因組序列的測定，並對該病毒基因組進行了研究，發現了該病毒的一個L片段，其長度為6368bp，與M和S片段相比，具有更高的保守性，可以有效地用於這種新型布尼亞病毒感染的檢測。通過對L片段進行反轉錄多聚酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，獲得並分離了以該病毒L片段為模板的cDNA片段，基於該cDNA片段，本發明提供了 一種分離的核苷酸分子，其序列選自1)核苷酸序歹|J SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 24 中的任何一種；2)與核苷酸序列SEQ ID NO :1-SEQ ID NO J4中的任何一種至少95%同源性的核苷酸序列；3)在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 24中任何一種雜交的核苷酸序列；4)或者與1)-3)任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。上文所述的「互補」，是指核苷酸中兩條單鏈的鹼基間主要通過氫鍵形成的一種特定的聯繫，即鹼基的配對關係。主要互補方式有腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)配對、鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)配對。上文所述的嚴謹條件是指雜交反應體系中避開非同源性或部分同源性的核酸順序形成雜交體所需要條件的嚴格程度。一般是反應溫度高、離子強度低會增加反應的嚴謹性(有利於單鏈形成時嚴謹性高)，它適合於鹼基配對好、鹼基順序完全同源的核酸雜交反應，若反應溫度低、離子強度高稱雜交反應的低嚴謹性，它適用於鹼基配對差、鹼基順序不完全同源的核酸反應。本發明所述嚴謹條件為，在0. 5M磷酸鈉，7%SDS，65°C的條件下進行雜交，再用0. 2XSSC，1% SDS，在65°C洗一次或多次。本發明還提供了含有上述核苷酸分子的序列的核苷酸分子。對於含有上述核苷酸序列的核苷酸分子，可以包括在L片段的cDNA片段中對上述核苷酸序列在5』端和/或3』 端進行延長獲得的序列，也可以包括對上述核苷酸序列的5』端和/或3』端添加其它序列。 例如限制性酶切位點而獲得的序列。在一個優選的技術方案中，所述核苷酸分子序列為SEQ ID NO 25所示，即衍生於 L片段的cDNA。上文所述的SEQ ID NO :3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24，是作為 PCR 下遊引
物序列顯示的，其與SEQ ID NO :25所示出的核苷酸序列為反向互補關係，即一條核苷酸序列的5』端與另一條核苷酸序列的3』端按照上述鹼基配對原則互補。本發明還提供了所述的核苷酸分子作為多聚酶鏈反應(PolymeraseChainReaction, PCR)引物的應用。在一個優選的技術方案中，所述PCR的上下遊引物組合分別選自1)SEQ ID NO :1 禾口 3 ；2) SEQ ID NO 2 禾口 4 ；3) SEQ ID NO :5 和 7 ；4) SEQ ID NO 6 禾口 8 ；5) SEQ ID NO 9 禾口 11 ；6) SEQ ID NO 10 和 12 ；7) SEQ ID NO 13 和 15 ；8) SEQ ID NO 14 和 16 ；9) SEQ ID NO 17 和 19 ；10) SEQ ID NO 18 和 20 ；11) SEQ ID NO :21 和 23 ；12) SEQ ID NO 22 和 24。在一個優選的技術方案中，所述PCR為巢式RT-PCR，所述反應所需的引物組合分別選自1)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO 1 和 3，第二輪巢式 PCR 引物 SEQID NO :2 和 4 ；2)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO 5 和 7，第二輪巢式 PCR 引物 SEQID NO :6 和 8 ；3)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO :9 和 11，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO: 10 禾口 12 ；4)第一輪 PT-PCR 引物 SEQ ID NO 13 和 15，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO 14 禾口 16 ；5)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO 17 禾口 19，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO 18 禾口 20 ；6)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO :21 禾口 23，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO 22 和24。本發明還提供了一種檢測新型布尼亞病毒的巢式RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包括1)作為RT-PCR和巢式PCR引物的權利要求1或2所述的核苷酸分子；2)常規的RT-PCR和PCR緩衝液；3)反轉錄酶和Taq DNA聚合酶。本發明還提供了含有前述核苷酸分子的核苷酸診斷探針分子。在一個優選的技術方案中，所述探針分子的核苷酸序列如SEQ ID N0J6所示。在另一個優選的技術方案中，所述探針分子的核苷酸序列如SEQ IDNO 27所示。根據本發明提供的核苷酸設計出引物，再進行巢式RT-PCR檢測，可以快速、特異、 敏感地檢測這種新型布尼亞病毒。本發明根據獲得的新布尼亞病毒基因組L片段序列， 利用 NCBI 提供的引物設計程序 Primer-BLAST (http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/tools/ primer-blast)，設計特異性引物，並將獲得的特異性引物在NCBI資料庫中進行比對分析， 以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優化後的引物序列。本發明中對臨床樣品的檢測採用巢式RT-PCR，與普通RT-PCR相比，巢式RT-PCR有幾個優點1、 克服了單次擴增「平臺期效應」的限制，使擴增倍數提高，從而極大的提高了 PCR的敏感性， 有利於樣品檢測靈敏度的提高；2、由於模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續放大進行的可能性，保證了反應的特異性；3、內側引物擴增的模板是外側引物擴增的產物，第二階段反應能否進行，也是對第一階段反應正確性的鑑定，因此可以保證整個反應的準確性及可行性。4、檢測快速，一般在幾小時之內就可以獲得檢測結果，明顯快於其它的病毒學檢測方法。需要注意的是進行巢式RT-PCR時避免樣品的汙染。
圖1臨床樣品的PCR檢測結果1 ；圖2臨床樣品的PCR檢測結果2 ；圖3臨床樣品的PCR檢測結果3 ；圖4臨床樣品的PCR檢測結果4 ；圖5臨床樣品經PCR擴增後的核酸雜交檢測結果1 ；圖6臨床樣品經PCR擴增後的核酸雜交檢測結果2。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1巢式RT-PCR檢測方法(一 )本發明中涉及的巢式RT-PCR引物及引物序列。1、第一套巢式RR-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 1 :GTGGAGAATGGGCTGTCTCTT ；SEQ ID NO 2 :GGCCTGTACGACCAAATCTAC ；SEQ ID NO 3 CCACATTGCCTAGCGAGACAT ；SEQ ID NO 4 :AGCCTGAGTCGGTCTTGATGT。SEQ ID NO :1-4 分另Ij 位於 SEQ ID NO 25 的第 50-70、80_100、1128-1148、 1050-1070個核苷酸位置上。第一輪RT-PCR採用引物SEQ ID NO 1和3，產物的預期大小為1099bp ；第二輪巢式PCR採用引物SEQ ID NO :2和4，產物的預期大小為991bp。2、第二套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 5 :GGGCAAAGTGCCTTCTAGATG ；SEQ ID NO 6 :CATTGCCATCTCTGATGATCC ；SEQ ID NO 7 CTTAGACTTGTCCTCCAGACT ；SEQ IDNO 8 :CAGCTTCTCTCTCCAGAAAGC。SEQ ID NO :5_8 分別位於 SEQ ID NO 25 的第 1110-1130、1183-1203、1970-1990、 1877-1897個核苷酸位置上。
第一輪RR-PCR採用引物SEQ ID NO 5和7，產物的預期大小為881bp ；第二輪巢式PCR採用引物SEQ ID NO :6和8，產物的預期大小為7Mbp。3、第三套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 9 :CTCAGCCTTTCAGCCTAATCC ；SEQ ID NO 10 :GAACATTCCATGCCATCTCAG ；SEQ ID NO: 11 :CCATGAGACATCCCTATTACC ；SEQ ID NO 12 :GTGAGCTAAAAACCTTAGGTC。SEQ ID NO :9-12 分別位於 SEQ ID NO :25 的第 2160-2180、2208-2228、3188_3208、 3101-3121個核苷酸位置上。第一輪RT-PCR採用引物SEQ ID NO 9和11，產物的預期大小為1049bp ；第二輪巢式PCR採用引物SEQ ID N0:10和12，產物的預期大小為914bp。4、第四套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 13 :GGTAATAGGGATGTCTCATGG ；SEQ ID NO 14 :GGAATGATGCAGGGCATACTG ；SEQ ID NO 15 CAGTCTTCAGGAAGGCCCATC ；SEQ ID NO 16 :ACAGAGTGGCTGAGAGTTCCT。SEQ ID NO :13-16 分另丨」位於 SEQ ID NO 25 的第 3188-3208、3245_3洸5、 4078-4098,4009-4029個核苷酸位置上。第一輪RT-PCR採用引物SEQ ID NO: 13和15，產物的預期大小為91 Ibp ；第二輪巢式PCR採用引物SEQ ID NO :14和16，產物的預期大小為7^bp。5、第五套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 17 :GGAACTCTCAGCCACTCTGTT ；SEQ ID NO 18 TGAACAGGATGGGCCTTCCTG ；SEQ ID NO 19 :GCCTCTATGATCATCTCCAGC ；SEQ ID NO 20 :GTGTATGGGCCATTCAAGACC。SEQ ID NO :17-20 分別位於 SEQ ID NO 25 的第 4010-4130、4071_4091、 4954-4974,4921-4941個核苷酸位置上。第一輪RT-PCR採用引物SEQ ID NO 17和19，產物的預期大小為93^p ；第二輪巢式PCR採用引物SEQ ID NO 18和20，產物的預期大小為904bp。6、第六套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 21 :GATGATCATAGAGGCCTTCTC ；SEQ ID NO 22 :ACTCTAGGAGGCTTCAGCAAG ；SEQ ID NO 23 CCAGTCACCCACAGACACATT ；SEQ ID NO 24 :TCAGCAGACCACAAGATAGGT。SEQ ID NO :21-24 分別位於 SEQ ID NO 25 的第 4960_4980、5111_5131、 6298-6231,5971-5991個核苷酸位置上。第一輪RT-PCR採用引物SEQ ID NO 21和23，產物的預期大小為1359bp ；第二輪巢式PCR採用引物SEQ ID NO :22和M，產物的預期大小為881bp。(二)本發明中巢式RT-PCR使用和涉及的主要試劑。
1、反轉錄酶PrimeScript CTase及Buffer (PrimeScript One StepRT-PCR Kit Ver. 2)，購自寶生物工程(大連)有限公司。該試劑盒為一步法RT-PCR (One step RT-PCR) 試劑盒，即試劑盒含有將RNA反轉錄成cDNA的反轉錄酶及進行後續PCR反應的Taq DNA聚合酶，可以在一個反應體系中先後完成反轉錄和PCR反應。2、DNA聚合酶La Taq DNA polymerase及Buffer，購自寶生物工程(大連)有限公司。3、dNTPS，購自寶生物工程(大連)有限公司。4、無 DNA 酶和 RNA 酶超純水(UltraRire DNase/RNase-FreeDistilled Water)， 購自美國hvitrogen公司。5、樣品 RNA提取試劑盒 ^lIAamp MinElute Virus Spin Kit)，購自德國 Qiagen 公司。6、PCR 產物膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)，購自德國 Qiagen 公司。7、？0 產物克隆試劑盒(卩— 201 Vector)，購自寶生物工程(大連)有限公司。8.DL2000DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司。其餘試劑均為市售分析純產品。(三)本發明實驗中使用和涉及的主要儀器。PCR 儀為 Sensoquest Labcycler,德國 Sensoquest 產品；離心機為 Eppendorf 5415D，德國 Eppendorf 產品；電泳設備為北京君意東方電泳設備有限公司產品；凝膠成像系統為Bio-fcid Gel Doc XR，美國Bio-fcid產品。(四)本發明中的主要實驗步驟。1、第一輪 RT-PCROne 乂印RT-PCR反應體系如下PrimeScript IStep Enzyme Mix1 μ 12X IStep Buffer12. 5μ 1Template RNA3μ 1上遊引物(10μ Μ)1μ 1下遊引物(10μ Μ)Ιμ RNase Free dH206. 5 μ 1總反應體積25 μ 1One 乂印 RT-PCR 反應條件
權利要求
1.一種分離的核苷酸分子，其序列選自1)核苷酸序列SEQID NO I-SEQ ID NO 24中的任何一種；2)與核苷酸序列SEQID NO=I-SEQ ID NO : 中的任何一種至少95%同源性的核苷酸序列；3)在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQID NO=I-SEQ ID NO : 中任何一種雜交的核苷酸序列；4)或者與1)- 任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述分子的序列的核苷酸分子。
3.根據權利要求2所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述分子的序列為SEQID N0:25 所示。
4.根據權利要求1或2所述的核苷酸分子作為PCR引物的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，PCR的上下遊引物組合分別選自1)SEQID NO :1 禾口 3 ；2)SEQID NO :2 禾口 4 ；3)SEQID NO :5 禾口 7 ；4)SEQID NO :6 禾口 8 ；5)SEQID NO 9 和 11 ；6)SEQID NO 10 和 12 ；7)SEQID NO 13 和 15 ；8)SEQID NO 14 和 16 ；9)SEQID NO 17 和 19 ；10)SEQID NO 18 和 20 ；11)SEQID NO 21 和 23 ；12)SEQID NO 22 和 24。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述PCR為巢式RT-PCR，所述反應所需的引物組合分別選自1)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO 1和3，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO :2和4；2)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :5和7，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO :6和8 ；3)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :9和11，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO: 10和12 ；4)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :13和15，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO 14 禾口 16 ；5)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :17和19，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO 18 禾口 20 ；6)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :21和23，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO 22 和24。
7.一種檢測布尼亞病毒的巢式RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包括1)作為RT-PCR和巢式PCR引物的權利要求1或2所述的核苷酸分子；2)常規的RT-PCR和PCR緩衝液；3)反轉錄酶和TaqDNA聚合酶。
8.一種含有權利要求2所述核苷酸分子的核苷酸診斷探針分子。
9.根據權利要求8所述的探針分子，其特徵在於，所述探針分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 26 所示。
10.根據權利要求8所述的探針分子，其特徵在於，所述探針分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 27 所示。
全文摘要
本發明涉及一種分離的核苷酸分子及所述核苷酸分子在布尼亞病毒檢測中的應用，以及一種布尼亞病毒的檢測試劑盒。本發明所提供的核苷酸序列及檢測方法、試劑盒可以快速、特異、敏感地檢測布尼亞病毒。
文檔編號C12Q1/70GK102477426SQ201010559958
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月26日 優先權日2010年11月26日
發明者葉長芸, 孫強正, 張永振, 徐建國, 李娟 , 熊衍文, 羅雪蓮 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所