一種滁菊株系離體再生的方法

2023-11-11 05:00:32

一種滁菊株系離體再生的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物生物技術領域，具體涉及一種滁菊株系離體再生的方法。
【背景技術】
[0002]源菊(DendranthemamorifoliumCV.『chuju』)，是菊科菊屬多年生草本植物，主要產於安徽滁州，因此又被叫做安徽滁菊。以花入藥，屬安徽省四大著名道地藥材，名列全國四大藥菊之首，屬藥、茶兼用佳品，具有極高的藥用、保健價值。
[0003]現代藥理檢測分析表明，滁菊富含黃酮、揮髮油和8種人體必需胺基酸;此外，滁菊中富含鋅和砸等10種微量元素，其中「砸」的含量顯著高於其它菊花品種。由於鋅和砸為人體必不可少的兩種微量元素，參與機體的多種代謝過程，在清除人體自由基，保護心血管，預防動脈粥樣硬化，調節血糖及保護肝臟等方面具有重要作用。由於滁菊富含上述有效成分，長期飲用滁菊可以清熱解毒、舒筋活血、護肝明目、增強人體免疫力；同時對高血壓，冠心病，動脈硬化療效顯著。
[0004]研究還發現滁菊對SRAS病毒、癌症(尤其是肝癌)等具有良好的預防作用，對糖尿病也具有明顯的治療作用。近年來，隨著滁菊藥用和保健價值的不斷深入研究及國家標準《原產地域產品滁菊》的實施，市場對滁菊的需求量越來越大，使得滁菊的產業化栽培發展面臨著前所未有的機遇。但缺乏高效的優質種苗繁育技術，成為制約其產業化開發的瓶頸。
[0005]在生產上，滁菊的繁殖主要採用分株、壓條和嫁接等傳統的無性繁殖手段。繁殖過程分別存在繁殖數量有限，管理不便及繁殖過程繁瑣等問題；同時由於多年的田間栽培，使滁菊面臨著品種退化、產量降低、品質變劣和病蟲害嚴重等問題。採用常規育種方法對滁菊進行品種改良，遠不能適用菊農對品種產量和品質的要求。而採用組培快繁技術，可在短期內獲得大量的、遺傳背景一致的優良種苗，以滿足規模化種植對滁菊優質種苗的需求。另外，在此基礎上對滁菊優良品種進行相應的遺傳改良研究也迫在眉睫。
[0006]目前有關滁菊組培再生的研究較少，主要以利用葉片為外植體，通過間接誘導愈傷組織的對滁菊進行快繁或通過莖尖繁殖培養脫毒滁菊，普遍存在繁殖係數低的問題。因此，針對當前滁菊繁育過程中所存在的諸多問題，急需開發一種滁菊株系離體再生的方法，以滿足對滁菊優良株系的快速繁殖和品種改良的需求。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於運用植物組織培養技術，提供一種滁菊株系離體再生的方法。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案:一種滁菊株系離體再生的方法，包括以下步驟:
[0008](I)取田滁菊株系的新生未木質化的帶腋芽莖段為外植體，對其表面進行消毒處理；
[0009](2)將莖段接種於不定芽誘導培養基中，進行I?2周光照培養，待莖段腋芽萌發，並在腋芽周邊誘導出不定芽叢；
[0010](3)培養2?3周後，將帶有不定芽叢的莖段轉接於增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養；
[0011](4)待芽長至2?3cm，轉至生根培養基中進行生根；
[0012](5)光照培養3?4周，待幼苗長至3?4cm並帶有2?4片真葉時，進行煉苗並移栽，獲得滁菊再生植株。
[0013]優選地，所述步驟(I)的莖段為取材于田間篩選出的滁菊優良株系新生的未木質化枝條。
[0014]優選地，所述步驟(I)的中所述的帶腋芽莖段為外植體經初步消毒後，於無菌操作臺內進行表面消毒。
[0015]優選地，所述初步消毒是指莖段去葉後分裝於500ml燒杯中，於流水下衝洗10?20min，期間添加I?2ml洗滌液衝洗，並不斷搖晃。
[0016]優選地，所述莖段表面消毒是指莖段剪切成4?6cm大小，於無菌操作臺中，經無菌水衝洗2?3遍;再用75%酒精進行表面消毒10?30s，無菌水衝洗3?5遍;之後再經0.1%的HgCl2消毒I?3min，最後用無菌水衝洗6?8遍，消毒期間不停地搖動。
[0017]優選地，所述步驟(2)中，用於接種的莖段是指莖段在接種前切去兩端消毒損傷部位，然後切成0.3?0.6cm大小的切段備用，每個切段帶至少帶有一個腋芽。
[0018]優選地，所述步驟(2)中，莖段接種方式為豎直放置於不定芽誘導培養基中。
[0019]優選地，所述步驟(2)中，所述誘導培養基包括:MS+0.2?2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L 瓊脂，pH=5.8。
[0020]優選地，所述步驟(3)中，所述增殖培養基包括:MS+0.I?0.75mg/L 6-BA+0.0?
0.5mg/L NAA+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。
[0021 ] 優選地，所述步驟(3)中，所述生根培養基包括:1/2MS+0.0?1.0mg/L IBA+20g/L鹿糖+7.0g/L 瓊脂，pH=5.8。
[0022]本發明所提供的一種滁菊株系離體再生的方法，具體涉及以滁菊野外優良株系當年生枝條的未木質化莖段為外植體，通過直接誘導叢生芽再生對滁菊優良株系進行高效快速繁殖。
[0023]本發明具有以下突出優點:
[0024]其一，莖段為取材於野外多年生滁菊優良株系的新生未木質化的枝條，一方面能保持母本植株的種質特性;另一方面取材方便、材料豐富;可以實現對野外滁菊優良單株的快繁，實現品種培育；
[0025]其二，再生過程中外植體消毒程序簡單，消毒時間短，對外植體的毒害較小；
[0026]其三，叢生芽再生效率高，誘導率最高達到100 % ；
[0027]其四，再生速度快，繁殖係數高，且能實現對獲得的無菌苗莖段進行進一步的擴大繁殖，為優良滁菊株系的快速繁殖和遺傳改良提供了重要的技術支持。
[0028]因此，本發明所提供的滁菊株系離體再生的方法，不僅為滁菊優良株系的快速繁殖和規模化生產提供了技術支撐，同時也為後期滁菊的品種改良奠定了基礎。
【附圖說明】
[0029]圖1滁菊莖段腋芽的萌發
[0030]圖2莖段腋芽處不定芽叢的誘導
[0031]圖3不定芽芽的增殖和伸長
[0032]圖4不定芽生根
[0033]圖5滁菊再生植株的煉苗、馴化
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0035]實施例1
[0036]—種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0037]1、從大田選取生長良好的多年生滁菊優良株系，剪取新生的20d苗齡的未木質化的枝條；
[0038]2、去葉後，分裝於500ml燒杯中添加Iml洗滌劑，於流水衝洗1min;然後剪切成4cm大小的莖段，於無菌操作臺中，用無菌水衝洗3遍後用75%酒精消毒20s，無菌水衝洗5遍，之後用0.1%的升汞消毒lmin，最後用無菌水衝洗6遍，消毒期間不停的搖動。消毒後將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成0.3cm左右的切段備用；
[0039]3、將莖段切段豎直接種於不定芽誘導培養基中進行腋芽的萌發和不定芽的誘導，經過第I周的光照培養後莖段腋芽萌發，再光照培養I周后腋芽周邊誘導出不定芽叢，腋芽萌發率為100%，不定芽的誘導率為85.7% ;不定芽誘導培養基為MS+0.2mg/L 6_BA+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0040]4、繼續培養2周後，將不定芽叢轉接於不定芽增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養，光照培養3周後獲得大量伸長的不定芽叢，平均每個外植體產生5.8個不定芽;不定芽增殖培養基為:MS+0.lmg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。
[0041]5、將高度為2?3cm的不定芽轉至生根培養基中培養2周，獲得伴有細長根系的完整再生植株，滁菊無菌苗生根率高達100 %，生根培養基為:l/2MS+20g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH=5.8；
[0042]6、光照培養3?4周，待幼苗長至3?4cm並帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株。
[0043]實施例2
[0044]—種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0045]1、從大田選取生長良好的多年生滁菊優良株系，剪取新生的30d苗齡的未木質化的枝條；
[0046]2、去葉後，分裝於500ml燒杯中添加2ml洗滌劑，於流水衝洗15min;然後剪切成5cm大小的莖段，於無菌操作臺中，用無菌水衝洗3遍後用75%酒精消毒10s，無菌水衝洗3遍，之後用0.1%的升汞消毒2min，最後用無菌水衝洗7遍，消毒期間不停的搖動。消毒後將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成0.4cm左右的切段備用；
[0047]3、將莖段切段豎直接種於不定芽誘導培養基中進行腋芽的萌發和不定芽的誘導，經過第I周的光照培養後莖段腋芽萌發(圖1)，再光照培養I周后腋芽周邊誘導出不定芽叢(圖2)，腋芽萌發率為100%，不定芽的誘導率為100%;不定芽誘導培養基為MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0048]4、繼續培養2周後，將不定芽叢轉接於不定芽增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養，光照培養3周後獲得大量伸長的不定芽叢(圖3)，平均每個外植體產生11.5個不定芽;不定芽增殖培養基為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8；
[0049]5、將高度為2?3cm的不定芽轉至生根培養基中培養2周，獲得完整的再生植株(圖4)，滁菊無菌苗生根率為100%，根系長而健壯，生根培養基為:1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L鹿糖+7.5g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0050]6、光照培養3?4周，待幼苗長至3?4cm並帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株(圖5)。
[0051 ] 實施例3
[0052]一種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0053]1、從大田選取生長良好的多年生滁菊優良株系，剪取新生的45d苗齡的未木質化的枝條；
[0054]2、去葉後，分裝於500ml燒杯中添加2ml洗滌劑，於流水衝洗20min;然後剪切成6cm大小的莖段，於無菌操作臺中，用無菌水衝洗2遍後用75%酒精消毒30s，無菌水衝洗4遍，之後用0.1%的升汞消毒3min，最後用無菌水衝洗8遍，消毒期間不停的搖動。消毒後將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成0.6cm左右的切段備用；
[0055]3、將莖段切段豎直接種於不定芽誘導培養基中進行腋芽的萌發和不定芽的誘導，經過第I周的光照培養後莖段腋芽萌發，再光照培養I周后腋芽周邊誘導出不定芽叢，腋芽萌發率為100%，不定芽的誘導率為80%;不定芽誘導培養基為MS+2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0056]4、繼續培養2周後，將不定芽叢轉接於不定芽增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養，光照培養3周後獲得大量伸長的不定芽叢，平均每個外植體產生7.6個不定芽;不定芽增殖培養基為:MS+0.75mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0057]5、將高度為2?3cm的不定芽轉至生根培養基中培養2周，獲得完整的再生植株，滁菊無菌苗生根率為100%，根多而短粗，生根培養基為:1/2MS+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.5g/L 瓊脂，ρΗ=5.8;
[0058]6、光照培養3?4周，待幼苗長至3?4cm並帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株。
[0059]實施例4
[0060]一種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0061]1、取所獲得的苗齡滁菊優良株系組培無菌苗的莖段，切成0.4cm大小，每個莖段至少帶一個腋芽；
[0062]2、將莖段切段豎直接種於不定芽誘導培養基中進行腋芽的萌發和不定芽的誘導，經過2周的光照培養，腋芽萌發並在腋芽周邊誘導出不定芽叢，不定芽的誘導率為100%;不定芽誘導培養基為MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8;
[0063]3、繼續培養2周後，將不定芽叢轉接於不定芽增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養，光照培養3周後獲得大量伸長的不定芽，平均每個外植體產8.0個不定芽;不定芽增殖培養基為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0064]將高度為2?3cm的不定芽轉至生根培養基中培養2周，獲得完整的再生植株，滁菊無菌苗生根率為100%，根系長而健壯，生根培養基為:l/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.5g/L 瓊脂，ρΗ=5.8;
[0065]5、將上述滁菊無菌苗的莖段切成0.5cm大小，每個莖段帶有至少一個腋芽，接種於上述不定芽誘導和增殖培養基中進行不定芽的誘導和增殖，平均每個莖段可產生12個左右不定芽;並將增殖後的不定芽接種於上述相同的伸長和生根培養基中進行不定芽的伸長和生根培養；
[0066]6、光照培養3?4周，待幼苗長至3?4cm並帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株。
[0067]以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【主權項】
1.一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)取田滁菊株系的新生未木質化的帶腋芽莖段為外植體，對其表面進行消毒處理； (2)將莖段接種於不定芽誘導培養基中，進行I?2周光照培養，待莖段腋芽萌發，並在腋芽周邊誘導出不定芽叢； (3)培養2?3周後，將帶有不定芽叢的莖段轉接於增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養； (4)待芽長至2?3cm，轉至生根培養基中進行生根； (5)光照培養3?4周，待幼苗長至3?4cm並帶有2?4片真葉時，進行煉苗並移栽，獲得滁菊再生植株。2.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:所述步驟(I)的莖段為取材于田間篩選出的滁菊優良株系新生的未木質化枝條。3.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於，所述步驟(I)的中所述的帶腋芽莖段為外植體經初步消毒後，於無菌操作臺內進行表面消毒。4.根據權利要求3所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於，所述初步消毒是指莖段去葉後分裝於500ml燒杯中，於流水下衝洗10?20min，期間添加I?2ml洗滌液衝洗，並不斷搖晃。5.根據權利要求3所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於，所述莖段表面消毒是指莖段剪切成4?6cm大小，於無菌操作臺中，經無菌水衝洗2?3遍;再用75 %酒精進行表面消毒10?30s,無菌水衝洗3?5遍;之後再經0.1%的HgCl2消毒I?3min，最後用無菌水衝洗6?8遍，消毒期間不停地搖動。6.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，用於接種的莖段是指莖段在接種前切去兩端消毒損傷部位，然後切成0.3?0.6cm大小的切段備用，每個切段帶至少帶有一個腋芽。7.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，莖段接種方式為豎直放置於不定芽誘導培養基中。8.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，所述誘導培養基包括:MS+0.2?2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。9.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，所述增殖培養基包括:MS+0.I ?0.75mg/L 6-BA+0.0?0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊月旨，ρΗ=5.8。10.根據權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，所述生根培養基包括:1/2MS+0.0?1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。
【專利摘要】本發明公開一種滁菊株系離體再生的方法，取田間滁菊株系的新生未木質化的帶腋芽莖段為外植體，對其表面進行消毒處理；將莖段接種於不定芽誘導培養基中，1～2周光照培養，待莖段腋芽萌發，並在腋芽周邊誘導出不定芽叢；培養2～3周，將帶有不定芽叢的莖段轉接於增殖培養基中進行不定芽的增殖和伸長培養；待芽長至2～3cm，轉至生根培養基中進行生根；光照培養3～4周，待幼苗長至3～4cm並帶有2～4片真葉時，進行煉苗並移栽，獲得滁菊再生植株。本發明具有繁殖速度快，繁殖係數高，一次擴大培養後，平均每個外植體至少產生數十個叢生芽，保持滁菊母本植株優良特性；為優良滁菊株系快速規模化繁殖和遺傳改良提供技術支持。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706933
【申請號】CN201610124391
【發明人】侯金豔, 吳麗芳, 馬朝東
【申請人】中國科學院合肥物質科學研究院