幹擾素同種型的轉化方法及其產物的製作方法

2023-11-11 02:07:57 4

專利名稱：幹擾素同種型的轉化方法及其產物的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質的分離與純化.具體地，本發明涉及蛋白質的 分離、蛋白質同種型的分離和同種型到所需蛋白質的轉化. 背景技術天然蛋白質廣泛用於研究和臨床工作.儘管此類蛋白質可取自天 然資源，但通過重組技術可從非天然資源中生產這些蛋白質.例如， 對通過重組技術構建的微生物比如轉化的細菌進行發酵，產生大量人 類幹擾素，其成本大大上低於利用天然資源可能花費的成本.該DNA 重組技術也已用來生產其他的重要蛋白質比如胰島素和組織纖溶酶 原激活劑。然而通過重組技術改變的細菌也產生汙染物和意欲生產的蛋白 質的結構同種型.這些汙染物和結構同種型包括蛋白質寡聚體和還原 型蛋白質同種型(見D， Andrea等人，美國專利號4， 765, 903)、 細胞碎片和病毒(見Georgiadis等人，美國專利號4， 732， 683) 和連有丙酮酸的同種型(見Rose等人，生物化學雜誌(J, Bio.Chem) 287: 19101( 1992); Prome等人，生物化學雜誌266: 13050( 1991); Stevens等人，生物化學雜誌252: 29卵(1977 );和Shapiro等人， 生物化學雜誌255: 3120 ( 1980)).需要在蛋白質純化(過程)中 去除這些汙染物.很明顯，這些蛋白質同種型使所需蛋白質的純度降低而此類同種 型的去除工藝使總產量下降.但如果該蛋白質同種型能夠轉化成所需 的蛋白質的話，就勿需去除之，且蛋白質的總產量會顯著增加.需要 一種鑑別非所需的蛋白質同種型並將其轉化為所需蛋白質的方法.本 發明即指此類需要. 發明內容本發明提供通過分離附屬的同種型並將其轉化成所需功能蛋白 質來製備高產量、高純度蛋白質的方法.在一實施方案中，本發明提供提高干擾素-a組分之產量的方法，包括將附屬同種型轉化成千擾 素-a.儘管在一優選實施方案中幹擾素-a是幹擾素-ot2b,但本發 明並不限於某種特定的幹擾素-a.在另一實施方案中，本發明提供將重組產生的附屬同種型轉化成 所需蛋白質的方法，包括通過化學方法去除附屬同種型的可斷裂基團.本發明並不限於所去除的該可斷裂基團.在一實施方案中該可斷 裂基團包括丙胡酸.本發明並不限於通過化學方法去除可斷裂基團的方法.在一實施 方案中，該方法包括將附屬同種型置於酸性溶液內.當附屬同種型是 幹擾素-a的丙嗣酸附屬同種型時，優選該酸性溶液的pH約為5.5. 在此實施方案中，更優選該酸性溶液在34-40X:.而在另一實施方案 中，將附屬同種型置於鋅離子溶液中.在一優選實施方案中，該鋅離 子溶液的pH為7.8-8.6.在更優選的實施方案中，該鋅離子溶液是 30-38X:,本發明也並不限於所用酸性或鋅離子溶液的類型.在優選實施方 案中，該酸性溶液或鋅離子溶液包括一種抗氧化劑.在尤其優選的實 施方案中，該抗氧化劑包括蛋氨酸.在此實施方案中蛋氨酸的優逸濃 度是5-40mM. 定義此處所用的術語"所需蛋白質"是指意欲純化的感興趣的蛋白 質.對所需蛋白質的鑑別當然要受制於純化過程的最終目的.例如， 純化過程期間可能需要在純化工藝的中間步稞中獲得一組或多組蛋 白質，包括汙染物.不管對獲得中間蛋白質組的興趣如何，作為純化 過程最終目的的蛋白質組被認為是所需蛋白質.此處所用的術語"附屬同種型"指結構和/或功能特性與所需蛋 白質類似的蛋白質同種型，其中可將可斷裂基團從該蛋白質中去除以 產生所需蛋白質."可斷裂基團"理解為指可通過化學方法去除的、 連在所需蛋白質上的化學基團.在此所用的"化學去除"或"通過化 學方法去除"理解為指通過化學手段，包括但不限於酸性溶液、鹼性 溶液、金屬離子催化等將化學基團自蛋白質上分離開來.儘管不是實施本發明所必需的，如果能夠對可斷裂基團進行化學鑑別的話，附屬同種型可以稱作一種特定類型的附屬同種型.例如，"丙胡酸附屬同種型"是連有鑑定為丙s^酸的可斷裂基團的所需蛋白質.此處所用的術語"氧化反應"是指使兩個半胱氛酸的疏基基團形 成二疏鍵的反應.此處所用的術語"幹擾素-a"是指一類使靶細胞獲得對病毒的 抵抗力、抑制細胞增殖和調節MHCI型抗原表達的可誘導分泌的蛋白 質家族.該家族包括，但不限於幹擾素a -2a ( Roferon, Hoffman La-Roche, Nutley， NJ)、幹擾素a-2b ( Intron, Schering-Plough, Madison, NJ )、 幹擾素a -2c ( Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim， Ingelheim， Germany)或通過確定天然存在的幹擾素a 共有序列而定義的共有區幹擾素.具體實施方式
本發明涉及蛋白質的分離與純化.在一實施方案中，本發明提供 附屬同種型的鑑別與純化.在另一實施方案中，本發明提供自附屬同 種型產生所需蛋白質的方法.在還有一實施方案中，本發明通過共純 化該所需蛋白質和附屬同種型並隨即將該附屬同種型轉化為該所需 蛋白質，提供高純度的所需蛋白質.這樣，附屬同種型的數量下降而 所需蛋白質的總產量提高，且/或純度高於以前所得(產物) 該所 需蛋白質的產量可以比附屬同種型未經轉化所得產量提高十倍.儘管本發明並不限於該所需蛋白質或附屬同種型的來源，但在一 實施方案中，此來源是通過重組技術構建的微生物.有許多此類為本 領域技術人員熟知的技術.此轉化的微生物可以是真核或原核細胞、 細菌、哺乳類細胞等.例如，通過遵循美國專利第4, 530, 901號 Weissman的教導或通過歐洲專利申請公開EP032, 134號所迷技術， 可以在細菌中生產幹擾素.同樣，本發明並不限於從生產細胞中提取附屬同種型的任何特定 的方法，例如，當所需蛋白質是幹擾素a時，Leibowitz等人在美國 專利第4， 315， 852號和4， 364， 863號中所述的方法是合適的.同樣，本發明並不限於用以分離該附屬同種型或所需蛋白質的特 定純化技術.許多層析技術和其他的分離方法對本領域技術人員而言 是已知的，並可以在此應用.雖然本發明並不限於鑑別附屬同種型的方法，但可以通過研究所 需蛋白質及分子量高於所需蛋白質的任何汙染物的分子量來完成附屬同種型的鑑別，Rose等人在生物化學雜誌，267: 19101 ( 1992) 中敘述了一種此類方法.可將分子量高於所需蛋白質的汙染物置於降 解條件下(如pH極酸或極減)並分析降解產物.若其中一種降解產 物的質量和/或結構特性與所需蛋白質相同，則可認為該汙染物是具 有可斷裂基團的附屬同種型.雖然本發明並不限於使附屬同種型轉化為所需蛋白質的特定方 法，在一實施方案中，篩選工藝可以確定恰當的轉化條件'例如，一 種工藝需要逐步調整反應溶液的pH，直至可斷裂基團脫離附屬同種 型而產生功能性或非-不可逆性變性的所需蛋白質.還有，本發明並不限於化學去除可斷裂基團的方法.在一實施方 案中，通過將附屬同種型置於酸性條件下(如應用醋酸)來去除該基 團，在又一實施方案中，將附屬同種型置於鋅離子中.本發明也並不限於進行斷裂反應的溫度.但一般而言，溫度越 高，附屬同種型轉化為所需蛋白質(的速度)越快.雖然化學去除可斷裂基團能夠產生結構特性與所需蛋白質相同 的蛋白質，但有時需要將還原型的疏基氧化成二硤鍵.這可使該蛋白 質完成恰當的摺疊，成為功能蛋白質.巰基的氧化方法在本領域已 知，本發明並不限於特定的氧化方法.在一實施方案中，本發明考慮在氧化過程中對蛋氨酸基進行保護 以防止形成蛋氨酸亞碸.保護蛋氨酸基的方法在本領域是已知的，本 發明並不限於保護蛋氨酸基的特定方法.但這些方法包括應用抗氧化 物，如Lam等人，藥物科學雜誌(J. Pharm. Sci. ) 86: 1250 ( 1997) 和Takruri的美國專利第5， 272， 135號中所述.本發明並不限於完成氧化反應的方法.例如，在一實施方案中， 本發明考慮在去除可斷裂基團後氧化巰基.在另一實施方案中，本發 明考慮在同樣的反應條件下去除可斷裂基團並氧化鼓基.同樣，當在同一反應條件中去除可斷裂基團並氧化蛋白質時，本 發明並不限於任何特定的自附屬同種型去除可斷裂基團及氧化的方 法.但在一實施方案中，通過篩選來確定化學去除可斷裂基團的最佳 條件。例如，可用一定範閨的pH條件進行實驗，並可測量結構足夠完整(即非不可逆變性)的所需蛋白質的生成量和/或可斷裂基團的量.對結構足夠完整的所需蛋白質的量與反應pH(的關係)進行作 圖將得到一鍾型曲線，其最高點表示化學去除可斷裂基團的理想pH. 在一此類實施方案中，可進行類似的氧化反應篩選.若化學去除反應 與氧化反應的鐘型曲線交叉的話，交叉點表示在同一反應中去除可斷 裂基團並氧化疏基的最佳pH條件.就幹擾素-a之丙明酸附屬同種型 的化學去除和氧化而言，兩曲線在pH5周閨交叉，表明進行聯合反應 的最佳pH.其他可以評估的反應條件包括但不限於鹽濃度、溫度等.將附屬同種型轉化成所需蛋白質後，可能還需要進行層柝步驟以 便從汙染物中純化所需蛋白質.所需蛋白質得以適當純化後，可以製成適於藥用的形式，如果需 要的話.例如，當所需蛋白質為幹擾素a時，Kwan的美國專利第4， 847， 079號及Yuen等人的美國專利第4, 496， 537號中所述的配方 是合適的.或者，其他無效的藥用栽體可以為固體或液體.固體狀制 品包括粉劑、片劑、可分散顆粒、膠囊、面囊刑和栓劑.粉劑和片劑 可包括約5%到95%的所需蛋白質.適當的固體栽體為本領域所知，如 碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、糖或乳糖.片劑、粉劑、面囊劑和膠囊 可作為適於口服的固體劑量形式使用.為製備栓劑，首先融化低融點蠟，比如脂肪酸甘油酯混合物(如 可可黃油)，並通過攪拌使活性組分勻漿分散到其中.然後將融化的 勻漿混合物倒入適當體積的模型中，使之冷卻並固化.液狀製品包括溶液、懸浮液和乳濁液.例如，用於非腸道注射的 水溶液或丙二醇水溶液或口服溶液、懸浮液和乳濁液所添加的增甜劑 和透明劑.液狀製品也可包括鼻內給藥的溶液.適於吸入的氣溶膠製品可包括可與藥用栽體比如惰性的壓縮氣 體聯合在一起的溶液和粉狀固體.本發明的化合物也可以經皮傳輸，經皮組合物可以為乳脂、洗 液、氣溶膠和/或乳濁液形式，並可納入本領域作此用途的傳統基質 或儲存型的經皮骨藥中.單位劑量製品中活性化合物的數量可以是O. Olmg左右到1000邁g 左右，優選O. Olmg左右到750mg左右.或者，活性化合物可按照國 際單位來製備，優選劑量在三百萬到五千萬國際單位之間.在一此類實施方案中，考慮(使用)三百萬、五百萬、 一千八百萬、兩千五百 萬和五千萬單位劑量形式.意欲在臨使用前轉化成液狀製品以便口服、局部給藥或非腸道給 藥的固體形式也包括在內.下列實施例用來說明本發明的某優選實施方案和方面，本發明的 範閨並不限於此實施例1:丙酮酸附屬同種型轉化的篩選過程丙織酸附屬同種型可在細胞內形成，其中蛋白質N端胺基酸殘基 的a氨基與丙胡酸的羰基縮合在一起，如果丙胡酸幹擾蛋白質的構象的話，則只有在該丙酮酸-蛋白質附屬同種型水解(丙稱酸從蛋白質 上脫離)的時候，蛋白質才能通過有利於熱力學的構象改變自由再折 疊成其所需的形式.若所需蛋白質含有二硫鍵的話，作為再摺疊成所 需形式的一部分，應使丙嗣酸斷裂所產生的還原型同種型發生氧化.下列步驟說明如何確定使丙胡酸-蛋白質附屬同種型轉化成其所 需形式的最佳條件.如前所論，若所需蛋白質沒有二硫鍵，只需為了 最大程度地斷裂(水解)丙酮酸來進行篩選.若所需蛋白質有二疏鍵， 需要不僅為了最大程度地斷裂(水解)丙嗣酸，也為了最大程度地形 成二硫鍵(氧化)來進行篩選.1)丙稱酸分析為理解丙胡酸斷裂的動力學，需要分析丙胡酸以便檢測水解程 度.例如，可通過化學修飾方法或酶學方法對"自由"丙酮酸進行定 量分析.2， 4-二確基笨肼(DNPH)可用來衍生丙新酸.應使用合適 的MWC0膜例如10K的膜對分析樣品進行超濾以去掉丙嗣酸-蛋白質附 屬同種型.在酸性pH下使濾過物與DNPH溫育，後者可與"自由"丙 嗣酸反應.應用C8柱如NucleosilC8柱(5Mm)可輕鬆地在RP-HPLC 上分析DNPH-衍化的丙嗣酸，2, 4—二硝基苯腙.由於衍生反應是化學計量的，定量測量丙明酸也成為可能，也可 用醃學試刑盒(如乳酸脫氫酶/NADH)來測量丙嗣酸.此方法勿需樣 品超濾，因為溫育過程中其溫和的條件不會使丙酮酸從丙明酸-蛋白 質附屬同種型上斷裂.為測量自由丙酮酸和結合到蛋白質上的丙明酸的總量，在衍生前 應使所有結合的丙酮酸斷裂.由於DNPH衍生方法需要極酸的pH和相對較長的溫育時間，可以在溫育過程中使丙嗣酸斷裂並隨即用DNPH 衍生.這樣在DNPH衍化方法中為測量樣品中自由和結合丙稱酸的總 量應使用未經超濾的樣品.2) 同種型分析有二疏鍵的蛋白質至少有三種同種型，無二硫鍵的蛋白質至少有 兩種同種型.大體而言，所需蛋白質及其還原型可輕鬆通過RP-HPLC 分辨.當蛋白質具有二疏鍵時，若三種同種型(附屬同種型、還原型和 所需蛋白質)能夠通過RP-HPLC進行定量分析的話篩選會非常有效. 並不一定需要分析丙酮酸，可能要鑑別何為限速步驟，若有的話.然 而，從還原型分辨出丙嗣酸-蛋白質附屬同種型常常是困難的.在這 種情況下，為優化每一轉化步驟必須進行丙酮酸分析.3) 同種型組分的測量當所需形式沒有二砥鍵時，不難確定同種型的組分，因為通過 RP-HPLC可輕鬆地從所需形式中分辨出丙嗣酸-蛋白質附屬同種型，當所需形式具有二疏鍵而蛋白質的附屬同種型不能從其還原型 中分離出來時，應測量結合到蛋白質上的丙明酸以確定同種型組分， 結合到蛋白質上的丙酮酸的摩爾數，即蛋白質附屬同種型的數量，是 自由和結合丙酮酸的總量減去自由丙嗣酸的數量.這可在DNPH方法 中應用經過或未經超濾的樣品進行測量.然後，還原型的數量為通過 RP-HPLC測量的蛋白質附屬同種型和還原型的總量與通過丙稱酸分 析測得的蛋白質結合性丙酮酸的數量之差.然後可以計算同種型組 分.4) 篩選最適條件不論所需形式是否具有二硫鍵，篩選標準應是同樣的，都是為了 使附屬同種型到所需形式的特定轉化率達最大. 4.1)所需蛋白質無二硤鍵時這種條件下，當丙酮酸從丙嗣酸-白質附屬同種型上脫離後便形 成所需蛋白質.在該情況下不須通過丙嗣酸分析來檢測丙酮酸的斷 裂，因為只有一步，水解，參與了附屬同種型到所需形式的轉化.例 如，通過RP-HPLC檢測附屬同種型的消失和所需形式的形成便已足 夠.需要找出使附屬同種型最大程度地轉化成所需蛋白質的溫育條件.第一步是就篩選過程中使用的蛋白質附屬同種型濃度的工作範 閨來研究反應動力學，若就附屬同種型的濃度而言該動力學是一級 的，則樣品濃度對動力學沒有影響，可以在錄選或參數評估時用任何 濃度，否則，篩選過程中該濃度應為常數.可以有許多影響水解步碟的參數.主要參數可以為pH、溫度、 金屬離子(如鋅、鐵、亞鐵，Cu、 Mg等)、傳導性、緩衝液、光和 攪拌.通過測量一種溫育參數對附屬同種型到所需形式的轉化率的影 響，可以優化每一參數.例如，在足夠範閨內不同的pH條件下，溫 育幾份含丙稱酸-蛋白質附屬同種型的樣品，其他所有的參數都是其 相應的最佳假想值.經過一定的溫育時間後(如過夜)測量每份的轉 化反應.轉化率最高的pH視為最佳pH.重複進行此類實驗來優化其 他參數，使用已優化參數的最佳值來替代原來的最佳假想值.這是一 般的優化技術.溫育的pH影響水解率. 一般地，pH越低水解程度越高.溫度升 高水解率也提高，然而，當附屬同種型或所需蛋白質發生不可逆性沉 澱時或如果該蛋白質發生不可逆性變性的話，極酸pH如pH2條件下 的水解便失去了意義. 一些金屬陽離子可催化水解(反應).即便金 屬陽離子催化丙嗣酸斷裂，此類催化反應在很大程度上依賴於金屬陽 離子的濃度.這樣，篩選金屬陽離子時應使用極大範閨的金屬陽離子 濃度，參數之間也可能有相互作用.例如，當某種金屬陽離子對轉化有 影響時，根據該離子存在與否可能會出現不同的最佳pH.就丙胡酸 附屬同種型而言，Zn陽離子的存在致使丙嗣酸斷裂的最佳pH不同 (pH7.8-8.6),這樣，需要不僅使待優化的新參數而且使其他的重 要參數同時作出改變，以便真正優化該參數，4.2)所需蛋白質有二疏鍵時在兩步轉化方法中，經水解(反應)還原型自附屬同種型上斷裂 並隨即經氧化(反應)轉化成所需形式.理想而言，使蛋白質附屬同種型和還原型分離開，再把上面就無 二疏鍵的蛋白質所述的方法應用於每一附屬同種型和還原型以便優 化每一步驟，主要的不同在於除以上列舉的參數外氧化步驟的氧轉移和像氧化型穀胱甘肽(GSSG)的一些抗氧化劑可以得到優化.如果 GS-SG僅使還原型氧化的話，會大大提高氧化率或二破鍵的形成率. 然而，若GS-SG也使附屬同種型氧化且氧化型附屬同種型不易水解， 很可能會出現低產率或轉化率.從每一最佳條件可以估計出附屬同種型轉化為所需形式的最佳 條件.如果它們適當相近，中間的條件設為最佳條件.理論上講，根 據樣品中丙酮酸-蛋白質附屬同種型與還原型的起使比例可以有不同 的最佳條件.例如，附屬同種型佔決大多數時的最佳條件應不同於還 原型佔決大多數時的最佳條件.這樣，應認識到從個別的最佳條件來 估計水解和氧化的最佳條件時應把樣品的組分考慮在內.最後，用實驗證實最佳轉化條件.若有的話，鑑別限速步槺常常 有助於調整最佳轉化條件.還原型隨溫育時間的穩定積累表明氧化步 驟是限速的，發生積累時，應使用更有利於氧化的條件比如更多的 氧、更高的pH和更高的溫度使所需形式的形成達到最大.如果雖然 所需形式的形成率很明顯但常常存在低水平的還原蛋白質，則斷裂步 驟是限速的.這時，可以改變溫育條件以便提高斷裂步驟(的速度)， 從而使所需形式的形成達到最大.如果化學去除可斷裂基團的最佳條 件與蛋白質氧化的最佳條件相去甚遠，則可逐步實施之.例如，首先使 用水解步驟的最佳條件，水解幾乎完成時再使用氧化步驟的最佳條 件.無法分離每一同種型時，必須分析丙嗣酸，當兩種同種型不能在 RP-HPLC上分辨時尤其如此.通過監測丙嗣酸的釋放，可以首先優化 水解步驟.第一步幾乎完成或非常慢的時候再優化第二步.從這些最 佳條件中估計出總體轉化的最佳條件並用實驗證實.另一種方法是在 水解步驟優化之後優化總體轉化.尤其是由於附屬同種型顯著並連續 地水解而幹擾第二步優化時，這種方法更實用.如前提及，pH、溫度、 氧轉移、金屬陽離子和氧化劑都是待優化的重要參數.比起一步轉化方法來，兩步轉化方法中參數之間的相互作用更加 重要。為證實此類最佳條件的參數對所需形式沒有影響，應純化所需形 式並應對其性質，包括生物特性和純度進行全面檢查. 實施例2:丙稱酸附屬同種型到幹擾素-a2b的轉化在升高的溫度(30-37t:)和5,2-5. 6的反應pH條件下丙酮酸斷 裂，二硫鍵形成.該反應條件是獨一無二的，因為在同樣的反應條件 下兩種反應順序進行且生物活性蛋白質得到回收，把從蛋白質分離層析洗脫的含有蛋白質UV吸收峰的組分收集在 一起，0.45nM過濾除菌.按照每升蛋白質3克蛋氨酸將其加到蛋白質收集樣中，攪拌至溶 解.用氫氧化鈉稀釋液調整其pH至5. 2-5.6.氯化鈉的濃度不作調 整在150-200mM NaCl之間，將由lOmM醋酸(pH5. 5) 、 200mM蛋氨酸和200mM NaCl組成的 儲存液加到蛋白質收集樣中，使蛋氨酸的終濃度達20mM.將蛋白質收集樣轉移到反應管中，提高溫度至37x:並穩定攪拌，在36-38i:溫育蛋白質收集樣24-30個小時.在第24-30小時時間點，用深度過濾器過濾反應混合物，然後用 0.45pM的濾器除去沉澱.再濃縮蛋白質庫並用10mM的醋酸 (pH5. 5)在2-IOX:透析濾過.實施例3:應用鋅離子丙酮酸附屬同種型到幹擾素-a2b的轉化在341C、 p朋.2並含有鋅離子(1M)的條件下使附屬同種型轉化成幹擾素-a2b,在反應過程中對反應溶液進行攪拌.轉化率約為80%時，可將反應溶液的溫度降至4C以終止反應.溶液配備lMTris緩衝液4X:保存，lMTris鹼+HCl， pH8.3,lmM Zn溶液4t:保存，lmM ZnS04H20+10mM醋酸鈉+175邁M NaCl,pH5. 5.把從蛋白質分離層析洗脫的含有蛋白質UV吸收峰的組分收集在 一起，0. 2MM過濾除菌.緩慢將約0.083 (V/V) 1M的Tris緩衝 液加到蛋白質庫( 一般蛋白質收集樣(pool)的pH在5. 2-5. 5之間) 中，攪拌至pH約8.2.在攪拌的同時向鹼性蛋白質收集樣緩慢加入lmM鋅離子溶液，使 Zn陽離子與總體丙酮酸附屬同種型的摩爾比達0. 6到1，例如若丙嗣 酸附屬同種型的濃度是lmg/ml，需30mM Zn或0.03 ( V/V) lmM Zn 溶液.應用新鮮的Zn陽離子溶液.攪拌時在反應器中將反應溶液加熱至在反應過程中把反 應溫度控制在34X:.也需要連續攪拌以便使反應溶液充分混勻，但1是不要過於猛烈而產生氣泡.應使反應器通氣以便將氧氣轉移至反應 溶液中。另一方面，如果反應液約達反應器的一半滿，該通風是沒有必要的，在反應中，應用RP-HPLC可使反應樣品接著轉化.當反應 結束時，使溫度降至4t:進行下一步層析.據前所論，很明顯本發明提供鑑別非所需蛋白質同種型並將其轉 化為所需蛋白質的方法，其能夠提高總的產量和所需蛋白質的純度.
權利要求
1.一種提高干擾素-α組分之產量的方法，包括將附屬同種型轉化成幹擾素-α。
2. 權利要求l的方法，其中所說的附屬同種型是丙嗣酸附屬同種型.
3. 權利要求2的方法，其中所述的幹擾素-oc是幹擾素-ot2b,
4. 權利要求3的方法，其中所述的附屬同種型被置於酸性溶液中.
5. 權利要求4的方法，其中所述的酸性溶液pH大約是5.5。
6. 權利要求5的方法，其中所述的酸性溶液為34-40X:.
7. 權利要求6的方法，其中所述的酸性溶液包括一種抗氧化劑.
8. 權利要求7的方法，其中所述的抗氧化劑包括蛋氨酸.
9. 權利要求8的方法，其中所述的蛋氨酸濃度為5-40mM.
10. 權利要求3的方法，其中所述的附屬同種型被置於鋅離子溶 液中.
11. 權利要求10的方法，其中所述的鋅離子溶液為pH7.8-pH8. 6.
12. 權利要求ll的方法，其中所述的鋅離子溶液為30-38X:.
13. 權利要求12的方法，其中所迷的鋅離子溶液包括一種抗氧化劑。
14. 權利要求13的方法，其中所述的抗氧化劑包括蛋氨酸.
15. 權利要求H的方法，其中所述的蛋氨酸濃度為5-40mM.
16. 權利要求9的方法，還包括應用層析技術純化所迷的幹擾素 -a2b.
17. 權利要求16的方法，其中所述的層析技術包括以瓊脂糖為 基礎的染料親和層析，然後是瓊脂糖為基礎的陰離子交換層析，然後 是結晶步驟.
全文摘要
本發明提供分離蛋白質的附屬同種型並將其轉化成所需蛋白質的方法。在優選實施方案中，本發明涉及應用酸性溶液或鋅離子溶液來斷裂所需蛋白質的化學基團。在更優選的實施方案中，本發明考慮(通過)使還原型巰基氧化的方法來斷裂化學基團，形成所需的功能蛋白質。
文檔編號C07K14/56GK101255188SQ20081008668
公開日2008年9月3日 申請日期1999年10月5日 優先權日1998年11月12日
發明者A·弗雷, D·C·懷利, M·沃洛克, R·門吉森, S·坎農-卡爾松, S·李 申請人:先靈公司