一種鑑定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法

2023-11-10 23:59:47 3

專利名稱：一種鑑定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法
技術領域：
本發明涉及一種分子生物學，特別是一種鑑定鰱魚幼苗性別的分子生 物學方法。
背景技術：
我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差 異，因此，開展這些魚類性別決定相關基因及性別特異標記的研究對於魚 類性別控制具有很高的理論指導意義。鰱魚(i/;;; o/^/w/m/c/2^^ wo/浙/;c) 又叫白鰱、水鰱、跳鰩、鰱子，屬於鯉形目，鯉科，是著名的四大家魚之 一。著名的特產經濟魚類，養殖歷史悠久，在我國池塘、湖泊、水庫均有 養殖，且養殖產量一直居我國淡水養殖之首。鰱魚雌性生長發育快，生長 迅速。目前人工雌核發育與激素性反轉結合創造全雌性的養殖群體是鰱魚 育種的主要方向。但是由於鰱第一次性成熟需3 4年，在幼苗時期根本 無法通過外觀形態來判斷其性別特徵，所以怎樣從幼苗群體中，簡單快速 的識別出遺傳性別成為制約鰱魚成功選育的先決條件。
RAPD技術是近幾年出現的，可以快速尋找分子標記的一種有效方法。 用它在某些動物的基因組中尋找性別標記已有成功報導。如在虹鱒魚基因 組中找到了兩個雄性特異的分子標記，可以作為識別雌雄的探針。Kovacs 等2000年用RAPD掃描非洲鯰魚(C/an'os gw/印/m^)雌、雄基因池，找 到兩個雄性性別相關的RAPD標記。

發明內容
本發明的目的是提供一對鰱魚雄性特異性引物序列和一對對照管家基 因引物序列。
本發明的另外一個目的是提供一種能快速鑑別鰱魚幼苗性別的方法。 本發明的技術方案是，鰱魚DNA分子鑑定性別的特異性片段，其特 徵在於該特別片斷的序列命名為Hmmf。鰱魚幼苗DNA分子鑑別的雄性 特異引物，其特徵在於該引物是由Hmmf序列設計合成的，該引物序列命名為Hmmfl和Hmmf2，對照管家基因引物是通過在NCBI網絡搜索到 的鰱魚管家基因GAPDH設計合成的，其引物序列命名為Gapdhl和 G叩dh2。 一種鑑定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法，其特徵在於利用設 計的特異引物Hmmf 1和Hmmf2 ，以及對照管家基因GAPDH的引物Gapdhl 和Gapdh2，以鰱魚個'體基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為 25pl,反應組成為1U的TaqDNA聚合酶，2^1的dNTP， 100 200ng基因 組DNA，其中含雄性特異上下遊引物及管家基因上下遊引物各0.1拜ol/L， 在PCR儀上按下面的循環參數進行PCR擴增95t:預變性5min後，94 。C變性30sec， 6(TC退火30sec， 72'C延伸60sec共30個循環，最後72 。C延伸10min，擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在 凝膠成像系統下觀察並拍照記錄，100bpDNA ladder作分子量標記，該方 法中對照管家基因GAPDH的擴增帶在雌雄個體中均穩定存在，出現大小 為800bp目的條帶的是雄性個體，沒有條帶的即為雌性個體。本發明與現 有技術比較具有能對鰱魚幼苗進行性別鑑定且鑑別準確率高的顯著優點。


圖1為利用特異PCR法對性別特異片段的驗證結果。在雌雄10個個 體中，對照管家基因條帶在所有個體中清晰可見，證明PCR擴增程序沒有 問題。1， 2， 3， 4， 5泳道都出現了大小為800bp的擴增帶，均為雄性個 體；而6， 7， 8， 9， IO除管家基因外沒有擴增出任何條帶，均為雌性個體。 M為100bp梯度的DNA分子量標準。箭頭1所指為大小為800bp的雄性 特異條帶；箭頭2所指為對照基因條帶。
圖2為利用雄性特異引物和管家基因引物的鰱魚幼苗性別鑑定結果。 隨機選取13個鰱魚幼苗個體進行性別鑑定。其中l， 2， 3， 4， 5， 9， 10， 11八個個體的電泳帶上有一個800bp大小的條帶，為雄性個體；6， 7， 8， 11， 12五個個體在800bp位置上沒有條帶，為雌性個體。但管家基因條帶 在雌雄個體中都出現。M為100bp梯度的DNA分子量標準。箭頭1所指 為大小為800bp的雄性特異條帶；箭頭2所指為管家基因條帶。
具體實施例方式
雄性特異引物的獲得以及性別特異性的驗證性腺解剖鑑定性別後，提取雌雄個體基因組DNA，利用220條隨機引 物進行RAPD-PCR擴增，當使用到隨機引物S2107時，在雄性個體中擴增 出一個穩定的譜帶，該帶紋在雌性個體中不存在，通過克隆和測序獲得了 一段約800bp的雄性特異片段，命名為Hmmf (其DNA序列如表1)，該 片段屬非編碼序列，將該序列在Genebank上進行序列對比，未發現與之 同源的序列。該條帶艮'卩為鰱魚雄性特異條帶，測序後設計一對雄性特異引 物Hmmfl和Hmmf2，通過NCBI搜索鰱魚的GAPDH管家基因，設計一 對能作為PCR內部對照的引物Gapdhl和Gapdh2 (其DNA序列如表2)。 利用設計好的特異引物及對照基因引物在10個已知性別的個體中進行特 異PCR擴增，結果如圖l所示，在雌雄10個個體中，對照管家基因條帶 在所有個體中清晰可見，證明PCR擴增程序沒有問題，1， 2， 3， 4, 5均 為雄性個體，泳道都出現了大小為800bp的擴增帶；而6， 7， 8， 9， 10 均為雌性個體，除管家基因外沒有擴增出任何條帶，這表明本發明設計的 引物和方法能夠用於鰱魚性別的鑑定。
鰱魚幼苗性別的鑑別
將實驗魚斷尾取血少許(不超過0.5ml)，加至少兩倍的抗凝劑ACD， 400(h"pm離心10min，去上清；加入5ml裂解液及20嗎RNA酶，37。C溫 育3h;加蛋白酶K至終濃度10(Hig/Vl， 5(TC過夜。經酚~ ^酚*氯仿*異 戊醇~~ 氯仿'異戊醇依次抽提，無水乙醇沉澱，70%乙醇洗滌。乾燥後， 將鰱魚基因組DNA溶於TE或無菌雙蒸水中，分別編號。利用設計的雄性 特異引物和管家基因引物對13個未知性別鰱魚幼苗個體進行PCR擴增， 反應體系為25pl， lUTaq酶，2pl dNTP， 100~200ng基因組DNA，雄性特 異上下遊引物及管家基因上下遊引物各0.1pmOl/L。循環參數為95'C預變 性5min後，94。C變性30sec， 60。C退火30sec， 72。C延伸60sec共30個 循環，最後72。C延伸10min。擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化 乙錠染色，在凝膠成像系統下觀察並拍照記錄。如圖2發現對照基因 GAPDH的擴增帶在雌雄個體中均穩定存在，8個出現大小為800bp目的帶 的是雄性個體，其它5個沒有條帶的即為雌性個體。
以上均表明本發明設計的特異引物和方法能夠用於鰱魚幼苗雌雄性別
的鑑別。表1 .鰱魚雄性特異片段Hmmf序列
說明書第4/4頁
表2.鰱魚雄性特異性引物序列和管家基因引物序列
引物 序列
Hmmf 1: 5' TGCAGGTCGACGATTTCCCAGC3'
雄性特異性引物序列
Hmmf2: 5'CCATTTTCTTTCACCTCGCACC 3'
Gapdhl: 5'GCCTCCTGCACCACCAACTG3'
對照基因引物序列 ~~~~--
Gapdh2; 5， CGGAAGGCCATGCCGGTCAG3，
權利要求
1、鰱魚DNA分子鑑定性別的特異性片段，其特徵在於該特異性片斷的序列命名為Hmmf。
2、 鰱魚幼畝DNA分子鑑別的雄性特異引物，其特徵在於該引物是 由Hmmf序列設計合成的，該引物序列命名為Hmmfl和Hmmf2，對照管 家基因引物是通過在NCBI網絡搜索到的鰱魚管家基因GAPDH設計合成 的，其引物序列命名為Gapdhl和Gapdh2。
3、 一種鑑定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法，其特徵在於利用設計 的特異引物Hmmfl和Hmmf2，以及對照管家基因GAPDH的引物Gapdhl 和Gapdh2,以鰱魚個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25)il， 反應組成為1U的TaqDNA聚合酶，2pl的dNTP， 100 200ng基因組DNA， 其中含雄性特異上下遊引物及管家基因上下遊引物各0.1pmol/L，在PCR 儀上按下面的循環參數進行PCR擴增95。C預變性5min後，94"C變性 30sec， 6CTC退火30sec， 72"延伸60sec共30個循環，最後72°。延伸 10min，擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成 像系統下觀察並拍照記錄，100bp DNA ladder作分子量標記，該方法中對 照管家基因GAPDH的擴增帶在雌雄個體中均穩定存在，出現大小為800bp 目的條帶的是雄性個體，沒有條帶的即為雌性個體。
全文摘要
本發明公開了一種鑑定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法，屬於分子生物學領域，本發明的目的是提供鰱魚幼苗DNA性別的特異性片段和其雄性特異引物及鑑定鰱魚幼苗性別的方法。本發明的技術方案是，其特異性片段的序列為Hmmf1和Hmmf2。鑑定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法，利用設計的特異引物及對照管家基因GAPDH的引物以鰱魚個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25μl，在PCR儀上按30個循環參數進行PCR擴增，在凝膠成像系統下觀察並拍照記錄，100bp DNA ladder作分子量標記，出現大小為800bp目的條帶的是雄性個體，沒有條帶的即為雌性個體。本發明用於鰱魚幼苗性別鑑定。
文檔編號C12Q1/68GK101613750SQ20091006428
公開日2009年12月30日 申請日期2009年2月27日 優先權日2009年2月27日
發明者夏曉華, 常重傑, 杜啟豔, 王友利, 陳建軍 申請人:河南師範大學