利用高速逆流色譜法純化異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的方法

2023-11-10 16:44:57 3

專利名稱：利用高速逆流色譜法純化異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的方法
技術領域：
本發明涉及利用高速逆流色譜法純化異槲皮素和山萘酚-3-0-葡
萄糖苷的方法，主要用於從複雜的天然藥物提取物中分離和製備高純 度植物異槲皮素和山萘酚_3-O-葡萄糖苷化學對照品的製備。
背景技術：
近20年來發展起來的高速逆流色譜技術(High-speed counter—current chromatography, HSCCC)是——禾中沒有固態支撐體 的液一液分配色譜技術，以輕巧的聚四氟乙烯螺旋管作為分離柱，固 定相和流動相都是液態，螺旋管自轉的同時，繞一平行於自轉軸的外 部軸線做公轉運動，藉以獲得足夠強的離心力場，在兩相中的一相得 以保留的前提下，形成固定相與流動相的兩相分割趨勢和對流趨勢， 這種分割和對流的過程是連續進行的，如果把要分離的樣品從螺旋管 柱的入口注入，連續的分配傳遞過程就會在管柱裡進行，從而實現連 續的、高效的液一液分配過程。HSCCC分離效率高；操作簡單，樣品 不需嚴格的預處理；可從極複雜的粗製樣品中一步分離得到高純度的 組分；分析/分離粘度較高和易被固定相吸附的樣品方面具有明顯優 勢；可以分析/分離黃酮、生物鹼、醌類、類脂等小分子化合物，也 可分析/分離多肽、多糖、蛋白質等高分子化合物，適用範圍比較廣 泛；能夠明確表達中藥材這種複雜體系中不同批次間的差異，穩定性 和重現性好；其儀器及耗材完全國產化，成本明顯低於高效液相色譜。 隨著天然藥物的蓬勃發展HSCCC的主要研究領域集中於天然藥物的 分離純化，已從幾十種天然原料中分離得到數百種高純度的單體化合 物。非常適合於維藥化學對照品的製備。
維吾爾藥有著獨特的治病理念，是中國民族藥的重要組成部分， 但其應用基本局限在新疆自治區的範圍內，在全國範圍及世界各地的 推廣速度緩慢。導致這種情況的主要原因 一是生產工藝離現代醫藥 工業優質化生產要求還有很大差距；二是原藥材的主要活性成分是次 生代謝物，對後天的生長環境依賴性很強，原料藥來自天然，又多為 人工分散採收、加工，受天氣、地域差別及人為因素影響很大，原料、 中間體及最終產品離規範化、標準化管理還有很大差距，缺乏嚴格的 質量監控標準和良好的監控方法，很難保證產品質量的穩定性；三是
維藥產品的療效缺乏採用現代藥物臨床研究常用的"隨機分組"、"對 照"、"雙盲"、"多點觀察"等科學實驗方法獲得的科學數據說明，難 為現代醫學工作者和管理機構所信服。維藥現代化是維藥產業可持續 發展的根本出路。維藥原料和成藥(片劑、顆粒劑、口服液、注射劑) 的質量監控是維藥現代化進程中迫切需要解決的關鍵問題之一。而標 準對照品是質量監控的重要物質基礎，可供原藥材種植基地監控氣
候、地域、採收期及人為因素等對藥材質量的影響，指導種植；可供
成藥生產廠家指導藥材的合理勾兌，控制中間體及最終產品的質量，
建立相關企業標準；為指紋圖譜中重要指標成分的標定及譜效關係建 立提供基礎。
而無論是維吾爾藥還是中藥的研究與開發，都嚴重缺乏高純度的 標準對照品，這是制約標準制訂與實施的關鍵因素之一。目前國家質 量技術監督局正在建立各種國家實物標準，天然藥物的標準品是其中 的重要內容。
沙生蠟菊(Helichrysum arenium(L.) Moech.)是菊科 (Compositae)蠟菊屬植物，廣泛分布於中國新疆，中亞，歐洲等地， 為維吾爾醫常用藥材，在民間有悠久的歷史。據文獻報導沙生蠟菊有 利尿、保肝、抗病毒、抗氧化等活性，主要用於治療膽囊炎、膽結石。 為了更深入的了解沙生蠟菊物質作用基礎，我們對該植物全草提取物的化學成分進行了深入的研究。
我們針對化學對照品嚴重缺乏的問題，在已有的維吾爾藥藥效學 研究基礎上，採用近年來發展迅速的高速逆流色譜技術，同時製備異
槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷等兩種代表性化學成分的方法，並採 用該方法獲得了高純度(純度95%上)的異槲皮素和山萘酚-3-O-葡 萄糖苷的單體化合物；建立以高速逆流色譜為核心技術的標準對照品 製備平臺，為維藥化合物庫的建立及國家實物標準的申請打下基礎。

發明內容
本發明目的在於，提供一種利用高速逆流色譜法純化異槲皮素和 山萘酚-3-0-葡萄糖苷的方法，該方法是將分離溶劑系統置於分液漏 鬥中充分振搖後靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動相，取 沙生蠟菊提取物溶解於上相和下相的混合溶液中，再將固定相用泵灌 滿色譜分離柱，然後將柱的首端與進樣閥相接，待流動相開始流出色 譜柱時，收集分離物，將不同成分分別收集、濃縮、乾燥，分離得到 95%以上的異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的單體化合物。
本發明所述的一種利用高速逆流色譜法純化沙生辣菊異槲皮素 和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的方法，按下列步驟進行
a、 取沙生辣菊，粉碎後用70%乙醇回流提取3次，每次1-3小 時，合併提取液減壓濃縮成浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙 酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品；
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為1:1;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上 相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品溶於上層和下 層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使其主 機轉動，再將流動相泵入柱，再由進樣闊進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶劑，根據檢測器譜圖接收目標成分；
e、將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條 件為C18 column, 4.6mmL D. X 250mm， 5 u m，柱溫30°C，流動 相A甲醇；B0.2。/。甲酸；梯度洗脫程序0-50min, A:B 二25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml min一1 ，檢觀販長245 nm。
步驟d進樣量為10-500毫克。
步驟d異槲皮素的保留時間為200-240分鐘，山萘酚-3-0-葡萄 糖苷的保留時間為300-380分鐘。
使用的高速逆流色譜儀流速範圍為卜3ml/min，轉速範圍為 750-900轉數。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
本發明所述的利用高速逆流色譜法純化沙生辣菊異槲皮素和山 萘酚-3-0-葡萄糖苷的方法，為實現該方法本發明採取了以下設計方
樣品的製備沙生蠟菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回 流提取3次，每次l-3小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏(150g)， 用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮至幹，得乙酸 乙酯部分乾燥得到粗樣品110.08 g，該樣品用於HSCCC的分離。
溶劑系統的篩選取lmg粗樣品溶於2 ml溶劑系統中，連續震 蕩5分鐘，靜置，分層，分層時間少於30秒，分開兩相後置於試管 中，乾燥後重新溶解於lml甲醇中，通過HPLC對樣品進行分析，目 標化合物上相峰面積與下相峰面積的比值即為該化合物在兩相溶劑 中的分配係數(K)，溶劑系統為乙酸乙酯和水l:l (v/v)，目標化合 物異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的K在0. 5-3的範圍內，適合用 高速逆流色譜分離。
樣品溶液的製備將50毫克粗樣品溶於2ml等體積的上下相溶
液中，超聲使其溶解，濾去不溶物。
HSCCC分離過程首先用固定相充滿"色譜柱"，開啟逆流色譜
儀，轉數為800rpm/min，以1. 5 ml/min的流速注入流動相後，進2ml 樣品溶液。流出液通過紫外檢測器檢測，檢測波長254nm。根據峰型 手動收集流出液。
HPLC檢測HSCCC的原料和產品粗樣品和HSCCC分離得到的樣 品通過HPLC檢測，色譜條件為C18 column (4. 6腿I.D. X 250mm， 5um)，柱溫30°C，流動相:A (甲醇)；B (0.2%甲酸)；梯度洗脫程 序0-50min， A:B (25:75， v/v)到A:B (75:25， v/v)。流速1.0 ml min1 ，檢測波長245 nm。異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的 保留時間分別為22. 84min、 26. 58min。
HSCCC分離得到的單體通過MS、NMR鑑定結構。


圖1為本發明高速逆流色譜分離沙生蠟菊異槲皮素和山萘酚 -3_0-葡萄糖苷的圖，其中1為異槲皮素，2為山萘酚-3-0-葡萄糖苷。
圖2為本發明高效液相檢測異槲皮素圖，其中1為異槲皮素。 圖3為本發明該校液相檢測山萘酚-3-O-葡萄糖苷圖，其中2為 山萘酚-3-0-葡萄糖苷。
具體實施例方式
實施例1:
a、 取沙生辣菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回流提取3 次，每次1小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏150g，用水混懸，分 別用石油醚和乙酸乙酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品110.08 g;
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為1:1;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上
相作為固定相，下相作為流動相，取歩驟b提取粗樣品lOmg溶於2ml 上層和2ml下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固定 相，然後使其主機轉動，轉速範圍為750轉數，開始以lml/min流速 泵入流動相，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶劑，異 槲皮素的保留時間為200分鐘，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留時間為 300分鐘，根據檢測器譜圖接收目標成分，得到異槲皮素10. 1毫克、 山萘酚-3-0-葡萄糖苷6. 2毫克；
e、將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條 件為C18 column, 4.6腿1. D. X 250腿，5 p m，柱溫30°C，流動 相A甲醇；BO. 2%甲酸；梯度洗脫程序0-50min， A:B 二25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml min—1 ，檢測波長245 nm。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
實施例2
a、 取沙生辣菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回流提取3 次，每次2小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏150g，用水混懸，分 別用石油醚和乙酸乙酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品110.08 g;
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為l:l;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上 相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品50mg溶於3ml 上層和3ml下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固定 相，然後使其主機轉動，轉速範圍為800轉數，開始以2ml/min流速 泵入流動相，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶劑，異 槲皮素的保留時間為220分鐘，山萘酚-3-0-葡萄糖苷的保留時間為 320分鐘，根據檢測器譜圖接收目標成分，得到異槲皮素13.7毫克、
山萘酚-3-O-葡萄糖苷12. 5毫克；
e、將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條 件為C18 column, 4.6讓1. D. X 250mm， 5 P m，柱溫30℃，流動 相A甲醇；BO. 2%甲酸；梯度洗脫程序0-50min， A:B =25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml min—1 ，檢測波長245 nm。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
實施例3
a、 取沙生辣菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回流提取3 次，每次3小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏150g，用水混懸，分
別用石油醚和乙酸乙酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品110.08 g;
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為l:l;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上 相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品150mg溶於 5ml上層和5ml下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固 定相，然後使其主機轉動，轉速範圍為850轉數，開始以1.5ml/min 流速泵入流動相，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶 劑，異槲皮素的保留時間為210分鐘，山萘酚-3-0-葡萄糖苷的保留 時間為330分鐘，根據檢測器譜圖接收目標成分，得到異槲皮素53. 7 毫克、山萘酚-3-0-葡萄糖苷37.5毫克；
℃，流動 相A甲醇；B0.2Q/。甲酸；梯度洗脫程序0-50min， A:B =25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml mirf1 ，檢測波長245 nm。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
實施例4
a、 取沙生辣菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回流提取3 次，每次2.5小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏150g，用水混懸， 分別用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品110.08 g;
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為1:1;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上 相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品250mg溶於 7ml上層和7ml下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固 定相，然後使其主機轉動，轉速範圍為820轉數，開始以2.5ml/min 流速泵入流動相，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶 劑，異槲皮素的保留時間為240分鐘，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留 時間為360分鐘，根據檢測器譜圖接收目標成分，得到異槲皮素90. 7 毫克、山萘酚-3-0-葡萄糖苷61.5毫克；
e、 將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條 件為C18 column, 4.6腿1. D. X 250腿，5um，柱溫30°C，流動 相A甲醇；B0.2。/。甲酸；梯度洗脫程序0-50min， A:B 二25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml min—1 ，檢測波長245 nm。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
實施例5
a、 取沙生辣菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回流提取3 次，每次2小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏150g，用水混懸，分 別用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品110.08 g;
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為1:1;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上
相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品400mg溶於 8ml上層和8ml下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固 定相，然後使其主機轉動，轉速範圍為880轉數，開始以2.ml/min 流速泵入流動相，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶 劑；異槲皮素的保留時間為230分鐘，！l!萘酚-3-0-葡萄糖苷的保留 時間為380分鐘，根據檢測器譜圖接收目標成分，得到異槲皮素140 毫克、山萘酚-3-0-葡萄糖苷95毫克；
e、 將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條 件為C18 column, 4.6腿1. D. X 250mm， 5 u m，柱溫3CTC，流動 相A甲醇；B0.2。/。甲酸；梯度洗脫程序0-50min， A:B =25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml min1 ，檢測波長245 nm。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
實施例6
a、 取沙生辣菊全草500g (乾重)，粉碎後用70%乙醇回流提取3 次，每次3小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏150g，用水混懸，分 別用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、 萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品110.08 g;
c、 採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水 組成，其體積比為1:1;
d、 將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上 相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品500mg溶於 10ml上層和10ml下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿 固定相，然後使其主機轉動，轉速範圍為900轉數，開始以3ml/min 流速泵入流動相，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶 劑，異槲皮素的保留時間為240分鐘，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留 時間為380分鐘，根據檢測器譜圖接收目標成分，得到異槲皮素150 毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷100.5毫克；
e、將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條 件為C18 column, 4.6mml. D. X 250,， 5um，柱溫30°C，流動 相A甲醇；B0.2。/。甲酸;梯度洗脫程序0-50min， A:B 二25-75:75-25 v/v，流速1.0 ml mirf1 ，檢測波長245 nm。
本方法適用於對含有異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的任意一 種植物的提取和前處理方法。
本發明提供了一種利用高速逆流色譜法(HSCCC)從天然產物粗 提取物中同時分離得到兩種化合物的方法，該方法主要用於在製備高 純度化學對照品和化學樣品的製備；具有高效、低成本、樣品無損失、 樣品分離量大等特點，所有未分離的組分均可回收用於進一步分離。
權利要求
1、一種利用高速逆流色譜法純化沙生辣菊異槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法，其特徵在於按下列步驟進行a、取沙生辣菊，粉碎後用70％乙醇回流提取3次，每次1-3小時，合併提取液減壓濃縮成浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取；b、萃取液濃縮至幹，得乙酸乙酯部分乾燥粗樣品；c、採用高速逆流色譜儀，色譜儀分離溶劑系統由乙酸乙酯和水組成，其體積比為1∶1；d、將溶劑系統配置於分液漏鬥中，充分振搖後靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動相，取步驟b提取粗樣品溶於上層和下層的混合溶劑中，使高速逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使其主機轉動，再將流動相泵入柱，再由進樣閥進入粗樣品溶於上層和下層的混合溶劑，根據檢測器譜圖接收目標成分；e、將高速逆流色譜分離得到的樣品利用高效液相檢測，色譜條件為C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱溫30℃，流動相A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脫程序0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速1.0ml min-1，檢測波長245nm。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟d進樣量為 10-500毫克。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟d異槲皮素的 保留時間為200-240分鐘，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留時間為 300-380分鐘。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於使用的高速逆流色 譜儀流速範圍為l-3ml/min，轉速範圍為750-900轉數。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於本方法適用於對含 有異槲皮素和山萘酚-3-0-葡萄糖苷的任意一種植物的提取和前處 理。
全文摘要
本發明涉及一種利用高速逆流色譜法純化異槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法，該方法是將分離溶劑系統乙酸乙酯和水組成，置於分液漏鬥中充分振搖後靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動相，取沙生蠟菊提取物溶解於上相和下相的混合溶液中，再將固定相用泵灌滿色譜分離柱，然後將柱的首端與進樣閥相接，待流動相開始流出色譜柱時，收集分離物，將不同成分分別收集、濃縮、乾燥，分離得到95％以上的異槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的單體化合物。
文檔編號B01D15/42GK101343300SQ200810072949
公開日2009年1月14日 申請日期2008年9月4日 優先權日2008年9月4日
發明者韜 吳, 阿不力米提·伊力, 阿吉艾克拜爾·艾薩 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所