一種用於螢光影像成像的碳點、製備方法及應用與流程
2023-11-07 19:01:02
本發明屬於生物碳點製備技術領域，具體涉及一種用於螢光影像成像的碳點、製備方法及應用。
背景技術：
碳點作為一種新生的納米材料，被廣泛應用於生物科學和臨床醫學中，尤其是其螢光性質，以及可以通過細胞的胞吞作用進入細胞的特性，碳點在細胞影像的方面的作用尤為突出。碳點在一定的範圍內具有激發依賴性，也就是，其發射波長隨著激發波長的紅移而紅移，這也是判斷其是否為碳點的條件之一。與其他螢光納米粒子相比，碳點具有低毒性、螢光性能穩定和生物形容性好等特點，這些特點也就意味著其更適合應用於生物科學以及臨床醫學方面。
目前碳點的合成方法種類繁多，有雷射燒蝕法、電化學法、水熱法、微波法和熱解法等，而水熱法合成碳點一般產率較高，而且製備工藝簡單，實驗設備要求低，是目前採用比較多的一種製備方法。
然而現有的碳點製備方法存在成本高、不環保或原料難以得到的缺陷，所以發展簡單易行、成本低廉，並且不汙染環境的碳點勢在必行。
技術實現要素：
本發明提供的一種用於螢光影像成像的碳點、製備方法及應用，解決了現有的碳點製備方法存在成本高、不環保或原料難以得到的問題。
本發明提供了一種用於螢光影像成像的碳點的製備方法，包括以下步驟：
步驟1，將4-羥乙基哌嗪乙磺酸、雙氧水和超純水按照2:1:8的質量比例混合均勻，得到原料混合物溶液；
步驟2，將所述原料混合物溶液置於高壓反應釜中，180℃加熱18-20h，得到反應混合物溶液；
步驟3，將反應混合物溶液置於透析袋中，其中，透析袋的截留分子量為500da，加入超純水，透析24-28h，然後將透析袋外面的溶液旋轉蒸發濃縮至除去水分，得到碳點粗油狀液體；
步驟4，將碳點粗油狀液體溶於等同質量的甲醇中後，經矽膠柱純化，得到純化液，然後將純化液旋轉蒸發濃縮至除去甲醇，得到純化油狀液體；
步驟5，向步驟4的純化油狀液體中加入甲醇，產生沉澱，然後離心，收集上清液，得到用於螢光影像成像的碳點。
優選的，上述用於螢光影像成像的碳點的製備方法中，步驟2中，高壓反應釜的壓力小於或等於3mpa。
優選的，上述用於螢光影像成像的碳點的製備方法中，步驟4中，矽膠柱純化的具體步驟為：將碳點粗油狀液體溶於等同質量的甲醇後，得到粗溶液；然後以甲醇作為展開劑過矽膠柱對粗溶液進行純化，得到純化液，其中矽膠柱中填充的是300目的矽膠，矽膠柱的外直徑為26mm，高度為10cm。
優選的，上述用於螢光影像成像的碳點的製備方法中，步驟5中加入的甲醇的體積是步驟3中的反應混合物溶液體積的10倍。
優選的，上述用於螢光影像成像的碳點的製備方法中，步驟5中離心的條件為4℃，5000g，5min。
本發明還提供了一種上述製備方法製備而成的用於螢光影像成像的碳點。
本發明還提供了一種上述碳點在細胞螢光影像成像中的應用。
本發明還提供了一種上述碳點作為腦部腫瘤的螢光探針的應用。
與現有技術相比，本發明的螢光碳點具有以下有益效果：
(1)利用生活中常見的材料，原料成本低廉，合成的工藝簡單，生物相容性好，可大量製備；
(2)此碳點水溶性好，在水中分散性好，適於用於細胞螢光影像成像，在生物科學和臨床醫學方面的前景非常廣闊；
(3)碳點本身的發射波長隨激發波長的紅移而紅移；
(4)現有碳點的尺寸較大，而本發明的碳點尺寸較小，直徑在2-3nm左右，並且可以輕鬆透過截留分子量為500da的透析袋，有望突破腦血屏障，作為腦部腫瘤的螢光探針。
附圖說明
圖1為碳點在透射電子顯微鏡下的整體形貌圖；
圖2為碳點粒徑分布的柱狀圖；
圖3為碳點的螢光光譜圖；
圖4為碳點的激發波長依賴性測試圖；
圖5為碳點在酵母細胞中的螢光影像圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明，但不應理解為本發明的限制。下列實施例中未註明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，由於不涉及發明點，故不對其步驟進行詳細描述。
當實施例給出數值範圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值範圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。
本發明提供的一種用於螢光影像成像的碳點，包括以下實施例：
實施例1
一種用於螢光影像成像的碳點，具體按照以下步驟製備：
步驟1，將2g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1g的雙氧水和8g的超純水混合均勻，得到原料混合物溶液；
步驟2，將5g原料混合物溶液置於高壓反應釜中，高壓反應釜的壓力小於或等於3mpa，180℃加熱18h，得到反應混合物溶液；
步驟3，將5ml反應混合物溶液置於透析袋中，其中，透析袋的截留分子量為500da，加入400ml的超純水，透析24h，然後將透析袋外面的溶液旋轉蒸發濃縮至除去水分，得到碳點粗油狀液體；
步驟4，將1g碳點粗溶於1g甲醇中後，得到粗溶液；然後以甲醇作為展開劑過矽膠柱對粗溶液進行純化，得到純化液，其中矽膠柱中填充的是300目的矽膠，矽膠柱的外直徑為26mm，高度為10cm；最後將純化液旋轉蒸發濃縮至除去甲醇，得到純化油狀液體。
步驟5，向步驟4的純化油狀液體中加入50ml甲醇，產生沉澱，然後離心，離心的條件為4℃，5000g，5min，收集上清液，以除去未反應的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，得到用於螢光影像成像的碳點，低溫避光保存備用。
實施例2
一種用於螢光影像成像的碳點，具體按照以下步驟製備：
步驟1，將4g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、2g的雙氧水和16g的超純水混合均勻，得到原料混合物溶液；
步驟2，將5g原料混合物溶液置於高壓反應釜中，高壓反應釜的壓力小於或等於3mpa，180℃加熱20h，得到反應混合物溶液；
步驟3，將5ml反應混合物溶液置於透析袋中，其中，透析袋的截留分子量為500da，加入400ml的超純水，透析26h，然後將透析袋外面的溶液旋轉蒸發濃縮至除去水分，得到碳點粗油狀液體；
步驟4，將1g碳點粗溶於1mg甲醇中後，得到粗溶液；然後以甲醇作為展開劑過矽膠柱對粗溶液進行純化，得到純化液，其中矽膠柱中填充的是300目的矽膠，矽膠柱的外直徑為26mm，高度為10cm；最後將純化液旋轉蒸發濃縮至除去甲醇，得到純化油狀液體。
步驟5，向步驟4的純化油狀液體中加入50ml甲醇，產生沉澱，然後離心，離心的條件為4℃，5000g，5min，收集上清液，以除去未反應的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，得到用於螢光影像成像的碳點，低溫避光保存備用。
需要說明的是，上述本發明的製備方法及實施例1-2中，製備的碳點可以直接將液體於4℃保存半年，或者凍幹成粉末後-20℃長期保存。
我們利用透射電子顯微鏡觀察製備而成的碳點，結果如圖1所示，由圖1可知，碳點的形狀均為球形，且碳點在水中分散性好。
測量不同碳點的顆粒直徑，碳點粒徑分布的柱狀圖如圖2所示，顆粒直徑在1-3nm之間，且2-3nm大小的碳點顆粒佔所有碳點顆粒的60％左右，在1-3nm之間，顆粒直徑均一，有望突破腦血屏障。
另外，我們在激發波長為370nm，發射波長為460nm的條件下，檢測碳點的螢光特性，結果如圖3所示，從圖3中可觀察到明顯的峰值，說明激發波長為370nm，發射波長為460nm的條件下，本發明的碳點呈現良好的螢光特性。
進一步的，我們分別在激發波長為320-430nm(激發波長間距為10nm)的條件下，測定碳點的螢光光譜，結果如圖4所示，由圖4可以看出，同其他碳點一樣，在激發光為320-430nm的範圍內，發射波長隨激發光的紅移而紅移，而且隨著激發光波長的紅移，螢光強度先增加後降低，在370nm激發下螢光強度最大且發射波長為460nm。
進一步的，為了驗證本發明提供的碳點能夠在細胞螢光影像成像中的應用，我們以酵母細胞為作用對象，具體步驟如下：
酵母菌在ypd培養基中30℃孵育17h，od600值調整到1，取1ml菌液離心收集酵母細胞，棄去上清，100μlypd培養基重懸酵母細胞，並加入碳點(碳點的終濃度為0.1mg/ml)，30℃繼續孵育6h，用pbs緩衝溶液清洗酵母細胞3次，制樣，得到待檢測酵母細胞，測螢光顯微鏡。
以370nm的紫外光為激發光，然後在顯微鏡下觀察待檢測酵母細胞的細胞形態和螢光散發情況，結果如圖5所示，從圖5我們可以看出，碳點可以成功的轉入酵母細胞中，並具有顯著的螢光效果，可以用於細胞影響檢測。
儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。
顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。