新肺炎病毒組合物及其使用方法

2023-11-07 11:05:47 2

專利名稱：新肺炎病毒組合物及其使用方法
技術領域：
本發明一般涉及病毒學領域，並且更特定是在包括犬和貓在內的哺乳動物中發現的副粘病毒(Paramyxoviridae)科,肺炎病毒(Pneumovirinae)亞科的新發現病毒。
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背景技術：
關在一起的家犬，如在收容所、犬舍或繁育基地中，經常受到急性呼吸道感染(犬窩咳)影響。該疾病快速傳播並難於消除，因為新動物會不斷引入。一系列試劑會產生多 個和順序重疊感染的複雜症候群，使診斷和治療困難。受影響犬的臨床徵兆從輕度乾咳和流鼻涕液到嚴重病例的肺炎和死亡。貓也被多種試劑感染，產生不同嚴重程度的呼吸窘迫。相同或相似病毒也能感染人。因此，當前且仍需要確定感染多種哺乳動物的試劑和發展用於診斷、預防和/或治療這種感染的組合物和方法。本發明滿足了這些需要。

發明內容
本發明基於新肺炎病毒的發現。所述病毒能感染不同類型的哺乳動物，包括但不必需限於犬、貓和可能的人。病毒的出現可與犬的急性呼吸疾病(ARDC)或貓呼吸疾病，或人或其他哺乳動物的呼吸或其他疾病正關聯。發明提供病毒的分離多核苷酸和蛋白以及分離病毒本身。發明包括檢測病毒的組合物和方法，以及預防和/或治療與病毒出現正相關的疾病徵兆的方法和組合物。也提供包括病毒的分離細胞。發明的病毒是負鏈RNA病毒。發明包括分尚負鏈,與負鏈反向互補的正鏈,RNA多核苷酸的DNA等價物，正鏈編碼的蛋白，以及多核苷酸和蛋白的片段。某些實施方式中，經分離病毒包含的負鏈多核苷酸含有序列SEQ IDNO: I或與SEQID NO: I序列至少96%相同的序列。也提供包含SEQ IDN0:2或SEQ ID NO: 3序列的分離多核苷酸，或具有與SEQ ID N0:2或3序列至少96%相同的序列的多核苷酸。發明提供刺激哺乳動物免疫反應的方法。刺激免疫反應可以是細胞介導，體液或其結合，並能對動物提供預防和/或治療益處。刺激免疫反應的方法包括給予哺乳動物包括本文所述多核苷酸和/或病毒，本文所公開病毒多核苷酸編碼的病毒蛋白，所述蛋白的片段或其組合的組合物。多核苷酸，病毒和/或蛋白和/或其片段能從任何合適來源分離，或能用熟知技術重組生成。發明提供檢測哺乳動物所得生物樣品中病毒出現的方法。所述方法包括從哺乳動物獲得生物樣品並從生物樣品中檢測病毒包括的多核苷酸序列，或病毒蛋白或其片段。多核苷酸、蛋白、蛋白片段或其組合的出現指示哺乳動物被病毒感染。附圖
簡要說明
圖I.使用人類呼吸道合胞病毒特異性單克隆抗體(Mab)的A72細胞免疫螢光分析。A)感染細胞上的Mab 2G122。B)未感染細胞上的Mab2G122。C)感染細胞上的Mab5H5N。D)未感染細胞上的Mab 5H5N。從生產商獲得的初級Mab儲液以1:100稀釋使用。紅色背景通過用伊文思藍復染產生。圖2.免疫螢光分析顯示定向用於感染和未感染犬A72細胞的非呼吸相關測試的隨機選定犬血清的反應性。A)1:320稀釋的感染細胞血清。B) 1:320稀釋的未感染細胞血清。紅色背景由用伊文思藍復染生成。圖3.包括SEQ ID NO: I序列的病毒基因組構成的圖示。發明描述本發明提供新型分離病毒，分離的病毒多核苷酸和蛋白，檢測病毒的組合物和方法，和預防和/或治療哺乳動物中與病毒出現正相關的疾病徵兆的組合物和方法。 發明的病毒是負鏈RNA病毒。因此，病毒顆粒中包裝的遺傳材料是與正鏈反向互補的單鏈RNA。由RNA依賴的RNA聚合酶從負鏈轉錄生成正鏈。正鏈至少有部分mRNA功能，因為由正鏈編碼的病毒蛋白在感染細胞的細胞質中翻譯，並且之後參與新病毒顆粒的組裝和負鏈基因組的包裝。在某些實施方式中，發明提供分離的病毒包括含有序列SEQ ID NO: I或與SEQ IDNO: I序列至少96%相同序列的負鏈多核苷酸。發明也提供與負鏈互補的多核苷酸。在某些實施方式中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4所示序列，或與SEQ ID NO:4至少96%相同的序列。也提供分離多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO: I序列或與SEQ ID NO: I序列至少96%相同的序列，或包括SEQ ID N0:4序列或與SEQ ID N0:4序列至少96%相同的序列。也提供包括SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3序列的多核苷酸，或具有與SEQ ID NO:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸。也提供與所述序列和與反向互補物至少96%相同序列的反向互補序列。本文公開的所有這些多核苷酸和蛋白和其片段的結合也包括在發明中。能鑑定發明提供的病毒多核苷酸，其功能在於支持活病毒複製(包括減毒病毒)。也提供包括病毒的細胞。在多個實施方式中，包括病毒的細胞是分離細胞，或體外增殖以使病毒減毒的細胞，和/或用於疫苗或其他目的的病毒來源。因此，包括病毒的分離細胞，包括病毒的細胞培養物和/或細胞系，細胞培養基中出現的病毒和/或病毒產物，和包括病毒的分離組織都是發明的各個方面。在特定實施方式中，提供本發明所述各RNA序列的DNA等價物。因此，發明包括本文所述各RNA序列，其中RNA中的每個U (尿嘧啶)被T (胸腺嘧啶)取代。本發明所述的每個病毒多核苷酸包括與各多核苷酸指定SEQ ID NO中所存在序列相同的多核苷酸，並且還包括與病毒SEQ IDNO中所存在序列至少96%相同的所有多核苷酸。在特定實施方式中，與序列表所示多核苷酸序列至少96%相同的多核苷酸與那些跨其全長的序列至少96%相同。不希望受任何特定理論的束縛，認為本文出現和包括那些與序列表所列病毒多核苷酸序列有至少96%相同的多核苷酸序列與相關病毒例如已知感染鼠哺乳動物的病毒所含多核苷酸不同。不希望受任何特異理論的束縛，還認為病毒的減毒，例如連續傳代，能產生包括和/或轉錄與序列表所示序列至少96%相同的多核苷酸的病毒。與序列表中特定引用序列不同的序列可與所示序列有96. 0%-99. 9%相同，包括其間到第一小數點的所有整數。96. 0%-100%序列相同性的所有範圍(含端值)也是發明的實施方式。
多核苷酸的片段也包括在本發明中。因此，在多個實施方式中，每個病毒多核苷酸(包括反向互補物和其DNA等價物)包括多核苷酸片段，長度從10個核苷酸到多核苷酸的全長，並包括其間所有整數。例如，本發明包含多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID N0:1序列且包含其序列所有片段，包含10個核苷酸長度到多至8，598個核苷酸長度，並且包含其間所有整數。本發明提供的多核苷酸，無論是否在病毒顆粒中出現，可以比本文所述那些更長，因為所示序列可能不包含完整病毒基因組序列和/或反向互補物和/或其DNA等價物。發明也提供刺激哺乳動物免疫反應的方法。經刺激免疫反應是能提供動物預防和/或治療益處的免疫反應。經刺激免疫反應可以是體液和/或細胞介導的免疫反應。經刺激免疫反應能針對病毒編碼的任何抗原和/或免疫原。因此，完整病毒顆粒，每個病毒蛋白，和病毒蛋白片段是能用於在哺乳動物中刺激免疫反應的本發明實施方式。在多種實施方式中，刺激免疫反應的動物是家犬(Canis familiaris)或家貓(Felis catus),即分別是馴養的犬或貓。在特定實施方式中，用於刺激犬免疫反應的多核苷酸包含SEQ IDN0:1序列或與·SEQ ID NO: I序列至少96%相同的序列，或其編碼蛋白或蛋白片段，或SEQ ID N0:1反向互補序列編碼的病毒顆粒。包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3的序列的多核苷酸，或具有與SEQ ID N0:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸，或由SEQ ID N0:2或3反向互補序列編碼的蛋白或蛋白片段或病毒蛋白，或具有與SEQ ID N0:2或3反向互補序列至少96%相同序列的多核苷酸，優選用於刺激貓的免疫反應。所述序列、蛋白、蛋白片段、和病毒顆粒與犬和貓的相同關係用於使用診斷目的的組合物，但是這並不以任何方式消除將本發明實施到其他哺乳動物上的適用性，包括人。刺激免疫反應的方法包括將含有本文所述病毒、本文所公開病毒多核苷酸編碼的病毒蛋白、所述蛋白片段或其組合的組合物給予哺乳動物。病毒和/或蛋白和/或其片段能從任何合適來源分離，或能用熟知技術重組生成。在多種實施方式中，發明提供的用於疫苗的病毒蛋白包括但不必要限於吧-1、吧-2、隊？、釐、5!1、6^2-1、釐2-2、1^蛋白和其組合。編碼這些蛋白的所有核苷序列包括在發明中，並且能由本領域技術人員用常規技術測定。給予發明合成物的哺乳動物能是任何有風險、懷疑有、或已經診斷出病症的哺乳動物，所述病症與一個或多個肺炎病毒的出現正相關，包括但不必需限於本文公開的病毒。在一個實施方式中，動物是有風險、懷疑患有、或者已診斷有ARDC的犬。在另一個實施方式中，哺乳動物是有風險、懷疑患有或診斷有呼吸疾病或任何其他與本文所述病毒正相關的疾病的人。這方面，本領域已知涉及本文所述新發現病毒的病毒，例如鼠肺炎病毒，能造成人的廣泛感染(例如，參見Pringle CR, Eglin RP. , Murine pneumoniavirus: seroepidemiological evidence of widespread human infection (〈〈鼠月市炎病毒廣泛人際感染的血清流行病學證據》).J Gen Virol. 1986年6月；67(Pt 6) :975-82)。因此，有理由認為當前提供的組合物和方法有刺激人免疫反應的實用性和診斷人中病毒感染的應用。將發明組合物即疫苗給予動物能產生預防效果，意味著接受疫苗的動物中感染的可能性低於沒有疫苗的動物更低，或動物中與病毒出現正相關的疾病徵兆比沒有接受疫苗動物更輕。給予本發明疫苗也能有治療效果，意味著感染程度(如病毒負荷或效價和/或其他本領域技術人員已知的感染程度標記)在感染並接受疫苗後的動物中相對於感染但沒有接受疫苗的動物更低。類似地，感染並接受疫苗的動物中與動物病毒出現正相關的疾病徵兆比沒有接受疫苗的動物更輕。本文所述病毒和/或蛋白和多核苷酸能分離，意味著其從自然環境中去除，例如從動物和/或獲自動物的生物樣品中分離病毒。在一個實施方式中，包括本文所述病毒的分離細胞視作包括分離病毒。此外，本發明的分離病毒和/或蛋白和/或其片段和/或分離和/或重組多核苷酸能純化成任何所需純化程度。發明提供的組合物可以包含病毒、病毒蛋白、其片段和/或多核苷酸、多核苷酸片段和/或其組合，由其組成或主要由其組成。在一個實施方式中，方法包括將包括含SEQ ID NO: I序列的多核苷酸或具有與SEQID NO: I序列至少96%相同序列的多核苷酸的組合物給予犬，從而在犬中刺激針對病毒的免疫反應。在一個實施方式中，多核苷酸作為DNA疫苗給予。製作、配製含DNA疫苗的藥物組合物和給予含DNA疫苗的組合物的方法為本領域已知。在一個實施方式中，給予犬的多核苷酸在病毒顆粒中出現。病毒顆粒能分離和/或重組。在多個實施方式中，給予犬的病毒包括含某一胺基酸序列的蛋白，所述胺基酸序列是病毒顆粒所包括的部分蛋白。由病毒基因組編碼的病毒顆粒所含病毒蛋白的預測胺基酸序列包括犬病毒蛋白NS I，非結構蛋白 I (SEQ ID N0:7)，NS2，非結構蛋白 2 (SEQ ID N0:8)，N，核蛋白(SEQ ID N0:9)，P，磷蛋白(SEQ ID NO: 10)，M，基質蛋白(SEQ ID NO: 11)，SH，小疏水蛋白(SEQ ID NO: 12)，G，附著蛋白(SEQ ID N0:13)，F，融合蛋白(SEQ ID NO: 14)，M2，基質蛋白 M2-1 (SEQ ID 勵15)和] 2-2(SEQ ID NO: 16)，L，RNA依賴性RNA聚合酶，其中部分序列已提供(SEQ ID NO: 17)。發明也提供這些蛋白的貓病毒形式。在另一個實施方式中，所述方法包括給予貓組合物，所述組合物包括含SEQ IDN0:2和/或SEQ ID NO:3序列的多核苷酸、或具有與SEQ IDN0:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸，從而在貓中刺激針對病毒的免疫反應。在一個實施方式中，給予貓的多核苷酸在病毒顆粒中出現。所述顆粒能分離和/或重組。在多個實施方式中，給予貓的病毒包括含選自SEQ ID N0:5或SEQ IDN0:6的胺基酸序列的蛋白。在某些實施方式中，本發明包括能針對本文所公開病毒感染提供預防和/或治療效果的疫苗。所述疫苗能包括活或死(失活)病毒或其片段。死病毒是不能複製的病毒。死疫苗能用任何本領域技術人員熟知的多種技術製備，包括但不限於熱滅活和病毒蛋白和/或核酸的修飾，方法包括但不必需限於接觸多聚甲醛，福馬林和紫外光。例如，病毒蛋白能共價修飾，如通過能修飾病毒蛋白的交聯劑以防止病毒細胞進入和/或複製所需的一個或多個步驟。認為活病毒包括減毒病毒。減毒病毒是相對於未減毒形式毒力降低的病毒。因此，減毒病毒能複製，但僅相對於同一類型的未減毒病毒變慢，並且因此一般不致病。本領域的技術人員應識別未減毒，減毒和死病毒之間的這些和其他區別，從而能互相區分。減毒病毒能用任何標準技術得到。在一個實施方式中，病毒通過連續傳代哺乳動物細胞培養物來減毒。連續傳代能通過許多機理引起減毒。支持病毒複製的任何細胞包括但不限於人細胞，能用於以病毒增殖和/或減毒為目的的傳代。在多個非限定實施例中，傳代的細胞培養物能獲自或衍生自犬或貓，例如分別來自家犬或家貓。在一個實施方式中，細胞是初級細胞培養物。在一個實施方式中，細胞包括犬衍生的A-72細胞系，其美國典型培養物保藏中心(ATCC)的產品號是CRL-1542。適合病毒減毒的任何傳代數目都能使用。根據本公開的優勢，本領域技術人員能決定病毒減毒的傳代參數。一般說，可以使用5-150，包括其間所有整數，並優選20-50傳代。包括病毒的組合物能作為疫苗用途的藥物製品提供。包括病毒的組合物能製備成懸浮液或凍幹形式，並能另外包括所述組合物通常使用的藥學上可接受載體和/或稀釋齊U。適用於發明的載體和稀釋劑的一些示例參見Remington:The Science and Practiceof Pharmacy (《雷明登藥物的科學和實踐》)(2005)第21版，賓夕法尼亞州費拉德爾菲亞，Lippincott Williams和Wilkins。載體的特定非限制性示例包括穩定劑，防腐劑和緩衝液。穩定劑的特定非限制性示例包括糖(如山梨糖醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、右旋糖苷、穀氨酸或葡萄糖)，蛋白(如奶粉血清、清蛋白或酪蛋白)或其降解產物。合適緩衝液的特定非限制性示例包括鹼金屬磷酸鹽。合適防腐劑的特定非限制性示例是硫柳汞、硫柳汞和慶大黴素。合適稀釋劑的特定非限制性示例包括水，水性緩衝液(如緩衝鹽水)，乙醇和多元醇(如甘油)。本領域技術人員會認識到本文提供疫苗製品能包括有佐劑活性的一種或多種化 合物。合適佐劑包括但不必需限於弗氏不完全佐劑，蘇氨醯胞壁醯二肽，氫氧化鋁，-磷酸鹽或-氧化物，水包油或油包水乳液，基於例如礦物油或植物油如維生素E醋酸酯和皂苷。本發明提供的疫苗能通過任何合適途徑給予。在多種實施方式中，疫苗能通過胃腸外、肌肉內或皮下、靜脈內或口服給予，包括但不必需限於經鼻給予。本領域技術人員會認識到疫苗的有效劑量能用正常考慮因素確定，例如需要刺激免疫反應的動物類型，大小，年齡，環境，感染風險或階段。一般說，根據發明的活疫苗能以每隻動物IO1-IO6噬斑形成單位(pfu)的劑量給藥,例如Iml劑量。滅活疫苗可以包括每個動物IO6-IOuiPfu的抗原等價物。發明的多核苷酸可以修飾成攜帶一個或多個異源基因，例如不僅針對本文所公開病毒，也對其他相關或不相關病毒和/或其他感染原提供免疫。同樣，本文提供的免疫製劑也能包括旨在針對與本文公開病毒不同的感染原刺激免疫反應的免疫原性試劑。因此，發明包括用於不同哺乳動物和針對不同感染原的疫苗組合。疫苗組合能包括含所有或部分本文公開病毒蛋白的融合蛋白，和能含有來自其他蛋白多肽序列的融合蛋白以提供對不同感染原有效的多價疫苗。發明還包括給予其他能提供動物有益效果的組合物，其能在所述感染的傳統治療之前、同時或之後給藥。發明也提供檢測本文公開病毒的方法。所述方法包括從動物獲得生物樣品和檢測樣品中和樣品來源的病毒蛋白和/或病毒多核苷酸的存在。任何病毒多核苷酸和蛋白能用於檢測有或沒有病毒的方法。認為檢測SEQ IDN0:1、2或3的反向互補物或DNA等價物與檢測多核苷酸相同，所述多核苷酸包括SEQ ID NO: 1、2或3序列或與任何這些序列至少96%相同的序列。檢測能用獲自需要診斷的哺乳動物的任何合適生物樣品進行。生物樣品的合適來源包括但不限於血液、黏膜刮片、組織活檢或唾液。在一個實施方式中，生物樣品包括鼻和/或咽部拭子或氣管灌洗液。可以使用本領域熟知的多種技術測試DNA、RNA或蛋白來檢測有或沒有病毒。在某些實施方式中，通過檢測包括全部或部分病毒基因組的多核苷酸，或從全部或部分病毒基因組擴增的多核苷酸來測定病毒的存在。這方面，通過鑑定來自病毒負鏈、病毒正鏈或其組合的多核苷酸序列，發明包括測定病毒存在(或缺失)。發明還包括檢測病毒負鏈，病毒正鏈或其組合的DNA形式。例如，在一個實施方式中，逆轉錄酶聚合酶鏈反應能用於生成病毒負鏈或其部分的DNA拷貝，並且DNA拷貝能用作病毒基因組擴增的模板以獲得在雜交雙鏈體中包括正鏈和負鏈或其部分的DNA形式的多個雙鏈DNA分子。本領域技術人員應理解有多種擴增技術能增加遺傳物質的數量以用於確定病毒是否或曾經在感興趣生物樣品中，並且擴增(沒有擴增)的遺傳物質能用很多檢測多核苷酸序列的熟知技術和試劑分析。因此，發明包括任何和所有從生物樣品中獲得和分析核酸的方法，從而能確定有或沒有病毒多核苷酸，包括但不限於那些涉及通過核酸和/或其他類型探針的雜交，和通過使用任何已知測序技術測定病毒多核苷酸序列來檢測多核苷酸的方法。可測定所有或部分序列並用於鑑定病毒多核苷酸。在某些實施方式中，發明提供包括用於核酸雜交和/或擴增的分離病毒多核苷酸和成分的組合物。因此，所述組成物可額外包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、游離核苷三磷酸、鹽、緩衝液和其他通常用於雜交和/或擴增核酸的試劑。在一個實施方式中，發明提供分離病毒多核苷酸和/或從病毒多核苷酸擴增的多核苷酸，其中所述病毒多核苷酸和/或從病毒多核苷酸擴增的多核苷酸與一個或多個用於實時核酸擴增技術的擴增引物和檢測探針 雜父。發明還提供分離病毒多核苷酸和/或從病毒多核苷酸擴增的多核苷酸，其中所述多核苷酸與陣列中存在的至少一個探針雜交。例如，陣列可以存在於用以檢測多種不同多核苷酸存在與缺失的晶片上。所述晶片市售可得並且能定製檢測基本上任何多核苷酸的存在與缺失。在多種實施方式中，發明還包括有形介質中固定檢測哺乳動物是否已經被本文公開的病毒感染。有形介質能是任何類型的有形介質，例如任何類型數字媒介，包括但不限於能存儲於計算機、DVD、CD-R0M或電子郵件的數位化文件。有形介質能提供給醫療服務人員以發展用於已感染哺乳動物的治療方案。本領域技術人員會認識到根據本發明的優勢，能生成多種試劑並用於檢測本文公開病毒的診斷方法。例如，多克隆或單克隆抗體能用病毒顆粒或病毒顆粒部分、或分離或重組病毒蛋白或其片段生成。因此，抗體可製備成特異性識別任何病毒蛋白中存在的任何抗原決定簇。在多種實施方式中，抗體識別NS-I、NS-2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L病毒蛋白或部分或其組合。期望生成的抗體能區分本發明病毒和其他相關病毒，例如MPV。抗體能用於任何技術，因此能測定生物樣品中或來自生物樣品的病毒抗原的存在與缺失。所述技術包括但不限於Western印跡、免疫螢光、免疫組織化學和基於珠的ELISA分析或傳統蛋白陣列。在一個實施方式中，發明提供在抗體複合物中出現的分離和/或重組病毒或病毒蛋白。以下實施例旨在說明本發明特定實施方式，但不應以任何方式對本發明構成限制。實施例I從混種犬的鼻和咽部拭子獲得樣品並且用於接種犬A72細胞(美國典型培養物保藏中心，CRL-1542)培養物以分離呼吸道病毒。在對應於接種後約21天的傳代培養後期，一些培養物顯示細微細胞病性改變。持續傳代後，培養物顯示細胞變圓的小灶點，隨後整個培養物中細胞快速死亡。所述模式主觀評定為非特性的ARDC常見相關病毒。獲得十三例個體病毒分離物並且在本實施例中描述。用普通犬呼吸道病毒特異性診斷試劑組的檢測未能鑑定出已知病毒。用針對其他病毒的附加試劑進一步測試使用人呼吸道合胞病毒的單克隆抗體(Mab)庫(抗HRSV，編號VP-R151，美國加利福尼亞州伯林格姆的載體實驗室(VectorLaboratories))通過免疫螢光分析(IFA)最終揭示正識別。所述抗體製品通常用於我們實驗室中以檢測牛RSV (BRSV)。染色模式包括絲狀膜結合和自由漂浮病毒顆粒和胞質包含體，這是通常在RSV感染細胞中觀察到的模式。根據初始IFA結果，我們試圖使用基於人、牛和綿羊RSV序列比對設計的PCR引物從病毒中擴增核衣殼基因(N)片段。這未成功。抗RSV庫中單獨Mab的存儲和其特異性從生產商獲得並用於IFA (圖I)。用Mab5H5N (M2蛋白特異)染色顯示病毒顆粒和包含體。Mab 2G122 (P蛋白特異)主要染色包含體並給出相對一致的膜相關信號。沒有獲得Mabs 1C3 (N蛋白特異)或5A6 (F蛋白特異)染色。所有四個單獨Mab通過IFA識別BRSV。4個Mab中只有2個識別犬病毒不能擴增RSV基因組保守區域這與RSV有關，但不是典型形式。通過使用C0DEH0P算法基於高度保守胺基酸(aa)序列簡併PCR引物。定位L (聚合酶)和N基因中的特異性區域。反應產物測序和BLAST分析揭示該病毒與傳統稱為小鼠肺炎病毒(或肺炎病毒)的鼠肺炎病毒(MPV)密切相關。發現兩個L基因PCR產物與MPV有95%-97%相同並且N基因片段有約96%相同。為解決是否新鑑定肺炎病毒限於所測試收容所犬的問題，我們隨機篩選犬血清樣品並發現27例動物中的6例有特異性識別感染培養物中病毒的抗體。染色模式與Mab觀察到的類似(圖2)。包含可變量的BRSV中和抗體的牛血清沒有染色受犬病毒感染的細胞。本實施例顯示從13例有ARDC的狗分離的病毒似乎與MPV密切相關，並且因此我們認為其為犬肺炎病毒(CnPnV)。鼠肺炎病毒是分類在副粘病毒科肺炎病毒亞科肺炎病毒屬的僅有三個病毒種之一。人RSV是模式種並與BRSV密切相關，而MPV相關性更遠。例如，人和牛RSV的N蛋白核苷序列互相有約94%相同，但對MPV只有60%相同。只有兩個完全測序的MPV菌株「株15」和J3666，並且在核苷水平有99. 7%相同。CnPnV與ARDC的關聯在一些病例中有致病性，特別當涉及複雜病因時。通過類比，MPV通常已知感染實驗室齧齒動物群落並且血清學證據指出感染幾個野生齧齒動物種但對自然生態知之甚少。事實上，不清楚齧齒動物是否是唯一 MPV宿主或如果密切相關，病毒可以在其他物種循環。已經報導了與呼吸道症狀相關的人感染證據(Pringle CR等，J GenVirol. 1986 ;67:975_82)。本質上，齧齒動物感染可以是亞臨床或潛伏。實驗室小鼠臨床徵兆可從無症狀變化到發展為有高發病率和死亡率的肺水腫。包括J3666和株15在內的致病株，能產生嚴重肺炎並在低劑量接種後6-10天死亡。致病性或其缺失可依賴於病毒和小鼠品系。多個細菌和病毒劑能涉及犬呼吸道疾病。因此認為CnPnV是另一個能引起上呼吸道防護機理受損的事件順序，造成更嚴重疾病的的試劑。實施例2本實施例所述的材料和方法用於獲得其他實施例所述結果。病毒分離
使用溼拭子從有呼吸道疾病徵兆的混種狗收集鼻和咽樣品，並且在康奈爾大學動物健康診斷中心收到24小時內進行處理。接種前，拭子浸入3ml有厄爾(Earle)鹽的極限必需培養基(吉布可(Gibco) 10370,美國加州卡爾斯巴德的英傑公司(Invitrogen) ),0. 5%牛血清白蛋白，青黴素(200U/ml),鏈黴素(200μ g/ml)和兩性黴素B(Fungizone)(2. 5 μ g/ml)中30分鐘並且然後機械攪拌10秒。合併各O. 5ml的等分鼻和咽部拭子提取物的，並用於接種沒有其他培養基的半融合A72細胞的單獨T25燒瓶(Binn等，1980) (CRL-1542，美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)。使提取物保持單層1-3小時然後用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)衝洗。細胞於37oC維持在6ml培養基(Leibovitz L15培養基，10%熱滅活胎牛血清(FBS )，200U/ml青黴素，200 μ g/ml鏈黴素，50 μ g/ml慶大黴素)中，並且每
6-8天進行繼代培養。未接種對照A72培養物在分離過程中平行進行。免疫螢光分析
細胞附於載玻片，然後用PBS衝洗並在冷丙酮中固定10分鐘。載玻片在空氣中乾燥並在染色前於-20° C保存。在PBS中稀釋的初級和二級抗體用於載玻片並且37° C孵育30分鐘。每個孵育中，載玻片用PBS衝洗15分鐘。染色用螢光顯微鏡觀察。針對HRSV的Mab庫在1:400稀釋下用於初始鑑定(VP-R151，美國加利福尼亞州伯林格姆的載體實驗室)。以IX濃度提供的小鼠抗PVM (CL-603IFA，麻薩諸塞州威爾明頓的查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories))在1:20稀釋下使用。二抗FITC標記山羊抗小鼠IgG(02-18-06，KPL，美國馬裡蘭州蓋瑟斯堡)在1:40 (12. 5 μ g/ml)稀釋下使用。RNA 純化總細胞RNA從A72細胞(74106，美國加州瓦倫西亞的凱傑公司(Qiagen))中純化。從一個顯示約50-75%細胞病變效應(CPE)的感染25cm2燒瓶收集細胞並經各柱純化。包括拭子洗脫液的無細胞上清液和培養基用140 μ I樣品純化(52906，凱傑公司)。純化的RNA重懸於40 μ I無RNase的水中。PCR起始用於獲得基因組片段的簡併引物序列是基於肺炎病毒亞科病毒的比對，並用 C0DEH0P 算法設計(blocks, fhcrc. org/codehop. html) (Rose 等，1998)。逆轉錄 PCR(RT-PCR)根據生產商說明以25 μ I體積用一步反應(210212，凱傑公司)完成。每一個反應使用1:5-1:10稀釋的Iyl總RNA和10皮摩爾的各引物。RT步驟的反應條件是在50° C 30分鐘，然後95° C 15分鐘。循環條件是95° C 60秒，54-56° C 30秒，和72。C 60-90 秒，共 35 個循環。N 基因的引物組N276F, tccgtgcaggccgaratggarcarg/PlR, (SEQ ID NO:35) ggaactcgggggcgaayttytccat ；SEQ ID NO:36) ;L 基因號 I :L428F，ccggatcttcggccayccnatggt/SEQ ID NO:37) L538R, ttcttaggaggggagatggcyttrtcrtt ；SEQ ID NO:38)L 基因號 2 :L698F, catcaccgacctgtccaagttyaaycargc/SEQ ID NO:39)L894R, ttgaagtcgtccaggatggtrttdatcca SEQ ID NO:40。兩個用於來自多個地理位置的拭子樣品的PCR引物組基於CnPnV，MPV J3666和菌株15序列比對而設計。G蛋白G715F, ggcttctgtttcttcctttctgg/SEQ ID NO: 41 )G1062R, ccgtggtggtgcctgtgSEQ ID NO:42) ；SH1 蛋白SH1F, atggatcctaacatgacctcayacSEQ ID NO:43) /SH187R,gattgggatgaacygtgcattg SEQ ID N0:44)。用於擴增低傳代 Brne 分離物的引物G84F,tgtaaaagtgaaccaaatgtgta SEQ ID NO:45) /G404R, aaatcttcaggtaaatcaggtc SEQ IDNO:46) ；G849F, ttttaacaacaagaatcagtc SEQ ID NO:47) /G1048R, ctcctaggtgcgggggttggSEQ IDN0:48)。用於G和SH擴增子的反應條件是RT在50° C 30分鐘，滅活/變性在95° C15分鐘，和PCR在95° C 60秒，54° C 30秒和72° C 90秒，共35個循環。基因組分析PCR產物用康奈爾大學測序和基因型核心實驗室的應用生物系統自動3730DNA分析儀測序。用於檢測完全序列的引物是基於MPV序列或前面測定的CnPnV序列。生成重疊PCR產物以覆蓋間隙和引物結合區域。所有區域在2條鏈上測序。CnPnV分離物與MPV株15 (GenBank AY729016)和 J3666 (GenBank NC006579)的序列使用 Lasergene (DNASTAR,美國威斯康星州麥迪遜)作比較。實施例3 分離和鑑定採用鼻和咽部拭子洗脫液接種A72細胞。相對長時間培養後，通常在第三或第四傳代後觀察到有限CPE。起始CPE通常包括細胞變圓的散布小灶點，有時有小合胞體和形成空泡。靜置培養的所述CPE在幾天內進展緩慢。繼代培養常導致維持此低級CPE的單層，但是一些培養物在24-48小時內有快速進展和單層的分解。儘管與一些皰疹病毒感染相似，所述模式不測試犬皰疹病毒陽性，並不顯示通常使用相似過程分離的任何犬呼吸道病毒典型特徵。一些早期傳代分離物在培養中複製較差，顯示新鮮細胞上清液轉移後CPE很少或沒有。然而，一些持續傳代的培養物發展出更一致的轉移CPE，並且選擇它們用於進一步分析。起始測試顯示來自幾隻不相關狗的血清似乎在CPE培養中識別病毒抗原(數據未顯示)，但是普通犬呼吸道病毒測試為陰性。如實施例I所報導，對HRSV特異的Mab有效識別病毒抗原。有抗PVM多克隆血清的正IFA染色用於確證。抗PVM小鼠血清通過IFA中僅微弱結合BRSV。實施例I所述CnPnV的最初13種分離物源自由相同組織管理的2個動物收容所。為檢測是否病毒限於所述兩個地點，來自其他地理位置的病狗的鼻或咽部拭子樣品用PCR測試。美國8個州(C0、GA、FL、IN、M0、NV、SC、VA)的19隻狗用G和SH基因的引物組測試。19例樣品中，一例來自內華達州，和5例來自南卡羅來納州的9隻狗的組，對G和SH PCR都是陽性並且通過測序證實。沒有從其他13例狗中獲得PCR陽性結果。對其他6例進行犬呼吸道診斷的來自紐約州和賓夕法尼亞州的鼻拭子樣品嘗試A72細胞的病毒分離。其中，兩例額外分離物來自紐約市獸醫院且另一個來自從賓夕法尼亞州費城收容所。用抗RSV和抗PVM抗體通過IFA和隨後RT-PCR證實所述分離物為CnPnV。儘管所述RT-PCR和病毒分離結果不提供流行性的精確評價，它們確實表明CnPnV感染廣泛。序列分析前面研究已經注意到病毒分離物間的差異可歸因於存在自然準種，傳代培養中的突變或PCR人造產物。為測定CnPnV分離物的最精確共有序列，使用將總細胞RNA用作模板的多個重疊RT-PCR反應。測序兩隻狗的病毒分離物，一個在組織傳代4 (Ane4)且一個在組織傳代 17 (Brnel7),並且與序列 J3666 (Thorpe 和 Easton, 2005)和株 15 (Krempl 等，2005)作比較。8598nt序列(SEQ ID NO: I)從CnPnV_Ane4獲得，從毗鄰NSl的3』前導區開始並延伸到L編碼區域的短距離，完全覆蓋10個基因組預測基因中的九個。證實基因順序NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L。此CnPnV_Ane4區域相較MPV株的全部nt序列相同性是J366695. 0%和株1594. 7%。MPV株互相是99. 7%相同性。在CnPnV_Ane4和MPV株比較中沒有發現編碼區內的間隙。除了部分3. 4和3. 5所述的G和SH的長度不同外，發現所有MPV和CnPnV-Ane4編碼區域編碼同一長度的蛋白。非翻譯區的比較分析CnPnV中GS和GE序列邊界通過J3666和株15序列比對來確定(Thorpe, L. C.,Easton, A. J.，2005. J. Gen. Virol. 86,159-169 ；KrempI 等，2005. Virus Genes30, 237-249)。MPV的GS序列由Chambers等(1991)描述，並且最近(Dibben和Easton, 2007)描述為9nt長度，基於由Collins等(1986)測定的RSV GS序列。Kuo等(1997)提供第IOnt還在RSV的GS中重要並且其IOnt的長度與MPV GS相等的證據(Krempl等，2005)。表I中，GS表示為IOnt以包括兩種解釋。表I提供CnPnV-Ane4相較MPV株15和J3666的編碼區域間的GS ,GE和IGR序列。表I
......^Cl..............................................................IGRGS...............................................................涵...5，............................^NTR.....函
aggacaagug NS I
N SI uagimaamiaaaa caaagggu aggacaaauc* N S2沒{\ I x:別
NS2 IiaguiiIiiigaaia mm*aggaiiaaana N沒 )%觀
Nuauuiiaairaaaaa cuggaiiaiigi* aggauaatia PK I m
(+l|a])
Puaguiitauuaata mmc (-3[acal) aggacaaaiii MPJ 3 nt
Muagu猶咖獅a c (-l|u[)aggauaagua* SH沒{j'|<YA
SHUcigmiaacaaaaa unaggiiuaagua G沒 ff|< 別
a
Giiaginiaatigaaaa iiaagcuaiigaua aggacaaaua
a (-t-1 [aj)uaau*("l|c|)
Fuagutiaeuuaaaa Ciiubaggauaagugb M2K I m
im (+l[aj)
M2 uaguiiauauaais uaaucaauu* aggaucaaua L%j 2 nt
a (部φ表I中，兩個MPV株的NTR長度沒有區別。RNA序列是5』 -3』方向。* :指示從J3666和株15的至少Int改變。nt差異採用粗體和下劃線。GE :基因末端；IGR :基因間區域；GS:基因起點；沒有區別；長度沒有區別。3對M-SH總體NTR長度沒有區別；一個u從IGR刪除和另一個u在NTR上遊加入。b3核苷酸IGR和看似M2GS是基於Dibben和 Easton (Dibben，0.，Easton，A. J.，2007. Mutational Analysis of the Gene StartSequences of Pneumonia Virus of Mice (《小鼠肺炎病毒基因起始序列的突變分析》).Virus Res. 130，303-309)分析。表I所示有10個或更多核苷酸的序列具有以下SEQ ID:對於「GE，，列序列NS1 uaguuaauuaaaa (SEQ ID NO: 18) ；NS2 uaguuauagaaaaa (SEQ IDNO:19) ；N uauuuaauuaaaaa (SEQ ID NO:20) ；P (SEQ ID NO:18) ；M uaguuaaauaaaa (SEQID NO:21) ；SH uaguuaacaaaaaa (SEQ ID NO:22) ；G uaguuaaugaaaaa (SEQ ID NO:23) ；Fuaguuaauuaaaaaa (SEQ ID NO:33);和 M2uaguuauauaaaaa (SEQ ID N0:34)。對於「IGR，，列序列N cuggaaaauau (SEQ ID N0:24);和 G uaagcuaugauauaau (SEQ ID NO:25);對於「GS，，列序列；NS1 aggacaagug (SEQID NO: 26 ；NS2 aggacaaauc (SEQ ID NO: 27) ；N aggauaaaua(SEQ ID NO:28)；P (SEQ ID NO:28)；M aggacaaaua (SEQ ID NO:29);SH aggauaagua (SEQIDNO:30) ；G (SEQ ID NO::30) ；M2 aggauaagug (SEQ ID N0:31)；F (SEQID N0:29)和 Laggaucaaua SEQ ID NO:32)。在CnPnV-Ane4NTR中鑑定了一些長度變化和nt差異，主要在IGR中發現。IGR內的兩個MPV 株沒有不同。Chambers 等(Chambers,P. ,Matthews,D. A. ,Pringle,C. R. ,Easton,A. J.，1991. Virus Res. 18，263-270)從 cDNA 克隆中測定 M2 的 GS,也注意到 56nt IGR 中存在2個額外潛在GS序列(GSl和GS2)。稍後的突變分析測定由於位點6的G取代A，推定的GS序列沒有功能。隨後，他們測定GSl和GS2序列能在最重要的弟一序列(GSl)中指導轉錄起始。他們的結論是最初鑑定的GS序列可能由於cDNA克隆中的自發缺失而錯鑑定。CnPnV中，立即跟隨F GE序列的M2GS I序列與SH和G基因起始序列相同，除了第10nt。認為主要使用 GSl 並示於表 I。M2 的 GS2，AGGACAGGG，與(Dibben，O. , Easton, A. J. ,2007.Virus Res. 130，303-309)報導的共有序列僅差異2個位置，但可有有限活性，因為其在位點7沒有保守性A。這不同於J3666和株15，其中A是保守的。CnPnV_Ane4中的第三潛在M2GS (GS3)與J3666和株15相同，並且因此假定由於位點6的G而功能較差。非結構蛋白的分析非結構小疏水蛋白看來耐受顯著變化，因為其是兩個MPV株之間分歧最大的蛋白，其中它們共有的92aa中只有92. 4%aa相同。CnPnV_Ane4中，相較MPV株15，SH蛋白在所有檢測蛋白中分歧最大。CnPnV-Ane4SH與J3666差異4aa (95. 7%)，和與株15差異9aa(90. 2%)，並且因此與J3666比MPV株之間更相似(表2)。另一顯著差異是不同分離物的SHORF長度。CnPnV-Ane4和株15 二者都有279nt (92aa)的SH 0RF,而發表的J3666SH序列是345nt(114aa)。然而，已經報導了 J3666的單獨擴增序列不同地編碼92、96或114aa並且表明這些所示抗體逃避突變。表2提供對肺炎病毒亞科病毒的CnPnV-Ane4基因和蛋白的相同性百分比的總結。表 權利要求
1.一種包括與SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的分離多核苷酸的組合物。
2.如權利要求I所述的組合物，其特徵在於，所述多核苷酸是與SEQIDN0:1序列至少96%相同的多核苷酸。
3.如權利要求I所述的組合物，其特徵在於，所述多核苷酸是與SEQIDN0:2序列至少96%相同的多核苷酸。
4.如權利要求I所述的組合物，其特徵在於，所述多核苷酸是與SEQIDN0:3序列至少96%相同的多核苷酸。
5.一種包括與SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸的分離病毒。
6.如權利要求5所述的分離病毒，其特徵在於，所述分離病毒已經減毒。
7.如權利要求5所述的分離病毒，其特徵在於，所述分離病毒包括與SEQID N0:1序列至少96%相同的多核苷酸。
8.如權利要求6所述的分離病毒，其特徵在於，所述分離病毒包括與SEQID N0:2序列至少96%相同的多核苷酸。
9.如權利要求7所述的分離病毒，其特徵在於，所述分離病毒包括與SEQID N0:3序列至少96%相同的多核苷酸。
10.一種含有病毒的分離細胞或體外細胞培養物，所述病毒包括與SEQ ID ΝΟ:1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸的。
11.一種在哺乳動物中刺激免疫反應的方法，所述方法包括給予哺乳動物含有權利要求5所述分離病毒、或所述分離病毒所含蛋白的片段的組合物，其中免疫反應在給藥後於動物中被刺激。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，權利要求5所述的分離病毒包括與SEQIDNO: I序列至少96%相同的多核苷酸，並且其中將所述組合物給予犬。
13.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，權利要求5所述的分離病毒包括與SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 3序列至少96%相同的多核苷酸，並且其中將所述組合物給予貓。
14.一種檢測哺乳動物是否被肺炎病毒感染的方法，所述方法包括從哺乳動物中獲得生物樣品和檢測與SEQ ID ΝΟ:1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸，或通過檢測由SEQID NO: 1，2或3反向互補物所編碼蛋白的存在來檢測與SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸，其中，多核苷酸或蛋白的存在指示哺乳動物被肺炎病毒感染。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物是犬或貓。
全文摘要
本發明提供新鑑定的能感染哺乳動物的肺炎病毒，所述哺乳動物包括狗、貓和可能的人。提供分離的病毒多核苷酸和蛋白，和分離的病毒本身。發明包括檢測病毒的組合物和方法，和預防和/或治療與病毒出現正相關的疾病徵兆的方法和組合物，和包括病毒的分離細胞。也提供完整病毒顆粒，病毒蛋白和其片段。
文檔編號C12N15/45GK102884193SQ201080064234
公開日2013年1月16日 申請日期2010年12月21日 優先權日2009年12月21日
發明者E·杜博維, R·W·瑞沙 申請人:康奈爾大學