Sars病毒抗原s6－1的高特異性抗體的快速製備方法
2023-12-05 17:59:26
專利名稱：Sars病毒抗原s6－1的高特異性抗體的快速製備方法
技術領域：
本發明涉及一種高特異性抗體快速製備的方法，特別涉及一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法。它是，並以蛋白A親和層析柱為分離方式，屬分子生物學及抗體製備技術領域。。
背景技術：
菸草花葉病毒——TMV由6395個鹼基組成的3種亞基因組mRNA至少編碼4種蛋白病毒複製必需的兩個非結構蛋白——126K和180K蛋白；參與病毒在宿主細胞間運輸的30K蛋白和與病毒組裝、在宿主體內長距離運輸及與寄生間相互作用有關的17.6K外殼蛋白(Coat Protein，CP)。菸草花葉病毒能在侵染植物細胞中大量積累，其外殼蛋白(CP)在菸草總蛋白中具有高達7％的表達量，因此菸草花葉病毒具有作為表達載體的強大潛力。在利用菸草花葉病毒表達外源肽的策略中，大多是在菸草花葉病毒的外殼蛋白羧端151到155之間的某一位點採取融合的方式表達抗原短肽。提取融合後的菸草花葉病毒外殼蛋白，通過動物的靜脈注射，獲得多克隆抗體。
SARS病毒是一種新近發現的冠狀病毒，其表面蛋白可與細胞上的相應受體結合，導致人類發生嚴重急性呼吸道症候群(SARS)。S6-1為SARS病毒表面蛋白上的一段長為12個胺基酸的肽段，其序列為SARS病毒上一個抗原決定簇。通過將S6-1序列融合到菸草花葉病毒外殼蛋白上，通過免疫動物，純化多克隆抗體等實驗，進而得到相對應的S6-1的抗體。
目前最常用的高特異性抗體製備方法是採用雜交瘤技術製備單克隆抗體將目的抗原免疫注射動物，使之產生致敏B淋巴細胞後，採用細胞融合技術形成雜交瘤細胞；將融合的雜交瘤細胞進行篩選，得到雜交瘤陽性克隆再進一步篩選與克隆化，最終採用動物體內誘生法或體外培養法大量製備單克隆抗體。相對來說這樣通過製備單克隆抗體得到的高特異性抗體，具有操作步驟多，操作技術要求高，周期長等不利因素。同時造成了單克隆抗體的製備成本增高。
發明內容
本發明的目的在於通過將融合了外源序列的TMV CP-S6-1免疫動物得到多克隆抗體，多克隆抗體通過交叉吸附實驗的方法提供一種經濟、快捷、準確並且易於普及推廣的SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法。
為達到上述目的，本發明採用如下技術方案本發明一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法，其特徵在於該方法包括以下步驟a)多克隆抗體的製備i.融合SARS病毒抗原S6-1的TMV重組病毒的構建；ii.抗原的製備採用TMV-S6-1重組病毒的融合S6-1的CP製備抗原TMVCP-S6-1；iii.將抗原TMV CP-S6-1免疫家兔，免疫後，抽取兔抗血清備用b)通過交叉吸附實驗獲得高特異性抗體，具體步驟如下i.製備交叉吸附需要的蛋白丙酮粉，製備蛋白丙酮粉的蛋白來源有兩個菸草總蛋白和野生型菸草花葉病毒外殼蛋白，分別得到菸草蛋白丙酮粉和野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉；ii.蛋白丙酮粉吸附兔抗血清(1)取步驟A中c所得到的兔抗血清置入eppendorf管中，加入菸草蛋白丙酮粉均勻混合，菸草蛋白丙酮粉與兔抗血清的重量體積比為1∶50-1∶25；然後在冰上輕彈30min-45min，靜置於冰箱內過夜；之後，於4℃下離心分離，將上清移至新的eppendorf管中，得到菸草蛋白丙酮粉處理後的抗體X；(2)取經過上述步驟(1)菸草蛋白丙酮粉處理後的抗體X置入eppendorf管中，加入野生型菸草花葉病毒外殼蛋白丙酮粉均勻混合，野生型菸草花葉病毒外殼蛋白丙酮粉與抗體的重量體積比為1∶50-1∶25；在冰上輕彈30min-45min，靜置於冰箱內過夜；之後，於4℃下離心分離，將上清移至新的eppendorf管中，得到另一種抗體Y；iii.Protein A親和層析柱純化抗體Y，得到抗體Anti-S6-1。
上述的抗原的製備的具體步驟為a.TMV重組病毒粒子經稀釋後，混以金剛砂，採用機械摩擦法接種菸草Nicotiana tabacum cv.samsun幼苗；病毒接種菸草14-21天後，收穫菸草葉片用於大量病毒粒子提取；b.將上述的菸草葉片加入病毒提取液，即0.5M磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2，經研磨後，過濾除渣，於4℃離心分離；
c.取上清液，在上清中加入正丁醇或氯仿至終體積濃度為8％±0.1％，控制溶液溫度為3℃-5℃，攪拌30min-45min，於4℃離心分離；d.取水相，加入PEG 6000至濃度5％±0.1％，NaCl至濃度5％±0.1％，控制溶液溫度為3℃-5℃，混勻30min-45min，於4℃離心分離；e.取沉澱物，將該沉澱的病毒粒子懸浮於病毒儲存液，即50mM磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2中，於4℃離心分離；f.取上清液，加入PEG 6000至終濃度5％，NaCl至5％，3℃-5℃靜置30min-45min，離心分離；將沉澱物懸浮於病毒儲存液，即50mM磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2中，於4℃離心分離；取上清液，即為純化的病毒粒子，即抗原TMVCP，可於4℃下長期保存；g.取上述步驟f中所得抗原TMV CP-S6-1，加入2倍體積冰醋酸解離，混勻後冰上放置10min-15min，於4℃，離心分離10min-15min。上清加入等體積蒸餾水，0℃±0.5℃放置1hr。
h.蒸餾水透析2天，其間換水三次；在透析後的樣品中加入少量3M NaAc，pH為4.7，使抗原TMV CP進一步聚集，於4℃，36,000rpm離心分離10hr。
i.取沉澱懸浮於pH8.0，I＝0.1的Tris-Cl溶液中，懸浮液在pH5.0，I＝0.1的NaAc溶液中再次透析過夜；析得到的抗原TMV CP-S6-1懸液可於4℃下長期保存備用。
上述的抗原TMV CP-S6-1免疫家兔的方法是取10mg±0.5mg抗原TMV CP-S6-1皮下注射一頭家兔，以後的20天內，每隔10天採用同樣的免疫方法和劑量加強免疫該家兔兩次；第三次免疫後兩周，抽取兔血清備用。
上述的蛋白丙酮粉的製備方法是取菸草葉片碾磨成泥狀，移至離心管內；或者取野生型菸草花葉病毒粒子溶液移至離心管內；加入5倍體積的-20℃預冷的冷丙酮，在漩渦振蕩器上振蕩20s-30s，使得丙酮和樣品充分混合，於4℃下以12000g的速度離心，取其沉澱物，反覆上述操作數次至沉澱物呈白色，將沉澱物在通風櫥內乾燥，最後製成粉狀，即為菸草蛋白丙酮粉或者野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉。
上述的Protein A親和層析柱純化抗體Y的方法是Protein A親和層析柱和各種緩衝器buffer，緩慢升至室溫，同時將抗體Y與Binding Buffer按1∶1-1∶2的比例混勻；取5-6倍體積的Binding Buffer注入Protein A親和層析柱以平衡Protein A柱；將抗體Y注入Protein A親和層析柱，靜置5min-6min；取10～15倍體積Binding Buffer洗去柱上未結合的雜抗體，用eppendorf管收集洗液；取3～5倍體積的Elution Buffer洗脫柱上的抗體，用eppendorf管收集洗液，所得洗液即為Anti-S6-1。
同現有技術相比，本發明方法具有如下顯而易見的特點和突出的優點本發明方法具有快捷、經濟，產量高，準確度高等並且易於推廣普及。本發明方法操作簡單，實驗需要的周期短，同時由於以TMV為載體可以融合表達多種外源肽，因此，採用此方法可以有效地應用於其他抗體的製備。
圖1SDS-PAGE及Western免疫雜交結果圖1A為SDS-PAGE凝膠電泳結果，lane2為wtCP，lane3為CP-S6-1，lane4為wtCP與CP-S6-1的混合蛋白；圖1B為以Anti-wtCP為一抗的western雜交結果，lane1為wtCP，lane2為CP-S6-1，lane3為混合蛋白；圖1C為以經倆次交叉吸附得到的抗體Anti-S6-1為一抗的western雜交結果，lane1為wtCP，lane2為CP-S6-1，lane3為混合蛋白。
具體實施例方式實施例一一.多克隆抗體的製備1.融合外源肽S6-1的TMV重組病毒的構建TMV-S6-1重組病毒的構建方法見ZL00111491.3號專利。
2.抗原的製備本發明使用TMV-S6-1重組病毒的融合S6-1的CP作為抗原免疫動物以得到多克隆抗體。
(1).TMV-S6-1重組病毒粒子經適當稀釋後，混以少量金剛砂，採用機械摩擦法接種一定數量的菸草Nicotiana tabacum cv.samsun幼苗。病毒接種菸草約2周後，收穫菸草葉片用於大量病毒粒子提取。
(2)取100g±5g上述處理後的菸草葉片加入100ml病毒提取液(0.5M磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2)，研磨後，以4層紗布過濾除渣。5000g離心15min。
(3).在上清中加入氯仿至終體積8％±0.1％，3℃-5℃下，攪拌30min-45min。於4℃，8000g離心30min-35min。
(4).取水相，加入PEG 6000至終濃度5％±0.1％，NaCl至5％±0.1％，4℃，混勻30min。於4℃，8000g離心15min。
(5).沉澱的病毒粒子懸浮於20ml病毒儲存液(50mM磷酸緩衝液，1mMEDTA，pH7.2)中。於4℃，8000g離心15min。
(6).上清中加入PEG 6000至終濃度5％±0.1％，NaCl至5％±0.1％，4℃靜置30min。沉澱懸浮於約2ml病毒儲存液(50mM磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2)中。於4℃，8000g離心15min。上清即為純化的病毒粒子，即抗原(可於4℃下長期保存)。
(7).取50μg左右TMV-S6-1樣品，加入2倍體積冰醋酸解離，混勻後冰上放置10min，於4℃，3000g離心10min。上清加入等體積蒸餾水，0℃±0.5℃放置1hrr。
(8).蒸餾水透析2天，其間換水三次。在透析後的樣品中加入少量3MNaAc(pH4.7)使TMV CP-S6-1進一步聚集。4℃，36,000rpm離心10hr。
(9).沉澱懸浮於pH8.0，I＝0.1的Tris-Cl溶液中，懸浮液在pH5.0，I＝0.1的NaAc溶液中再次透析過夜。透析得到的CP-S6-1懸液可於4℃下長期保存備用。
3.抗原免疫家兔(1)取約10mg±0.5mg CP-S6-1皮下注射一頭家兔。
(2)以後的20天內，每隔10天採用同樣的免疫方法和劑量加強免疫該家兔兩次。
(3)第三次免疫後兩周，抽取兔血清備用。
二.通過交叉吸附實驗獲得高特異性抗體1.製備交叉吸附需要的蛋白丙酮粉，製備蛋白丙酮粉的蛋白來源有倆個——菸草總蛋白和野生型菸草花葉病毒外殼蛋白(1).菸草蛋白丙酮粉的製備取菸草葉片若干克，碾磨成泥狀，取5ml±0.5ml的菸草泥狀樣品移至50ml的離心管內，加入5倍體積的冷丙酮(-20℃預冷)，在漩渦振蕩器上振蕩20s，使得丙酮和樣品充分混合，於4℃下以12000g的速度離心，取其沉澱物，反覆上述操作數次至沉澱物呈白色，將沉澱物在通風櫥內乾燥，最後製成粉狀。
(2).野生型菸草花葉病毒外殼蛋白丙酮粉的製備取濃度為50μg/μl野生型菸草花葉病毒粒子溶液5ml±0.5ml，移至50ml的離心管內，加入5倍體積的冷丙酮(-20℃預冷)，在漩渦振蕩器上振蕩20s，使得丙酮和樣品充分混合，於4℃下以12000g的速度離心，其沉澱物為白色，將沉澱物在通風櫥內乾燥，最後製成粉狀。
2.蛋白丙酮粉吸附兔抗血清(1).菸草蛋白丙酮粉進行交叉吸附實驗取約1ml兔抗血清置入1.5μl eppendorf管中，加入2％(w/v)的菸草蛋白丙酮粉均勻混合後，於在冰上輕彈30min，靜置於4℃冰箱內過夜；之後，於4℃下以12000g的速度離心，將上清移至新的eppendorf管中，得到菸草蛋白丙酮粉處理後的抗體X。
(2).野生型菸草花葉病毒外殼蛋白丙酮粉進行交叉吸附實驗取經過菸草蛋白丙酮粉處理後的抗體約1ml，置入1.5μl eppendorf管中，加入2％(w/v)的野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉均勻混合後，於在冰上輕彈30min，靜置於4℃冰箱內過夜；之後，於4℃下以12000g的速度離心，將上清移至新的eppendorf管中，得到另一種抗體Y。
3.Protein A親和層析柱純化抗體，本實驗使用的ImmunoPure ImmobilizedProtein A購自PIERCE公司(1).使用親和層析柱純化抗體YProtein A親和層析柱和各種buffer(緩慢升至室溫)，同時將抗體樣品與Binding Buffer按1∶1的比例混勻；取5倍體積的Binding Buffer注入Protein A親和層析柱以平衡Protein A柱；將樣品注入Protein A親和層析柱，靜置5min；取10倍體積Binding Buffer洗去柱上未結合的抗體，用1.5μleppendorf管收集洗液；取3倍體積的Elution Buffer洗脫柱上的抗體，用1.5μl eppendorf管收集洗液。
(2).親和層析柱的回收於Protein A親和層析柱中加入6倍體積的Elution Buffer，待其快流幹時加入5ml±0.5ml Storage Buffer，當只剩3ml±0.1ml Storage Buffer處於Protein A柱上端時，先封底蓋，後封頂蓋；三.高特異性抗體的效果測定；兔抗血清經過蛋白丙酮粉的交叉吸附，以及Protein A親和層析柱純化後得到抗體Anti-S6-1。採用ELISA間接法測定該種抗體的效價，western雜交實驗對抗體的特異性進行檢測。
1.ELISA間接法(1).預處理抗原樣品用0.05M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)包被液將樣品抗原配置成5.0±0.1ng/ul的濃度，樣品抗原為野生型菸草花葉病毒外殼蛋白以及融合S6-1肽段的融合外殼蛋白；(2).包被在96孔酶標板中的位置設定好樣品以及相應的陽性、陰性對照和空白，加樣，37℃下孵育約2小時後取出酶標板，倒出包被液後用0.05M PBS/Tween20洗5-6次，倒扣拍幹；(3).封閉每孔加入一定量封閉液，37℃下封閉約1小時，倒出封閉液後用0.05M PBS/Tween20洗5-6次，倒扣拍幹；(4).按一定比例加入第一抗體，37℃孵育約1小時，倒出雜交液後用0.05MPBS/Tween20洗5-6次，倒扣拍幹；(5).以1/10000的比例加入第二抗體羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標抗體，37℃下孵育約1小時，倒出雜交液後用0.05M PBS/Tween20洗幾次，倒扣拍幹；(6).顯色加入辣根過氧化物酶的顯色底物鄰苯二胺二鹽酸(OPD)，37℃孵育10min-15min。往酶標板孔中加入一定量2M H2SO4終止液，置於Beckman500型酶標儀中測定OD492值，測得結果如表1所示。
表1ELISA-酶標檢測儀測得OD492值Table 1.ELISA-OD492read by Microplat Reader
2.Western免疫雜交(1).SDS-PAGE配置15％的凝膠，BIO-RAD電泳電轉儀中以65v電壓電泳3～3.5小時；(2).電轉BIO-RAD電泳電轉泳儀中200mA±5mA的電流強度下，於4℃冰箱中電轉60min；(3).封閉從電轉槽中取出NC膜置於雜交瓶中，正面向上，加入封閉液，室溫下封閉約1小時，PBS/Tween20清洗5-6次；(4).按一定的比例往雜交瓶中加入第一抗體，室溫下置於雜交爐中雜交約1小時，PBS/Tween20清洗5-6次；(5).以1/10000的比例加入第二抗體羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標抗體，室溫下置於雜交爐中雜交約1小時，PBS/Tween20清洗5-6次；(6).壓片顯影取出NC膜，取150μl螢光底物均勻浸潤於濾膜正面，在暗室中剪一片與濾膜大小相仿的膠片，重疊於NC膜上曝光5-10分鐘後顯影，western雜交實驗結果見圖1。
從測定結果可以得出，抗體分別與wtCP、CP-S6-1這倆種抗原發生酶標反應，在稀釋度為1/1000具有最大OD492值。當抗體稀釋度為1/2500時P/N值仍大於2，此濃度下的抗體仍有較高的IgG效價；同時，最初的兔抗血清經過倆種蛋白丙酮粉對它的菸草總蛋白以及野生型菸草花葉病毒的外殼蛋白的抗原決定簇的交叉吸附後，得到特異性的高特異性抗體Anti-S6-1，該抗體僅對外源肽段S6-1產生特異性反應，說明通過交叉吸附得到的高特異性抗體Anti-S6-1完全可以應用於S6-1肽段的鑑定。
權利要求
1.一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法，其特徵在於該方法包括以下步驟A.多克隆抗體的製備a.融合SARS病毒抗原S6-1的TMV重組病毒的構建；b.抗原的製備採用TMV-S6-1重組病毒的融合S6-1的CP製備抗原TMVCP-S6-1；c.將抗原TMV CP-S6-1免疫家兔，免疫後，抽取兔抗血清備用B.通過交叉吸附實驗獲得高特異性抗體，具體步驟如下a.製備交叉吸附需要的蛋白丙酮粉，製備蛋白丙酮粉的蛋白來源有兩個菸草總蛋白和野生型菸草花葉病毒外殼蛋白，分別得到菸草蛋白丙酮粉和野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉；b.蛋白丙酮粉吸附兔抗血清，具體步驟如下(1)取步驟A中c所得到的兔抗血清置入eppendorf管中，加入菸草蛋白丙酮粉均勻混合，菸草蛋白丙酮粉與兔抗血清的重量體積比為1∶50-1∶25；然後在冰上輕彈30min-45min，靜置於冰箱內過夜；之後，於4℃下離心分離，將上清移至新的eppendorf管中，得到菸草蛋白丙酮粉處理後的抗體X；(2)取經過上述步驟(1)菸草蛋白丙酮粉處理後的抗體X置入eppendorf管中，加入野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉均勻混合，野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉與抗體的重量體積比為1∶50-1∶25；在冰上輕彈30min-45min，靜置於冰箱內過夜；之後，於4℃下離心分離，將上清移至新的eppendorf管中，得到抗體Y；c.Protein A親和層析柱純化抗體Y，得到抗體Anti-S6-1。
2.根據權利要求1所述的一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法，其特徵在於所述的抗原的製備的具體步驟為a.TMV重組病毒粒子經稀釋後，混以金剛砂，採用機械摩擦法接種菸草Nicotiana tabacum cv.samsun幼苗；病毒接種菸草14-21天後，收穫菸草葉片用於大量病毒粒子提取；b.將上述的菸草葉片加入病毒提取液，即0.5M磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2，經研磨後，過濾除渣，離心分離；c.取上清液，在上清中加入正丁醇或氯仿至終體積濃度為8％±0.1％，控制溶液溫度為3℃-5℃，攪拌30min-45min，於4℃離心分離；d.取水相，加入PEG 6000至濃度5％±0.1％，NaCl至濃度5％±0.1％，控制溶液溫度為3℃-5℃，混勻30min-45min，於4℃離心分離；e.取沉澱物，將該沉澱的病毒粒子懸浮於病毒儲存液，即50mM磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH 7.2中，於4℃離心分離；f.取上清液，加入PEG 6000至終濃度5％，NaCl至5％，3℃-5℃靜置30min-45min，離心分離；將沉澱物懸浮於病毒儲存液，即50mM磷酸緩衝液，1mM EDTA，pH7.2中，於4℃離心分離；取上清液，即為純化的病毒粒子，即抗原TMVCP，可於4℃下長期保存；g.取上述步驟f中所得抗原TMV CP-S6-1，加入2倍體積冰醋酸解離，混勻後冰上放置10min-15min，於4℃，離心分離10min-15min。上清加入等體積蒸餾水，0℃±0.5℃放置1hr-1.5hr。h.蒸餾水透析2天，其間換水三次；在透析後的樣品中加入少量3M NaAc，pH為4.7，使抗原TMV CP進一步聚集，於4℃，36,000rpm離心分離10hr。i.取沉澱懸浮於pH8.0，I＝0.1的Tris-Cl溶液中，懸浮液在pH 5.0，I＝0.1的NaAc溶液中再次透析過夜；析得到的抗原TMV CP-S6-1懸液可於4℃下長期保存備用。
3.根據權利要求1所述的一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法，其特徵在於所述抗原TMV CP-S6-1免疫家兔的方法是取10mg±0.5mg抗原TMVCP-S6-1皮下注射一頭家兔，以後的20天內，每隔10天採用同樣的免疫方法和劑量加強免疫該家兔兩次；第三次免疫後兩周，抽取兔血清備用。
4.根據權利要求1所述的一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法，其特徵在於所述蛋白丙酮粉的製備方法是取菸草葉片碾磨成泥狀，移至離心管內；或者取野生型菸草花葉病毒粒子溶液移至離心管內；加入5倍體積的-20℃預冷的冷丙酮，在漩渦振蕩器上振蕩20s-30s，使得丙酮和樣品充分混合，於4℃下以12000g的速度離心，取其沉澱物，反覆上述操作數次至沉澱物呈白色，將沉澱物在通風櫥內乾燥，最後製成粉狀，即為菸草蛋白丙酮粉或者野生型菸草花葉病毒外殼蛋蛋白丙酮粉。
5.根據權利要求1所述的一種SARS病毒抗原S6-1的抗體的快速製備方法，其特徵在於所述Protein A親和層析柱純化抗體Y的方法是Protein A親和層析柱和各種緩衝器buffer，緩慢升至室溫，同時將抗體Y與Binding Buffer按1∶1-1∶2的比例混勻；取5-6倍體積的Binding Buffer注入Protein A親和層析柱以平衡Protein A柱；將抗體Y注入Protein A親和層析柱，靜置5min-6min；取10-15倍體積Binding Buffer洗去柱上未結合的雜抗體，用eppendorf管收集洗液；取3-5倍體積的Elution Buffer洗脫柱上的抗體，用eppendorf管收集洗液，所得洗液即為Anti-S6-1。
全文摘要
提供一種高特異性抗體快速製備的方法，包括融合外源序列的TMV CP－S6－1免疫動物得到多克隆抗體，使用菸草總蛋白和菸草花葉病毒外殼蛋白的蛋白丙酮粉多克隆抗體通過交叉吸附實驗，並以蛋白A親和層析柱為分離方式，然後做抗體的效果的免疫鑑定，屬分子生物學及抗體製備技術領域。本發明的方法操作簡單，經濟快捷，重複性好，是一種準確並且易於普及推廣的病毒抗原抗體的快速製備方法。
文檔編號C07K16/08GK1699421SQ20051002658
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月9日 優先權日2005年6月9日
發明者許政暟, 宋任濤, 許寅琦 申請人:上海大學