腫瘤特異性重組水蛭素及其製備方法和用途與流程

2023-12-05 02:05:41

本發明涉及生物治療與生物醫藥領域，特別涉及一種腫瘤特異性重組水蛭素及其製備方法和用途。

背景技術：

水蛭素是迄今發現的活性最強的天然凝血酶特異性抑制劑，最初從醫用水蛭唾液腺中分離得到，由65～66個胺基酸組成，可直接與凝血酶以l：l(摩爾比)的方式結合形成非共價複合物，從而使凝血酶失去裂解纖維蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十種以上變體，主要有簡稱為hv1、hv2、hv3三種同源性很高的異構體(hirudinvariant)。

目前，國外已有兩個重組水蛭素產品被批准上市：1.desirudin(商品名：revasc，瑞士novartis產品)，2.lepirudin(商品名：refludan，英國pharmion及美國berlexlaboratories產品)。兩者結構上僅在n-端存在微小差異，desirudin為val1-val2，而lepirudin為leu1-tyr2。desirudin用於手術時深度靜脈血栓(dvt)的預防與治療，lepirudin用於肝素誘導的血小板減少性疾病患者的抗凝治療。此外，水蛭素在防治不穩定性心絞痛、彌散性血管內凝血、腦血栓、血栓靜脈炎及冠狀動脈血栓等方面都具有巨大的潛在臨床應用價值。

在多種惡性腫瘤患者中存在著血液高凝狀態，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。惡性腫瘤患者血液中的高凝狀態，不僅能促進體內血栓形成，而且與腫瘤生長、侵襲以及轉移明顯相關。凝血功能變化可引起腫瘤細胞表型和活性改變，促進腫瘤細胞與血小板、內皮細胞、纖維結合蛋白(fibrinectin)以及vonwillebrandfactor(vwf)的黏附，從而使腫瘤細胞在局部增殖、浸潤甚至向其他部位轉移。血栓性疾病是僅次於腫瘤轉移的惡性腫瘤患者第二大致死因素。對血栓形成高危腫瘤患者及早進行藥物性幹預，對於延長患者生存期、降低死亡率有重要意義。研究表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發揮作用。重組水蛭素通過其抗凝作用，抑制纖維蛋白的形成，能防止腫瘤細胞與血纖維蛋白或血小板凝集，使nk細胞或其他細胞毒效應細胞的活性得以發揮。已證明水蛭素治療可發揮療效的腫瘤有纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化療和放療，通過促進腫瘤中的血流、改善乏氧狀態而增強療效。

動物試驗和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，半致死劑量遠大於治療所需劑量，機體易接受，免疫性弱，不影響血小板、纖維蛋白原水平和血紅蛋白含量，不易通過血腦脊液屏障。無論急性、亞急性的毒性試驗，水蛭素對呼吸、血壓、心率均不影響。水蛭素在體內無降解，以活性成分經腎臟排洩。

水蛭素作為一種高效、直接、特異的凝血酶抑制劑，具有很強的抗凝、抗血栓以及抗炎等多種藥理活性。與肝素等傳統的抗凝藥物相比，其治療劑量小、療效高、不會引起過敏反應。水蛭素有抗原性，但其抗體沒有害，反而延長消除半衰期，是一種少見的正效果抗體。因此水蛭素的應用將會不斷得到開拓和推廣，重組水蛭素將會成為新一代的抗凝、抗栓和抗腫瘤新藥。但是，水蛭素又可導致凝血相關參數，如活化部分凝血活酶時間(aptt)、凝血酶時間(tt)和凝血酶原時間(pt)等明顯升高，從而可能引起全身或系統性出血風險。臨床上，作為一個理想的抗凝藥物，在全身用藥條件下，應當具有明確的抗凝、抗栓效果，但又不引起出血副作用，尤其是在以治療腫瘤為目的的臨床應用時，其理想的工作狀態為靶向性的在腫瘤局部發揮抗凝、抗栓、抗腫瘤作用，從而使臨床用藥安全性提高。在腫瘤治療領域，如何進一步減少水蛭素的副作用，增加其腫瘤治療靶向性是值得探討的問題。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種腫瘤特異性重組水蛭素及表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞，至少能夠解決上述問題之一。

本發明思想的指導原則的關鍵是構建水蛭素衍生物，使水蛭素抗凝活性進行腫瘤靶向性釋放，即在正常條件下，該水蛭素衍生物無抗凝活性，而當位於腫瘤位置時，該水蛭素衍生物的抗凝活性才在腫瘤局部釋放，營造不易形成血栓的微環境，甚至溶解已形成的微小栓子以達到抗凝、溶栓、防止腫瘤細胞轉移的功能。這就克服了野生型水蛭素全身用藥引起系統性出血的風險。

尿激酶型纖溶酶原激活物(upa)簡稱尿激酶，它是纖溶酶原的主要激活物之一。upa是一個有嚴格底物限制的絲氨酸蛋白酶，切除纖溶酶原中的cys-pro-gly-arg560-val1561-val-gly-cys序列，形成纖溶酶。近年來發現upa系統成分在腫瘤組織以及循環血中的高表達與多種腫瘤的病理特點、預後相關,upa是一系列腫瘤浸潤和轉移的有力標誌，已成為腫瘤標誌物的研究熱點之一。upa的主要功能是參與基底膜的分解與再生，與腫瘤的轉移關係密切。其受體upar能與玻連蛋白結合，形成αvβ3-玻連蛋白-upar複合體。upa與upar結合後活性增強。這樣在腫瘤細胞表面αvβ3處富集了大量高活性upa。

水蛭素是由65～66個胺基酸組成的單鏈多肽，其n末端可以與凝血酶催化活性位點結合，具有抗凝活性，c末端與凝血酶的底物識別位點結合，對凝血酶有很強的特異性親和作用。本發明設計了一個封閉水蛭素n末端的措施，以達到降低該水蛭素衍生物的抗凝活性的目的，同時還具有腫瘤靶向尋的功能。當該水蛭素衍生物位於腫瘤微環境時，利用腫瘤微環境中富含upa酶的特點，使該水蛭素衍生物n末端被封閉的水蛭素重新回復為水蛭素原形，在腫瘤局部發揮特異性靶向抗凝作用，從而成為一類新型、安全、有效的腫瘤靶向性抗凝、抗栓、抗癌劑。

為實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種腫瘤特異性重組水蛭素，重組水蛭素的n末端含有可被upa識別並裂解的寡肽序列，用於重組的水蛭素為水蛭素異構體、水蛭素突變體、水蛭素嵌合體、截短的水蛭肽、基因修飾的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

進一步的，寡肽序列為可被upa識別並裂解的生理底物短肽，胺基酸序列為pro-gly-arg-val-val，即pgrvv；

或者，寡肽序列為可被upa識別並裂解的人工優化的短肽，其結構特徵為xnrvv，xn代表任意數量的任意胺基酸。

進一步的，重組水蛭素是在水蛭素異構體hv1的n末端修飾有寡肽pgr，同水蛭素異構體hv1的n端序列vv共同組成upa識別並裂解的生理底物肽序列pgrvv，重組水蛭素胺基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2；

或者，重組水蛭素是將野生型水蛭素hv1肽鏈的c端序列替換為野生型水蛭素hv3肽鏈的c端序列，再在其n末端修飾pgr寡肽，重組水蛭素胺基酸序列為：seqidno.7，基因序列為：seqidno.8；

或者，重組水蛭素是人白蛋白與n末端胺基酸是vv的水蛭素異構體hv1通過寡肽pgr連接而成的融合蛋白hph，融合蛋白hph的胺基酸序列為：seqidno.11，基因序列為：seqidno.12；

或者，重組水蛭素是人嵌合免疫球蛋白fc段與n末端胺基酸是vv的水蛭素異構體hv1通過寡肽pgr連接而成的融合蛋白fph，人嵌合免疫球蛋白fc段包含人igg4鉸鏈區、fc段序列和igm尾片序列，fph胺基酸序列為：seqidno.13，基因序列為：seqidno.14。

腫瘤細胞能夠營造腫瘤微環境，通過分析腫瘤微環境的特點，可以找到腫瘤靶向性的靶標。研究表明αvβ3在多種腫瘤細胞如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤及浸潤性黑色素瘤等表面高表達。在腫瘤組織新生血管內皮細胞中強烈表達，在成熟的血管內皮細胞和絕大多數正常組織中αvβ3的表達水平很低。在腫瘤組織中，腫瘤細胞分泌的生長因子使上皮細胞活化，其中整合素αvβ3的表達水平很高，這使得αvβ3成為腫瘤靶向治療的一個理想位點。與正常組織血管系統相比，腫瘤組織大量表達αvβ3，αvβ3在腫瘤組織新生毛細血管系統中的表達水平比正常組織高出很多。整合素αvβ3能識別細胞外基質蛋白，與其特異性結合，介導腫瘤細胞的粘附與遷移，在腫瘤的生長、浸潤、轉移尤其是血管生成中發揮重要作用。αvβ3能夠與多種含有rgd序列的蛋白結合，例如玻璃體結合蛋白、纖維結合蛋白、纖維蛋白素原、凝血酶敏感素及一些模擬rgd序列的內源性蛋白。一些設計的抗體或小分子量的αvβ3拮抗劑，在體內模型中能抑制血管內皮細胞與玻璃體結合蛋白之間的粘附，腫瘤的血管發生明顯減少。

在以往研究中，rgd序列常被作為靶向藥物的載體，將藥物靶向到表達整合素αvβ3的腫瘤血管系統去。rgd序列是作為纖維結合蛋白與細胞的結合位點被發現的，其基本識別位點由arg-gly-asp三個胺基酸組成。在rgd衍生物中，c(rgdfk)常被作為藥物的載體，因為賴氨酸殘基k是最理想的能夠同其他化學物質發生偶聯反應的基團。人們運用噬菌體技術發現了另外一種能和αvβ3特異性結合的rgd配體：含兩個二硫鍵的rgd序列(acdcrgdcfcg)，人們稱其為rgd4c。其結合能力是含一個二硫鍵rgd序列的20倍，是通常線性rgd序列的200倍。rgd4c的缺點是能夠形成不同的環狀結構，如果形成了附加的單環和二環結構，則其結合能力降低10倍。二者相比，c(rgdfk)穩定性較好而且容易與其他化學基團發生偶聯，更適合作為化學偶聯的載體。而rgd4c則適合作為運用重組技術設計的靶向藥物載體。

因此，重組水蛭素的n末端還連接有用於靶向整合素αvβ3的多肽，該多肽包含rgd序列。則可使上述重組水蛭素更好的靶向腫瘤微環境的整合素αvβ3。當rgd導向載體與腫瘤細胞表面αvβ3結合後，通過upa蛋白酶將水蛭素酶切釋放出來，發揮抗凝、抗栓和抗腫瘤作用。

進一步的，重組水蛭素是靶向整合素αvβ3的多肽rgd4c與n末端胺基酸是vv的水蛭素異構體hv1通過linker和寡肽pgr連接而成的融合蛋白rph，融合蛋白rph的胺基酸序列為：seqidno.9，基因序列為：seqidno.10。

目前已經了解，水蛭素分子的n末端是其核心部分，含三對二硫鍵(cys6-cys14，cys16-cys28，cys32-cys39)，使n末端肽鏈繞迭成密集形核心環肽結構，與凝血酶的催化活性位點結合；而c末端為一無規則伸展的鏈狀結構，其中gln49～gly54有空間和疏水作用，而asp55～pro60富含酸性胺基酸，帶有負電荷，易與凝血酶鹼性的底物識別位點結合。hv1/hv2的ser32-asp33-gly34-glu35(sdge)或hv3的ser32-asn33-gly34-lys35(sngk)為一突出於β-摺疊間的loop結構，構象自由，對活性無明顯作用。根據水蛭素的以上特性，將野生型水蛭素(hv1)肽鏈的ser32-asp33-gly34-glu35(sdge)替換為arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)或者arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)。rgd序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，存在於多種細胞外基質中，可與整合素αvβ3特異性結合。經過rgds或rgdm修飾的重組水蛭素可以更好的靶向腫瘤微環境的整合素αvβ3，通過upa蛋白酶將水蛭素酶切釋放出來，發揮抗凝、抗栓和抗腫瘤作用。

進一步的，重組水蛭素是將野生型水蛭素hv1肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-ser35，再在其n末端修飾pgr寡肽，重組水蛭素胺基酸序列為：seqidno.3，基因序列為：seqidno.4；

或者，重組水蛭素是將野生型水蛭素hv1肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-met35，再在其n末端修飾pgr寡肽，重組水蛭素胺基酸序列為：seqidno.5，基因序列為：seqidno.6。

相應地，本發明還提供了腫瘤特異性重組水蛭素的製備方法，包括以下步驟：化學合成上述的腫瘤特異性重組水蛭素基因片段，在其n末端連接信號肽，並在重組編碼基因的兩端添加限制性酶切位點，將重組編碼基因插入基因載體中製備重組載體，用該重組載體轉化或轉染宿主細胞，培養宿主細胞，並從中回收和純化該腫瘤特異性重組水蛭素，宿主細胞為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

相應地，本發明還提供了上述腫瘤特異性重組水蛭素在製備抗凝、抗血栓、防治腫瘤的藥物中的應用，尤其是防治腫瘤伴發高凝狀態和血栓性病變的藥物、保健品和功能性食品中的應用。

相應地，本發明還提供了表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞製備方法，體外培養人源免疫細胞，將人源分泌型信號肽編碼基因與上述的腫瘤特異性重組水蛭素的編碼基因相連，並在重組編碼基因的兩端添加限制性酶切位點，將編碼基因插入載體中製備成重組基因載體，轉染免疫細胞，獲得表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞。

進一步的，人源分泌型信號肽為人醯胺化酶信號肽，其胺基酸序列為：seqidno.15，基因序列為seqidno.16。

進一步的，免疫細胞為αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一種或多種，免疫細胞為人源免疫細胞。

進一步的，過繼免疫細胞的膜表面表達有靶標分子，靶標分子通過跨膜序列定位在細胞膜表面。

進一步的，靶標分子為cd19的全長或其截短片段，或cd20的全長或其截短片段。

進一步的，靶標分子及跨膜段的結構為：gm-csfr信號肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段。其胺基酸序列為：seqidno.17，基因序列為seqidno.18。

以過繼免疫細胞為載體，在腫瘤患者體內持續穩定表達腫瘤特異性重組水蛭素，發揮「微型細胞藥廠」的作用，既將細胞過繼免疫治療技術與腫瘤靶向性重組水蛭素的防栓抗癌功能整合，更好的發揮抗腫瘤作用，又可通過在體內長期穩定表達腫瘤特異性重組水蛭素，避免反覆注射腫瘤特異性重組水蛭素引起潛在的過敏反應。

相應地，本發明還提供了上述表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞的應用，用於抗凝、抗血栓、防治腫瘤的生物治療，尤其是防治伴有高凝狀態和/或血栓的腫瘤患者的生物治療。

本發明的有益效果為：本發明的腫瘤特異性重組水蛭素的n末端含有可被upa識別並裂解的短肽序列，可以封閉水蛭素n末端的凝血酶催化活性位點，以達到降低該水蛭素衍生物的抗凝活性、減少出血副作用的目的，同時還具有腫瘤靶向尋的功能，當該水蛭素衍生物位於腫瘤微環境使時，利用腫瘤微環境中富含upa酶的特點，特異性切除該水蛭素衍生物n末端的封閉肽，使被封閉的水蛭素重新回復為水蛭素原形，在腫瘤局部發揮特異性抗凝作用，從而成為一類新型、安全、有效的腫瘤靶向性抗凝、抗栓和抗癌劑。本發明更進一步的提供了表達腫瘤特異性重組水蛭素的免疫細胞，通過以過繼免疫細胞為載體，在體內持續表達腫瘤特異性重組水蛭素，可解決水蛭素半衰期短的弊端，無需短時間內反覆給藥，可避免反覆給藥引起過敏或誘導抗體產生，更加適合需要長期抗凝、抗栓的腫瘤患者。表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞可靶向腫瘤局部表達，改善腫瘤患者高凝狀態，溶解微血栓，防止腫瘤轉移，促進免疫細胞進入腫瘤內部發揮殺傷功能，可單獨應用或臨床配合化/放療使用。

具體實施方式

下面對本發明作進一步說明。

本發明的腫瘤特異性重組水蛭素的n末端含有可被upa識別並裂解的寡肽序列，upa為腫瘤組織高表達的尿激酶型纖溶酶原激活物，用於重組的水蛭素為水蛭素異構體、水蛭素突變體、水蛭素嵌合體、截短的水蛭肽、基因修飾的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

天然水蛭素有多種異構體，其中三種主要異構體分別為hirudinvariant1(hv1)、hirudinvariant2(hv2)、hirudinvariant3(hv3)。

hv1的氨基末端的兩個胺基酸為vv，upa的生理底物序列為pgrvv，酶切後斷裂點位為pgr↓vv。

在hv1的n末端連接上pgr短肽，或sgr、gsgr、ggsgr等具有同等功效的短肽，與hv1的n末端的兩個vv共同組成upa的底物序列pgrvv，當被upa自r和v之間裂解後，可完整釋放水蛭素的抗凝活性。

進一步的，寡肽序列為可被upa識別並裂解的生理底物短肽，胺基酸序列為pgrvv；

或者，寡肽序列為可被upa識別並裂解的人工優化的短肽，其結構特徵為xnrvv，xn代表任意數量的任意胺基酸。

進一步的，重組腫瘤特異性水蛭素的n末端還連接有用於靶向整合素αvβ3的多肽，該多肽包含rgd序列。則可使上述水蛭素衍生物更好的靶向腫瘤微環境的整合素αvβ3。具體的rgd序列為rgd4c序列。當rgd4c導向載體與腫瘤細胞表面αvβ3結合後，通過upa將水蛭素原形釋放出來，發揮抗凝、抗栓和抗腫瘤作用。

相應地，本發明還提供了上述腫瘤特異性重組水蛭素的製備方法，包括以下步驟：化學合成上述的腫瘤特異性重組水蛭素基因片段，在其n末端連接信號肽，並在重組編碼基因的兩端添加限制性酶切位點，將重組編碼基因插入基因載體中製備重組載體，用該重組載體轉化或轉染宿主細胞，培養宿主細胞，並從中回收和純化該腫瘤特異性重組水蛭素，宿主細胞為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

用於重組的載體優選的為真核表達載體，優選的為ppic9k。宿主細胞優選的為甲醇營養型酵母菌株gs115。

相應地，本發明還提供了表達上述腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞製備方法，將人源分泌型信號肽編碼基因與上述的腫瘤特異性重組水蛭素的編碼基因相連，製備成重組基因載體，轉染免疫細胞，獲得表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞。

該過繼免疫細胞的膜表面表達有靶標分子，靶標分子通過跨膜序列定位在細胞膜表面，腫瘤特異性重組水蛭素直接表達或通過偶聯誘導表達系統進行誘導表達。靶標分子為cd19的全長或其截短片段，或cd20的全長或其截短片段。

相應地，本發明表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞，腫瘤特異性重組水蛭素可以組成性表達，也可以偶聯誘導表達系統進行誘導表達。偶聯誘導表達系統可以是四環素誘導表達系統、蛻皮激素(ecdysone)誘導表達系統、他克莫司(tacrolimus，fk506)/雷帕黴素(rapamycin)誘導系統或ru486誘導系統中的一種。免疫細胞為αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一種或多種，免疫細胞為人源免疫細胞。

表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞還表達自殺基因/前藥系統。自殺基因/前藥系統為單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環鳥苷(hsv-tk/gcv)系統、帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(vzv-tk/ara-m)系統、胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(cd/5fc)系統、細胞色素p450微粒體酶cyp2b1/環磷醯胺(cyp2b1/cpa)系統；細胞色素p450cyp4b1/氨基蒽(cyp4b1/2aa)系統、脫氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dck/ara-c)系統、烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶/6-硫黃嘌呤(gpt/6tx)系統、硝基還原酶/cb1954(ntr/cb1954)系統、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脫氧核苷(pnp/6-mep-dr)系統、胸腺嘧啶磷酸化酶/5』-脫氧-5-氟尿嘧啶(tp/5』-dfur)系統、羧基肽酶g2/cmda系統(cpg2/cmda)、羧酸酯酶/cpt-11(ce/cpt-11)系統中的一種。

上述的表達腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細胞的製備方法，包括以下步驟：製備編碼腫瘤特異性重組水蛭素和膜型分子靶標的基因載體，基因載體中包括(信號肽序列-腫瘤特異性重組水蛭素序列)和(信號肽序列-靶標分子序列-linker-跨膜段序列)兩段基因序列；將上述編碼腫瘤特異性重組水蛭素和靶標分子的基因載體通過基因工程技術轉染免疫細胞。

基因工程技術為公知技術，所用基因轉染系統包括慢病毒轉染系統、逆轉錄病毒轉染系統、腺病毒轉染系統、腺相關病毒轉染系統、睡美人轉座子轉染系統、質粒電轉染系統。優選的，採用睡美人轉座子轉染系統或電轉染系統。以瞬時表達載體，將腫瘤特異性重組水蛭素基因導入過繼免疫細胞，可使其外源基因表達量可控，避免過量表達的風險。

編碼腫瘤特異性重組水蛭素和膜型分子靶標的基因載體的結構為：信號肽-腫瘤特異性重組水蛭素-ires-信號肽-靶標分子-linker-跨膜段，或者，信號肽-靶標分子-linker-跨膜段-p2a-信號肽-腫瘤特異性重組水蛭素。

下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

實施例1

本實施例的重組水蛭素是在水蛭素異構體hv1的n末端修飾有寡肽pgr，同水蛭素異構體hv1的n末端序列vv(纈氨酸-纈氨酸)共同組成可被upa識別並裂解的生理底物肽序列pgrvv，重組水蛭素胺基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2。

其中，pgrvv可被其它upa酶切底物肽序列替換，其共同特點為包含有rv序列，如：gsgrvv，ggsgrvv，lggsgrvv。以保證經upa酶切後，釋放的水蛭素氨基末端的兩個胺基酸為vv。水蛭素異構體hv1可被其它n末端為vv的水蛭素異構體替換。