用作免疫調節劑和抗癌藥的滷代雷公藤內酯醇衍生物的製作方法

2023-12-05 15:53:51 2

專利名稱：用作免疫調節劑和抗癌藥的滷代雷公藤內酯醇衍生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用作免疫抑制劑、抗炎劑和抗癌藥的化合物。
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背景技術：
免疫抑制劑廣泛地用於治療自身免疫性疾病以及用於治療或預防移植物排斥，包括治療移植物抗宿主疾病(GVHD)。常見的免疫抑制劑包含硫唑嘌呤、皮質類固醇、環磷醯胺、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、長春新鹼和環孢黴素A。總的來說，這些藥品中沒有一種是完全有效的，並且大多數受到嚴重毒性的限制。例如，廣泛使用的環孢黴素A對腎具有明顯的毒性。此外，進行有效治療所需的劑量可能會使患者對各種機會性入侵物感染的敏感性增加。
已經鑑定出從中藥植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)(TW)中衍生的許多化合物具有免疫抑制活性，例如，可用於治療自身免疫性疾病和用於治療或預防移植物排斥，包括治療移植物抗宿主疾病(GVHD)。也有報導說雷公藤內酯醇和某些衍生物及其前藥顯示出抗癌活性。例如參見Kupchan et al.，1972，1977，以及共有的美國專利6,620,843(2003年9月)，它們作為參考併入本文。
一般情況下，發現雷公藤內酯醇衍生物本身的生物活性小於天然的雷公藤內酯醇。然而，相對於天然的雷公藤內酯醇，這些化合物在諸如藥物動力學或生物分布方面往往表現良好，這是由於它們在脂質或水溶性方面的差異和/或作為前藥的活性造成的。例如參見，Jung etal.，美國專利5,972,998和6,004,999，Kupchan et al.，美國專利4,005,108，Lipsky et al.，美國專利5,294,443和Qian et al.，美國專利5,430,054，以及共有的美國專利6,150,539(雷公藤內酯醇前藥具有很高的水溶性)、5,962,516(免疫抑制化合物和方法)、5,843,452(免疫療法組合物和方法)、5,759,550(用於抑制異種移植物排斥的方法)、5,663,335(免疫抑制化合物和方法)和5,648,376(免疫抑制的二萜化合物)，以及其中被引用的參考文獻。
發明概述一方面，本發明提供了可用於免疫抑制、消炎和抗癌治療的化合物。這些化合物是以結構式I表示的雷公藤內酯醇衍生物
其中CR1R2選自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13選自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12選自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；CR3R4R5選自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中在R1-R13中至少有一個包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有兩個並優選至多有一個包含氟或氧；另外，當CR1R2是CHOH時，CR3R4R5不是CH2F。
優選地，關於CR7R8的立體化學是當CR7R8是CHOH時，具有β-羥基構型，當CR7R8是CHF時，具有α-氟構型。相似地，關於CR9R10的立體化學優選為當CR9R10是CHOH時，具有β-羥基構型，並且當CR9R10是CHF時，具有α-氟構型。
在結構式I的優選實施方案中，CR1R2是CHF，具有α-氟構型。
優選實施方案也包含如下那些化合物，其中選自CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CRR9R10或CR11R12的碳中心中剛好有一個包含氟。更優選地，在CR1R2、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中剛好有一個包含氟。
在可選的實施方案中，只有CR1R2包含氟。相應地，在這些實施例中CR1R2選自CF2、CHF或C(CF3)OH。關於CR1R2的立體化學優選是當CR1R2是C(CF3)OH時，具有β-羥基構型，當CR1R2是CHF時，具有α-氟構型。
在結構式I的其它可選實施方案中，CR9R10或CR3R4R5包含氟，並且CR1R2包含氧；優選CR1R2是C＝O，或者更優選是CHOH(β-羥基)。在這些實施方案中，例如，CR9R10選自CF2或CHF(優選α-氟)，或者CR3R4R5選自CHF2或CF3。
在結構式I進一步選擇的實施方案中，CR7R8或CR11R12包含氟，並且CR1R2包含氧；優選CR1R2是C＝O，或者更優選是CHOH(β-羥基)。在這些實施方案中，例如，CR7R8選自CF2或CHF(優選α-氟)，或者CR11R12選自CF2或CHF。
在其它方面，本發明提供了用於影響免疫抑制的方法以及誘導細胞內細胞凋亡的方法，從而可有效地用於抗類風溼性治療，特別是抗癌治療。所述方法包括將有效量的、本文所述的具有結構式I的化合物分別給藥到需要這種治療的患者或與所述細胞接觸。此外，本發明包括具有結構式I的化合物在製備可影響免疫抑制或可誘導細胞內細胞凋亡藥物的用途。典型地，該化合物提供了藥學可接受載體。所述方法和用途的特定實施方案可以採用本文描述的關於結構式I的任何特定實施方案。
當結合附圖來閱讀本發明的下列詳細描述時，本發明的上述和其它目的及特徵將會變得更加明顯。


圖1顯示出與雷公藤內酯醇(指定為PG490)相比較，本發明化合物14-脫氧-1-α-氟-雷公藤內酯醇(指定為PG763)在Jurkat細胞內的細胞毒素影響(實施例2)；圖2顯示出與雷公藤內酯醇相比較，本發明化合物(PG763)在Jurkat細胞內對IL-2產物的抑制(實施例4)；圖3A-B顯示出與雷公藤內酯醇相比較，通過對比化合物14-α-羥基雷公藤內酯醇(即epitriptolide；指定為PG524)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤內酯醇(指定為PG691)在Jurkat細胞內劑量依賴性誘導的細胞凋亡(實施例3)；以及圖4A-B顯示出與雷公藤內酯醇相比較，通過對比化合物14-α-羥基雷公藤內酯醇(即epitriptolide)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤內酯醇在Jurkat細胞內對IL-2產物的抑制(實施例4)。
發明詳述I.雷公藤內酯醇衍生物為了實現本發明公開的目的，使用以下編號方案對雷公藤內酯醇和雷公藤內酯醇衍生物進行編號 如本文進一步描述的，本發明化合物為通過將雷公藤內酯醇C1、C2、C5、C14、C15、C16和/或C19位，優選C2、C14或C16位的一個或多個羥基或氫原子用滷素原子，優選氯或氟，並且最優選氟，進行取代而得到的衍生物。更具體地，本發明化合物用以下結構式I表示 其中CR1R2選自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13選自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12選自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；CR3R4R5選自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一個包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有兩個並優選至多有一個包含氟或氧，和；當CR1R2是CHOH時，CR3R4R5不是CH2F。
優選地，關於CR7R8和CR9R10的立體化學是CHOH具有β-羥基構型，CHF具有α-氟構型。
在結構式I的優選實施方案中，CR1R2是CHF(α)。(如本文使用的，符號「CHX(α)」或「CHX(β)」分別表示非氫取代基X具有α或β構型)。更優選地，在這些實施方案中，僅CR1R2包含氟。仍然更優選地，在這些實施方案中，僅CR9R10和/或CR3R4R5包含氧；例如，CR9R10和/或CR3R4R5中的一個或兩個，優選一個，是CHOH(對於CR9R10，優選CHOH(β))。可供選擇地，在這些實施方案中，CR3R4R5、CR6、R7R8、CR9R10、CR11R12和CR13都不包含氧。
結構式I的優選實施方案也包含這些化合物，它們的選自CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10或CR11R12中的碳中心剛好包含一個氟。更優選地，CR1R2、CR7R8、CR9R10和CR11R12中剛好有一個包含氟。優選地，在這些實施方案中，僅CR9R10和/或CR3R4R5包含氧；例如CR9R10和/或CR3R4R5中的一個或兩個，優選一個，是CHOH(對於CR9R10，優選CHOH(β))。可供選擇地，在這些實施方案中，CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13都不包含氧。
在結構式I的挑選出來的實施方案中，僅CR1R2包含氟。相應地，CR1R2選自CF2、CHF或C(CF3)OH。優選地，CR1R2的立體化學是C(CF3)OH為C(α-CF3)β-OH，或者CHF為CH(α-F)。
在結構式I的其它可選實施方案中，CR9R10或CR3R4R5包含氟並且CR1R2包含氧；優選CR1R2為C＝O，或者更優選為CHOH(β-羥基)。在這些實施方案中，CR9R10為CF2或CHF(優選α-氟)，CR3R4R5優選為CHF2或CF3。
在結構式I進一步可選擇的實施方案中，CR7R8或CR11R12包含氟並且CR1R2包含氧；優選CR1R2為C＝O，或者更優選為CHOH(β-羥基)。在這些實施方案中，CR7R8為CF2或CHF(優選α-氟)，CR11R12為CF2或CHF。
本發明還包括與結構式I的化合物相似的化合物，其中，氟用不同的滷素原子如氯、溴或碘特別是氯取代；例如，14-脫氧-14α-氯雷公藤內酯醇。這種化合物其它可選擇的和優選的實施方案對應於以上所描述的具有結構式I的氟代化合物。
A.製備本發明化合物可以從雷公藤內酯醇或其羥基化衍生物製備。後者包括雷公藤羥內酯(2-羥基雷公藤內酯醇)或16-羥基雷公藤內酯醇，它們和雷公藤內酯醇一起，可以從中藥植物雷公藤(TW)的根木質部獲得或從其它已知來源獲得。在中國福建省以及其它華南省份發現了TW植物；TW植物原料通常可在中國得到，或從美國經商業渠道購得。用於獲得雷公藤內酯醇、雷公藤羥內酯和16-羥基雷公藤內酯醇的方法為本領域已知的，並且在例如Kupchan et al.(1972，1977)；Lipsky et al.(1994)；Pu et al.(1990)；和Ma et al.(1992)中進行了描述。
雷公藤內酯醇的5-羥基衍生物可以通過二氧化硒氧化雷公藤內酯醇而製得，如在共有的美國臨時申請系列號為60/532,702中所描述的。簡而言之，在典型的製備方法中，雷公藤內酯醇和約2.2當量的二氧化硒溶在二氧雜環乙烷中，該溶液在約90℃下，N2中攪拌72小時。
如L.Ning et al.(Tetrahedron 59(23)4209-4213，2003)所描述的，用短刺小克銀漢黴菌(Cunninghamella blakesleana)培育雷公藤內酯醇得到上述羥基衍生物和1β-羥基雷公藤內酯醇、triptolidenol(15-羥基雷公藤內酯醇)、19α-羥基雷公藤內酯醇和19β-羥基雷公藤內酯醇。採用標準方法分離上述產品，即用乙酸乙酯提取過濾的培養液，濃縮並將殘留物進行矽膠色譜。
具有結構式I的化合物可以通過雷公藤內酯醇、其羥基衍生物或其氧化衍生物製備得到，通過將C1、C2、C5、C14、C15、C16和/或C19位上的羥基或含氧基與氟化劑反應，在所述碳上分別形成CHF或CF2基團。
在參考文獻如Chemistry of Organic Fluorine CompoundsII(editorsM.Hudlicky和A.E.Pavlath；ACS Monograph 187，1995)和Organofluorine ChemistryPrinciples and Commercial Applications(editorsR.E.Banks，B.E.Smart和J.C.Tatlow；Plenum Press，1994)中對這些氟化劑進行了描述。例如，適合於將羥基(C-OH)轉化為C-F的試劑包含HF-胺絡合物，如HF-吡啶(Olah′s試劑)或HF-2，4，6-三甲基吡啶、四氟化硫(SF4)和各種SF4衍生物，包括(二乙基氨基)三氟化硫(DAST)、(二甲基氨基)三氟化硫(甲基-DAST)、嗎啉啉代三氟化硫(morph-DAST)和[雙(2-甲氧基乙基)氨基]三氟化硫(Deoxo-FluorTM)。羥基可以首先轉化為離去基團如三氟甲基磺酸根，其隨後被親核氟化物試劑如三(二甲基氨基)硫(三甲矽烷基)二氟化物(TAS-F)、4-正丁基銨二氟三苯基矽酸鹽或無機鹽如KF、CsF或Bu4NF取代。這些反應通常會發生立體化學轉化，如以下說明的。
例如，如在實施例1中所描述的，在C14位具有β-羥基的天然的雷公藤內酯醇，可通過與DAST反應而轉化為14-脫氧-1-α-氟雷公藤內酯醇(本文指定為PG763)。可供選擇地，epitriptolide(14-α-雷公藤內酯醇，本文指定為對比化合物PG524)可用於製備14-脫氧-14-β-氟雷公藤內酯醇。
類似地，雷公藤羥內酯(在C14和C2位具有β-羥基)可以轉化為14-脫氧-2α，14α-二氟雷公藤內酯醇。如果使用有限量的氟化劑，該化合物可作為與-α-氟雷公藤內酯醇的混合物而得到(參見下文)。
16-羥基雷公藤內酯醇與化學計量量的或過量的氟化劑反應生成14-脫氧-14α，16-二氟雷公藤內酯醇，如以下所示。
如以上所列舉的，四氟化硫及其衍生物也是最常用的氟化劑，用於將氧代基團(例如醛或酮)轉化為偕二氟化物。同樣適合的試劑為2，2-二氟-1，3-二甲基咪唑啉(DFI)。
在雷公藤內酯醇C2、C14和/或C16位的氧代基團可通過將一個或多個羥基氧化為酮或醛基而形成。在參考文獻如M.Hudlicky，Oxidations in Organic Chemistry(ACS Monograph Series 186，1990)，R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations(第2版，Wiley，1999)，或J.March，Advanced Organic Chemistry(第4版，Wiley，1992)中描述了氧化劑以及適用於選擇性氧化醇的方法。應當避免強酸性或強鹼性條件。如果需要的，可採用，例如HPLC將所需產品與任何副產品分離。
例如，雷公藤內酯醇C14位的仲醇可採用例如三氧化鉻-吡啶絡合物、CrO2Cl2/氧化鋁或相應的氧化劑，從而氧化為酮(生成已知的化合物雷藤酮)。例如，與DAST反應生成14-脫氧-14，14-二氟雷公藤內酯醇，如下所示。
雷公藤羥內酯的兩種仲醇(2-羥基雷公藤內酯醇)也可以均採用所述氧化劑氧化為酮。與DAST或另一種適當的試劑反應生成如下所示的四氟化合物。當所用的試劑量有限時，也可以獲得2，2-二氟化合物，如下所示。

可供選擇地，在溫和的條件下，採用化學計量量的如上指出的氧化劑，可以將雷公藤羥內酯C2位的位阻較小的醇選擇性地氧化為酮。為了氧化16-羥基雷公藤內酯醇的仲醇和伯醇，優選採用不會進一步將產物醛氧化的試劑，例如DMSO、氯鉻酸吡啶(Corey′試劑)或硝酸銨鈰，以生成酮-醛中間體。酮醛與DAST或其它合適的試劑反應生成以下所示的四氟化合物。同樣，當氟化劑的用量有限時，也可以獲得14-氧-16，16-二氟化合物，如下所示。
採用試劑如RuCl2(PPh3)3、(Me3SiO)2/催化的RuCl2(PPh3)3、DMSO/ClCOCOCl/Et3N或DMSO/吡啶.SO3/i-Pr2NEt(參見上面引用的Larock)，也可以選擇性地氧化16-羥基雷公藤內酯醇的伯醇。該醛隨後可轉化為16，16-二氟雷公藤內酯醇，如下所示。
C16位的伯羥甲基(-CH2OH)也可以通過先氧化為羧酸，然後與SF4反應從而轉化為三氟甲基，如以下的反應歷程所示
可以在C14位或另外含有仲或伯羥基的中心，例如Cl、C2、C16或C19位，通過先氧化為酮，接著與三氟甲基三甲基矽烷反應，從而引入三氟甲基基團。如以下的反應歷程所示 類似的化合物通常可採用類似方法製備，其中，氟用不同的滷素原子取代。將C-OH轉化為C-X的方法為本領域已知的，其中X為Cl、Br或I。用於製備氯化物的試劑包括例如SOCl2或PCl5、POCl3等。同樣，推薦的路徑為將羥基轉化為離去基團如甲苯磺酸鹽或三氟甲基磺酸根，隨後與滷化物試劑反應。例如參見，Larock，ComprehensiveOrganic Transformations(VCH，New York，1989)，p.360。也可以用與SF4類似的方式使用PCl5，以便從醛或酮形成偕二氯化物。
B.生物活性如上所述，雷公藤內酯醇的多種衍生物和類似物為本領域已知的，並且許多是可藥用的。相對於天然的雷公藤內酯醇，這些化合物由於在脂質或水中溶解性的變化和/或作為前藥等方面的活性，經常可以表現出藥物動力學或生物分布等方面的優勢。然而，總的來說，這些衍生物和類似物本身的生物活性小於天然的雷公藤內酯醇。
特別是，本領域通常認為在14位，優選14β位，氫供體基團的存在對於維持雷公藤內酯醇衍生物的生物活性是重要的。例如參見本文圖3A-B和4A-B中的比較數據。如圖3A和4A所示，14-α-雷公藤內酯醇在C14位具有α-羥基立體化學，同時具有免疫抑制和細胞凋亡活性，其活性明顯弱於雷公藤內酯醇(在免疫抑制分析中，功效大約小30倍；在細胞凋亡分析中，功效小25倍)。在C14位具有14β立體化學並具有負電取代基但不是氫供體基團的化合物中，即14β-(甲硫基)甲基雷公藤內酯醇，可以看到相對於雷公藤內酯醇，生物活性下降較大(圖3B和4B)(在免疫抑制分析中，大約小60倍；在細胞凋亡分析中，小40倍)。
因此，鑑於本領域的現狀，本發明的14-脫氧-14α-氟化合物(PG763)所具有的非常高的生物活性是驚人的，由於其在14位缺少氫供體基團。如圖1-2所示，在評估細胞毒性和IL-2抑制性的分析中，PG763的活性近似等同於雷公藤內酯醇。
因此，14-脫氧-14α-氟化合物為本文公開的結構式I特別優選的實施方案。在特定的實施方案中，化合物為PG763。
II.治療組合物含有本發明雷公藤內酯醇衍生物的製劑可採用固體、半固體、凍乾粉形式，液體劑型，如片劑、膠囊、粉末、持續釋放的製劑、溶液、懸浮液、乳濁液、軟膏、洗液或氣溶膠，優選適用於準確劑量、簡單給藥的單位劑型。典型地，該組合物包含常規的藥學載體或賦形劑，並且還可以包含其它藥劑、載體或輔劑。
優選地，該組合物含有約0.5％-75重量％的一種或多種本發明化合物，其餘由適當的可藥用賦形劑組成。對於口服給藥來說，賦形劑包含藥用級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂及其它類似物。如果需要，該組合物還可以含有少量的無毒助劑物質，例如潤溼劑、乳化劑或緩衝劑。
該組合物可以經口服、透皮或經非腸道給藥到患者，例如，通過靜脈內、皮下、腹膜內或肌內注射。以口服液體製劑使用，可以將該組合物製成溶液、懸浮液、乳液或糖漿，以液體形式或適用於在水或生理鹽水中水合的乾燥形式給藥。對於非腸道給藥來說，可注射的非腸道給藥組合物典型地含有溶解在適當的靜脈注射溶液，例如無菌生理鹽水溶液中的雷公藤內酯醇衍生物。
通過將雷公藤內酯醇衍生物(約0.5％-約20％)以及可選的可藥用輔劑溶解或分散在藥學可接受的載體，例如鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油或乙醇中，形成溶液或懸浮液來製備液體組合物。
該化合物也可以通過吸入給藥，採用固體或液體氣溶膠顆粒的形式，優選具有可吸入的粒度。該顆粒小到一經吸入即能通過口和喉進入支氣管和肺泡。通常，可吸入的粒度為約1-10微米，優選小於約5微米。吸入給藥的液體組合物含有分散在含水載體，例如無菌無致熱物的鹽水溶液或無菌無致熱物的水中的活性物質。如果需要，該組合物可以與推進物混合以有助於該組合物的噴霧並形成氣溶膠。
製備該劑型的方法是已知的，或者對於本領域技術人員來說是顯而易見的；例如參見Remington′s Pharmaceutical Sciences(第19版，Williams Wilkins，1995)。該給藥組合物含有一定有效量的所選化合物，用於影響患者的免疫抑制或靶細胞中的細胞凋亡。
如Panchagnula et al.(2000)所描述的，藥學試劑的分配係數或logP可影響其對於各種給藥途徑的適宜性，包含口服生物利用度。本文描述的化合物通過用氟取代了一個或多個羥基，預期具有比母化合物雷公藤內酯醇更高的logP計算值，從而使它們成為口服利用度更好的候選藥物。
III.免疫調節和抗炎治療如圖2所示，具有結構式I的化合物，14-脫氧-1-α-氟雷公藤內酯醇(指定為PG763)，在Jurkat細胞內以劑量依賴性方式抑制IL-2產物(參見實施例4)，其使用的濃度相當於採用雷公藤內酯醇進行的類似分析。因此，本發明包含本發明化合物作為免疫抑制劑的用途，例如輔助用於移植操作或用於自身免疫性疾病的治療中。
已表明，免疫調節異常存在於多種自身免疫和慢性發炎疾病中，包含全身紅斑狼瘡、慢性風溼性關節炎、I和II型糖尿病、腸炎、膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、多發性硬化和其它紊亂如克隆病、潰瘍性結腸炎、類天皰瘡、類肉狀瘤病、牛皮癬、魚鱗癬、格雷夫斯眼病和哮喘。儘管這些症狀的潛在發病機理可以明顯不同，但它們都具有相同的多種自身抗體和自反應淋巴細胞表現。這種自反應可能部分是由於喪失了體內平衡控制，正常免疫系統在該平衡下運行。
類似地，在從含有成熟淋巴細胞的供體組織源進行骨髓移植或其它造血幹細胞移植之後，轉移的淋巴細胞將宿主組織抗原識別為外來的。這些細胞變為激活的並對宿主發起可能是致命的進攻(移植物對宿主反應)。此外，器官移植後，宿主淋巴細胞識別器官移植物的外來組織抗原並發動細胞內抗體介導的免疫反應(宿主對移植物反應)，導致移植物受損和排斥。
自身免疫或排斥反應的一種結果就是由發炎細胞及其釋放的介體所引起的組織受損。抗炎劑如NSAID主要通過阻斷這些介體的影響或分泌而起作用，但不改變疾病的免疫學基礎。另一方面，細胞毒素劑，如環磷醯胺以同時阻斷正常的和自身免疫反應的非特異性方式起作用。實際上，採用這種非特異性免疫抑制劑治療的病人，正如他們會死於自身免疫性疾病一樣，有可能死於感染。
本發明組合物可用於已證明雷公藤內酯醇及其前藥和其它衍生物是有效的那些應用中，例如用於免疫抑制治療如治療自身免疫性疾病、預防移植物排斥、治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)。例如參見共有的美國專利6,150,539，其作為參考併入本文。雷公藤內酯醇以及本文的衍生物也有效地用於治療其它炎性疾病例如創傷炎症和男性生育力下降。
該組合物可用於抑制實質器官移植物、組織移植物或來自相互排斥的人供體的細胞移植物的排斥，從而延長了移植物的生存時間和功能，以及受體的生存時間。這種用途將包括，但並非局限於，實質器官移植物(如心臟、腎和肝臟)、組織移植物(如皮膚、腸、胰腺、生殖腺、骨和軟骨)和細胞移植物(如來自胰腺、腦和神經組織、肌肉、皮膚、骨、軟骨和肝臟的細胞)。
該組合物也有效地用於抑制異種移植物(種間)排斥，即預防來自非人動物的實質器官移植物、組織移植物或細胞移植物的排斥，不論其是在構成上或生物工程上(遺傳可控制的)能夠表達人基因、RNA、蛋白質、肽或其它非天生的異種分子，或是生物工程上不能表達動物的天生基因、RNA、蛋白質、肽缺乏表達或其它正常表達的分子。本發明也包含如上所述組合物用於延長來自於非人動物的這種實質器官移植物、組織移植物或細胞移植物的生存時間的用途，。
本發明也包括治療自身免疫性疾病或具有自身免疫表現的疾病的方法，如艾迪生病、自身免疫溶血性貧血、自身免疫甲狀腺、克隆病、糖尿病(I型)、格雷夫斯病、吉-巴症候群、全身紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、多發性硬化、重症肌無力、牛皮癬、原發性膽汁性肝硬變、風溼性關節炎和葡萄膜炎、哮喘、動脈硬化症、甲狀腺炎、過敏性腦脊髓炎、腎小球腎炎和各種過敏症。
其它用途可以包括治療和預防發炎和高增生的皮膚疾病以及皮膚表現免疫介導的疾病，如牛皮癬、遺傳過敏皮炎、天皰瘡、風疹、皮膚嗜酸細胞增多、粉刺和禿頭斑；各種眼病，如結膜炎、葡萄膜炎、角膜炎，以及類肉狀瘤病；粘液和血管發炎，如胃潰瘍、由缺血性疾病和血栓症引起的脈管損傷、缺血性腸病、發炎性腸病和壞死的小腸結腸炎；腸炎/敏感症，如腹腔疾病和潰瘍性結腸炎；腎病，如間質腎炎、古德帕斯丘症候群、溶血性尿毒症症候群和糖尿病腎病；造血疾病，如突發性血小板減少紫癜和自身免疫溶血性貧血；皮膚病，如皮肌炎和皮膚T細胞淋巴瘤；血循環疾病，如動脈硬化和動脈硬化症；腎病，如缺血性急性腎機能不全和慢性腎機能不全；和貝赫切特病。
本發明的組合物和方法也有效地用於治療炎症，如具有內源性和外源性表現的哮喘，例如，支氣管哮喘、過敏性哮喘、內源性哮喘、外源性哮喘和灰塵哮喘，特別是慢性或習慣性哮喘(例如，晚年哮喘和氣道高度響應)。所述組合物和方法也可以用於治療其它炎性病症，包含外傷性發炎、萊姆關節炎疾病中的發炎、慢性支氣管炎(慢性傳染性肺病)、慢性竇炎與急性呼吸窘迫症候群相關的膿毒病和肺部類肉狀瘤病。對於治療呼吸症狀如哮喘，所述組合物優選通過吸入給藥，但任何常規的給藥途徑也是可用的。
在治療自身免疫症狀時，以足以減輕症狀並改善患者舒適度的劑量對患者定期給藥，例如每周1-2次服用該組合物。特別是對於治療風溼性關節炎，該組合物可以通過靜脈內注射或直接注射入感染的關節中。可以在患者的疾病症狀發生後的幾周內，以至少24小時的間隔對患者重複治療。給藥劑量範圍優選為1-25mg/kg患者體重/天，較低的劑量優選用於非腸道給藥，較高的劑量優選經口服給藥。按照本領域的已知方法，通過常規試驗可以確定最佳劑量。
對於移植物排斥治療，該方法尤其包含治療心臟、腎、肝臟、細胞和骨髓移植物的排斥，並且還可用於治療GVHD。對於急性移植物排斥，治療通常是在移植手術前不久或手術後不久，在圍手術期(perioperatively)開始，並且實施每天給藥方案，持續進行至少幾周的治療。在治療期間，可以通過例如，包含同種移植淋巴細胞的混合淋巴細胞反應或通過對移植組織進行活組織切片檢查，定期對患者的免疫抑制水平進行檢測。
此外，該組合物還可以通過長期給藥來預防移植物排斥或治療晚期移植物排斥急性發作。如上所述，給藥劑量優選為1-25mg/kg患者體重/天，較低的劑量優選經非腸道給藥，較高的劑量優選經口服給藥。根據患者的反應以及治療期間患者抵抗感染的能力，該劑量可以適當增加或減少。
在治療或預防源於向匹配的或不匹配的骨髓、脾細胞、胎組織、臍帶血或固定的或其它採集的幹細胞受體移植引起的移植物抗宿主疾病時，該疾病劑量優選0.25-2mg/kg體重/天，並優選0.5-1mg/kg/天，經口服或經非腸道給藥。
本發明的範圍也包含具有結構式I的化合物和一個或多個常規的免疫抑制劑的結合治療。處於本發明範圍內的這些免疫抑制劑包含，但不局限於，IMUREK(硫唑嘌呤鈉)、brequinar鈉、SPANIDIN(gusperimus三鹽酸化物，也稱脫氧精液蛋白)、mizoribine(也稱布雷青黴素)、細胞CEPT(mycophenolate mofetil)、NEORAL(環孢黴素A；市場上以商標為SANDIMMUNE的不同製劑銷售)、PROGRAF(血流譜，也稱FK-506)，RAPIMMUNE(sirolimus，也稱雷帕黴素)、leflunomide(也稱HWA-486)、ZENAPAX、腎上腺皮質激素，如氫化潑尼松及其衍生物；抗體如正交克隆(OKT3)，和antithymyocyte球蛋白如胸腺球蛋白。當與另一種用於如上所述免疫抑制治療的免疫抑制藥物同時給藥時，該化合物還可有效地用作增強劑。因此，可以以遠遠低於單獨給藥該化合物時的量對上述常規的免疫抑制藥物進行給藥(例如標準劑量的20％-50％)。可供選擇的給藥量是使本發明化合物和免疫抑制藥物以該量給藥所得到的免疫抑制效果比以相同劑量單獨使用該藥物或本發明化合物所得免疫抑制效果要好。典型地，免疫抑制藥物和增效劑以常規的時間間隔給藥至少2周。
本發明的組合物也可以與常規的一種或多種抗炎藥一起給藥，其中，該藥物或藥物的給藥量本身對於誘導適當的抑制或抑制發炎無效。
通過使用本領域已知的、已經建立的動物模型，可以評價化合物的體內免疫抑制活性。該分析可用於評價免疫抑制化合物的相對功效，並且可以用於估計進行免疫抑制治療的適當劑量。這些分析包含例如由Ono和Lindsey(1969)所述的完全特徵化的同種異體移植物大鼠模型系統，其中，移植的心臟與同種移植物接受動物的腹部大血脈相連，通過心臟在受體動物中搏動的能力測定移植心臟的生存能力。由Wang(1991)和Murase(1993)描述的異種移植物模型，其中受體動物為不同的種系。評估抗GVHD功效的模型包含給正常Fi小鼠注射父母的脾細胞；小鼠產生GVHD症候群，其特徵為脾大和免疫抑制(Korngold，1978；Gleichmann，1984)。由個體的脾製備單細胞懸浮液，並在伴刀豆球蛋白A存在和不存在下建立微孔(microwell)培養物以評定致有絲分裂響應的程度。
IV.抗癌治療如圖1所示，具有結構式I的化合物，14-脫氧-1-α-氟雷公藤內酯醇(指定為PG763)以劑量依賴性方式對Jurkat細胞具有細胞毒素(參見實施例2)，濃度相當於採用雷公藤內酯醇進行的類似分析。因此，本發明包含將本發明化合物作為細胞毒素劑的用途，尤其是用於治療癌症。如這裡使用的「癌症」指在哺乳動物特別是人中發現的所有類型的癌症或腫瘤或惡性瘤，包含白血病、肉瘤、癌和黑素瘤。
術語「白血病」泛指血液形成器官的累積性惡性疾病，通常情況下其特徵為血液和骨髓內的白細胞及其前體的不正常增生和發育。術語「肉瘤」一般指由象胚胎連接組織一樣的物質形成的瘤並且在通常情況下由包埋在纖維或均質體中的緊密填充細胞構成。術語「黑素瘤」指源於皮膚和其它器官的黑素細胞系統的瘤。術語「癌」指上皮細胞的惡性新生長，趨於滲透周圍組織並發生轉移。
例如，包含的癌症涉及源於生殖組織的細胞(如塞爾託利氏(Sertoli)細胞、生殖細胞、發育中的或更成熟的精原細胞、精細胞或精母細胞和滋養細胞、卵巢的生殖細胞和其它細胞)、淋巴或免疫系統(如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、造血系統和上皮細胞(如皮膚，包含惡性黑素瘤和胃腸道)、實質器官、神經系統如神經膠質瘤(參見Y.X.Zhou et al.，2002)和肌骨骼組織。該化合物可用於治療各種癌細胞類型，包含但並非局限於，腦包括成神經管細胞瘤、頭和頸、胸、結腸、小細胞肺、大細胞肺、甲狀腺、睪丸、膀胱、前列腺、肝臟、腎、胰腺、食道、胃、卵巢、子宮頸或淋巴瘤。尤其希望能治療胸、結腸、肺和前列腺瘤。
可以通過如上所述的常規給藥途徑將該組合物給藥到受癌症和/或白血病折磨的患者。該方法可有效地減緩腫瘤生長、預防腫瘤生長、誘導腫瘤局部衰退以及引起腫瘤完全衰退直至完全消失。該方法也有效地用於預防源於實性腫瘤的轉移生長。
本發明組合物可作為單獨治療藥來給藥，或與其它在患者中無抗癌效果的輔助性或治療學的治療一起進行。該方法也包括將本發明組合物與一種或多種常規的抗癌藥物或生物蛋白劑一起，以在患者中具有預期抗癌效果的有效量給藥。其中，該藥物或試劑本身的量對誘導適當的癌症生長抑制無效。這些抗癌藥物包含放射菌素D、喜樹鹼、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、阿拉伯糖胞苷、道諾黴素、阿黴素、鬼臼乙叉苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、羥基尿素、吉西他濱、藥薯、氨甲蝶呤、絲裂黴素C、米拖蒽醌、帕尼特西、泰索帝、替尼泊苷、託泊替康、長春鹼、長春新鹼、去乙醯長春醯胺和長春瑞賓。抗癌生物蛋白劑包含腫瘤壞死因子(TNF)、TNF相關細胞凋亡誘發配體(TRAIL)、其它TNF相關或TRAIL相關配體和因子、幹擾素、白細胞間介素-2、其它白細胞間介素、其它細胞活素、化學活素和因子、腫瘤相關分子或受體的抗體(如抗-BER2抗體)以及與這些試劑反應或鍵合的試劑(如受體的TNF上族成員、其它受體、受體拮抗劑和專用於這些試劑的抗體)。
通過採用建立的動物模型，如Fidler et al在美國專利6,620,843中所描述的，可以評價特定組合物的體內抗腫瘤活性。按照臨床醫生已知的方法，根據疾病的嚴重性和患者的所有症狀等因素來確定臨床劑量和治療計劃。
V.其它說明本發明化合物也可以用於治療某些CNS疾病。穀氨酸鹽可實現許多生理學功能，包擴在各種神經學和精神病的病理生理學方面起著重要的作用。在組織缺氧、局部缺血和損傷以及慢性神經變性或神經代謝疾病、阿爾茨海默痴呆、亨延頓疾病和帕金森疾病中已經暗示了穀氨酸鹽的興奮毒性和神經毒性。考慮到已報導的雷公藤內酯醇具有神經保護作用，特別是可預防由穀氨酸鹽誘導的細胞死亡(Q.He et al.，2003；X.Wang et al.，2003)，因此本發明化合物有望可對抗穀氨酸鹽的神經毒作用並因而可能是一種用於這種疾病的新治療手段。
來自復原期MS病人的最新證據暗示出腦中穀氨酸鹽的動態平衡發生了改變。在MS病人中出現的神經中毒發作可能是造成少突細胞和神經元細胞死亡的原因。在MS病人中，通過使用本發明化合物治療抗穀氨酸鹽受體-介導的興奮毒性可能具有治療學含義。其它CNS疾病如吉-巴症候群、梅尼埃病、多神經炎、多發性神經炎、單神經炎和神經根病也可以用本發明化合物治療。
本發明化合物也可以用於治療某些肺病。突發性肺纖維化(PF)為一種積累產生裂縫的肺病，其病原未知。PF的特徵為細胞內基質和膠原質在肺間質組織中過度錯位，並逐漸由疤痕組織取代氣泡，其結果是發炎和纖維症。隨著疾病的發展，疤痕組織的增加幹擾了氧從肺轉移到血流的能力。已報導雷公藤內酯醇的14-琥珀醯亞胺酯可阻斷博來黴素誘導的PF(G Krishna et al.，2001)。因此，本發明化合物可有效地用於治療PF。也認為該化合物可治療其它呼吸疾病，如肉狀瘤病、纖維化肺以及突發性間質性肺炎。
其它涉及肺並預期用本發明化合物治療的疾病包含嚴重的急性呼吸症候群(SARS)和急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。特別是關於SARS，如以下所指出的，在疾病發展到高峰前減少病毒含量(SARS-CoV)以及採用皮質類固醇治療的有效性暗示出SARS威脅生命的最嚴重影響的發展可能源於身體對感染的誇張響應(免疫活動過度)，而不是病毒本身的影響(參見共同未決的和共有的美國臨時申請60/483,335，其作為參考併入本文)。皮質類固醇治療已用於SARS病人以便抑制細胞活素的大量釋放，其表現了免疫活動過強階段的特徵，希望在下一階段停止肺病的進展。皮質類固醇治療已產生了良好的臨床結果，減少了一些主要的SARS症狀。然而，存在幾種與治療相關的副作用，並且非常需要更具有選擇性的免疫抑制和/或抗炎劑。
實施例下述實施例用於解釋本發明，而並非是對本發明的限制。
實施例1.製備14-脫氧-14α-氟雷公藤內酯醇 在N2下，0℃時，向PG490(雷公藤內酯醇，17.3mg，0.048mmol)的二氯甲烷溶液(1.0ml)中加入(二乙基氨基)三氟化硫(DAST，100μl，0.763mmol)。該反應混合物於0℃攪拌2小時後加入飽和NaHCO3溶液(0.8ml)。用3×2ml二氯甲烷萃取該反應混合物。合併的有機層用無水NaSO4乾燥並進行真空濃縮。定量獲得所需的產物(PG763)。
分析TLCRf＝0.78(乙酸乙酯/己烷/甲醇1∶1∶0.1)。IR(KBr)3031.0，2961.2，2942.4，2873.8，1764.6，1680.9，1449.3，1438.3，1172.2，1098.1，1074.5，1057.0，1047.1，1034.2，1018.2，1005.6，987.3，972.3，923.9，909.0，743.6，586.0，566.0，539.8，527.6cm-1。IHNMR(300MHz，CDCl3)δ＝5.16(d，1H，14-CH)，4.70(q，2H，19-CH2)，3.80(d，1H，11-CH)，3.73(d，1H，7-CH)，3.50(t，1H，12-CH)，2.70(m，1H，5-CH)，2.34(d，1H，2-CHb)，2.27-2.02(m，3H，6-CHb，2-CHa和15-CH)，1.95(m，1H，6-CHa)，1.56(dd，1H，1-CHb)，1.24(m，1H，1-CHa)，1.11(s，3H，20-CH3)，1.10(d，3H，17-CH3)，0.91(d，3H，16-CH3)ppm。
實施例2細胞毒性(MTT)分析將測試化合物溶解在DMSO中，濃度為20mM。在RPMI1640介質(GIBCO，Rockville，MD)中用10％胎牛血清(HyClone Laboratories，Logan，UT)進一步稀釋。
在標準的MTT分析中，採用細胞擴增試劑盒I(#1 465 007，RocheDianostics，Mannheim，Germany)測定化合物的細胞毒性。簡言之，在每個稀釋點，在存在測試化合物的一系列3倍稀釋液或含有與測試樣品中相同濃度DMSO的介質的情況下，將人T細胞淋巴瘤(Jurkat)細胞(4×105/孔)在96孔的組織培養板上培養24小時。接著，培養物用10μl/孔的MTT試劑補充4小時並隨後用0.1ml/孔的溶解劑補充另外的16小時。在ThermoScan微板讀數儀(分子設備，Menlo Park，CA)上測定570nm處的光密度(OD570)。數據相對於化合物的濃度表示為OD570值。圖1給出了PG763(14-脫氧-1-α-氟雷公藤內酯醇)相對於PG490(雷公藤內酯醇)和介質控制組的結果。
實施例3膜聯蛋白V細胞凋亡分析將測試樣品在完全組織培養基(RPMI 1640介質，加入5％熱變性的胎牛血清、1％HEPES、1％pen/strep、1％穀氨酸鹽)中稀釋至1mM。將溶液放在微培養板上並製備一系列稀釋液從而使最終濃度包含以半對數增加的2-6000nM的範圍。從指數增加的Jurkat人T淋巴瘤細胞線(#TIB-152，購自American Type Culture Collection，Manassas，VA)的培養物中收集細胞，離心清洗一次，再次懸浮在完全的組織培養基內，並且進一步稀釋到濃度為1×106細胞/ml。將100μ(1×105)l細胞加入到含有100μl稀釋化合物的孔中，並且將板在5％CO2保溫箱中於37℃下培養。
24小時後，板被離心以使細胞球形化，在PBS中用2％熱變性的胎牛血清清洗細胞2次。根據膜聯蛋白V分析方法(Bio Vision，Inc.，Mountain View，CA)向每個孔加入500ul結合緩衝液。接著，向每個孔加入5μl膜聯蛋白V的螢光素異硫氰酸酯(FITC)共扼物(BioVision，Inc.)，然後在黑暗中培養5分鐘。在一些分析中，在該階段加入propidium碘化物(BioVision，Inc.)以檢查壞死的細胞。將孔內的物質單獨轉移到試管中並採用FACSCalibur流動血細胞計數器(BD免疫血細胞計數系統，San Jose，CA)分析細胞凋亡。對膜聯蛋白V結合呈陽性的細胞被視為凋亡的，並以凋亡細胞百分比來計算數據。
將數據以化合物濃度相對於凋亡細胞百分比作圖。圖3A-B給出了兩種14-取代雷公藤內酯醇、14-α-羥基雷公藤內酯醇(也稱作epitriptolide；指定為PG524)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤內酯醇(指定PG691)相對於PG490(雷公藤內酯醇)的比較數據。
實施例4IL-2產物分析將測試樣品在完全的組織培養基中稀釋至1mM。將該溶液放在已用抗CD3抗體塗敷的微型培養板上(用Jurkat細胞刺激IL-2產物)並製備一系列稀釋液從而使最終濃度可包含以對數增加的0.001-10,000nM的範圍。從指數增加的Jurkat人T細胞線(#TIB-152購自AmericanType Culture Collection，Manassas，VA)的培養物中收集細胞，離心清洗一次，再次懸浮在完全的組織培養基中並稀釋到濃度為2×106細胞/ml。將50μl Jurkat細胞(1×105細胞)加入到含有100μl稀釋化合物的孔中，向每個孔加入50μl PMA(10ng/ml)並將板在5％CO2保溫箱中於37℃培養。24小時後，板被離心以使細胞球形化，從每個孔取出150μl上清液並將樣品儲存在-20℃。採用Luminex 100(Luminex Corporation，Austin，TX)、抗IL-2捕獲抗體結合的Luminex微球以及螢光染料結合的抗IL-2檢測抗體分析儲存的上清液的IL-2濃度。數據以IL-2的pg/ml表示。
將數據以化合物濃度相對於IL-2濃度作圖。圖2給出了PG763(14-脫氧-1-α-氟雷公藤內酯醇)相對於PG490(雷公藤內酯醇)和溶劑控制組的結果。圖4A-B給出了其它的14-取代雷公藤內酯醇、1-α-羥基雷公藤內酯醇(也稱作epitriptolide；指定為PG524)和14-β-(甲硫基)甲基雷公藤內酯醇(指定為PG691)相對於PG490(雷公藤內酯醇)的比較數據。
權利要求
1.具有結構式I的化合物 其中CR1R2選自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13選自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12選自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；和CR3R4R5選自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一個包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有兩個包含氟或氧；並且，當CR1R2是CHOH時，CR3R4R5不是CH2F。
2.根據權利要求1的化合物，其中，CR7R8和CR9R10均獨立選自CH2、CHOH(β)、C＝O、CHF(α)或CF2。
3.根據權利要求2的化合物，其中，在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有一個包含氟或氧。
4.根據權利要求3的化合物，其中，在CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中剛好有一個包含氟。
5.根據權利要求4的化合物，其中，在CR1R2、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中剛好有一個包含氟。
6.根據權利要求5的化合物，其中，CR1R2包含氟。
7.根據權利要求6的化合物，其中，CR1R2是CF2。
8.根據權利要求6的化合物，其中，CR1R2是CHF(α)。
9.根據權利要求8的化合物，其中，R3-R13都是氫。
10.影響免疫抑制的方法，包括將有效量的、包含在藥學可接受的載體中的、具有結構式I的化合物給藥到需要這種處理的受試者 其中CR1R2選自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13選自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12選自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；和CR3R4R5選自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一個包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有兩個包含氟或氧；並且，當CR1R2是CHOH時，CR3R4R5不是CH2F。
11.根據權利要求10的方法，其中，CR7R8和CR9R10均獨立選自CH2、CHOH(β)、C＝O、CHF(α)或CF2。
12.根據權利要求10的方法，其中，在CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中剛好有一個包含氟。
13.根據權利要求12的方法，其中，CR1R2包含氟。
14.根據權利要求13的方法，其中，CR1R2是CF2。
15.根據權利要求13的方法，其中，CR1R2是CHF(α)。
16.根據權利要求15的方法，其中，R3-R13都是氫。
17.誘導細胞內細胞凋亡的方法，包括將所述細胞與有效量的、具有結構式1的化合物接觸 其中CR1R2選自CHOH、C＝O、CHF、CF2或C(CF3)OH；CR6和CR13選自CH、COH或CF；CR7R8、CR9R10和CR11R12選自CH2、CHOH、C＝O、CHF或CF2；和CR3R4R5選自CH3、CH2OH、C＝O、COOH、CH2F、CHF2或CF3；其中，在R1-R13中至少有一個包含氟；在CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10、CR11R12和CR13中至多有兩個包含氟或氧；並且，當CR1R2是CHOH時，CR3R4R5不是CH2F。
18.根據權利要求17的方法，其中，CR7R8和CR9R10均單獨選自CH2、CHOH(β)、C＝O、CHF(α)或CF2。
19.根據權利要求18的方法，其中，在CR1R2、CR3R4R5、CR6、CR7R8、CR9R10和CR11R12中剛好有一個包含氟。
20.根據權利要求19的方法，其中，CR1R2包含氟。
21.根據權利要求20的方法，其中，CR1R2是CF2。
22.根據權利要求20的方法，其中，CR1R2是CHF(α)。
23.根據權利要求22的方法，其中，R3-R13都是氫。
全文摘要
本發明涉及具有結構式(I)的化合物，該化合物可用於免疫抑制和誘導細胞死亡(細胞凋亡)。在結構式I中，CR
文檔編號C07D407/00GK1753666SQ200480005153
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月25日 優先權日2003年2月25日
發明者D·戴, J·H·馬瑟 申請人:美國泛華醫藥公司