一種檢測日本血吸蟲病循環抗原的試劑盒及方法

2023-12-05 16:15:36 1

專利名稱：一種檢測日本血吸蟲病循環抗原的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種血吸蟲病的快速診斷方法，特別是一種 檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒及方法。
背景技術：
1、免疫診斷在日本血吸蟲病防治中的重要性
血吸蟲病是一種嚴重危害人體健康的人獸共患寄生蟲病，全球感染人數約2億， 有6億人受感染威脅。我國是日本血吸蟲病流行區，經過50多年的防治已經取得了舉世矚 目的成就，到2003年全國血吸蟲病病人數較建國初期減少了 92.74%。已有廣東、上海、福 建、廣西、浙江等5省(區、市)阻斷了血吸蟲病的傳播；僅剩湖南、湖北、江西、安徽、江蘇等 5省湖區及川、滇山區未得到控制。隨著防治工作的深入，人群感染度明顯下降，低度流行區 相對擴大，傳統的病原學診斷在現場大範圍的應用日益困難，不但敏感性差、費時費力，且 不易被患者和檢測人員接受。另一方面，目前控制血吸蟲病的主要手段是吡喹酮化療，但大 規模長期採用單一藥物化療，有可能引發藥物抗性，且國外已有具吡喹酮抗性的曼氏血吸 蟲株報導出現，因此研製敏感性和特異性更高的血吸蟲病診斷方法具有重要的現實意義。
2、循環抗原在日本血吸蟲病免疫診斷中的應用
血吸蟲循環抗體檢測具有較高的敏感性、特異性，是一種成本低、操作簡單的檢 測，在現場流行病學調查時應用較為廣範。但循環抗體在治療後相當長時間內仍保持較高 水平，因而不易區分既往感染和現症感染，不能明確目標化療人群；也難以反映藥物療效， 不能作為療效考核評價指標。相比而言，檢測患者血清或尿液中的循環抗原，可評估蟲負 荷數和活動性感染，提供診斷依據。而且循環抗原在治療後轉陰較快，也可用來進行療效考 核。基於循環抗原檢測的各種方法曾出不窮，但都困擾在敏感性低、特異性不強的問題上， 因此尋找敏感性高、特異性強的循環抗原檢測方法和技術是血吸蟲病免疫診斷的新方向。
3、單克隆抗體技術在日本血吸蟲病免疫診斷技術中的應用
自Kohler和Milstein(197 發明單克隆抗體製備技術以來，單抗技術廣泛運用 於醫學和生物學的各個領域，為疾病的發生、發展、診斷和治療提供了重要的手段。單克隆 抗體是由一個細胞產生的，其成分(類，亞類，型和結合P位等)是同源的，只針對複雜抗 原的一個抗原決定簇，並有相同的親和性，抗體滴度也很高，檢測循環抗原具有高度的特異 性，抗原和單抗可規模化生產，方法簡便實用，且具有較好的療效考核價值，可區分現症感 染與既往感染，可用於血吸蟲病的免疫診斷和流行病學現場調查。
4.電化學發光免疫分析技術的發展與應用
電化學發光免疫分析是繼放射免疫分析、螢光免疫分析、酶免疫分析和化學發光 免疫分析後的新一代免疫標記技術，它集電化學發光、生物素-親和素、磁微粒技術和免疫 分析於一體，是利用電化學發光反應的試劑標記抗原或抗體，再與待測物經過一系列的免 疫反應和洗滌等理化步驟，最後用光學儀器測量免疫反應後電化學發光信號強度從而對抗 原或抗體物質進行定量分析的一種方法。該方法主要包含了兩個部分，即免疫反應系統和電化學發光系統。免疫反應系統主要是抗原抗體結合形成免疫複合物，而電化學發光系統 是利用電化學發光物質經氧化劑氧化形成激發態中間體，這種中間體不穩定，在其返回基 態時，會發射出光子，其產率可以用發光信號檢測儀接收測量進行定量分析。電化學發光免 疫分析具有靈敏度高、特異性強、線性範圍寬、適用面廣等優點，可用於日本血吸蟲病的免 疫診斷和循環抗原的定量檢測。發明內容
本發明的目的是提供一種檢測日本血吸蟲病循環抗原的試劑盒及方法，所述的這 種檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒及方法要解決現有技術中檢測血吸蟲病循環抗原的 方法敏感性低，特異性不強的技術問題。
本發明提供了一種檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，包括親和素磁珠、生物素 標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體、電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶 性蟲卵抗原特異性單克隆抗體、洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、陰性血清和共反 應劑。
進一步的，所述的電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克 隆抗體為三聯吡啶釕標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體。
進一步的，所述的洗滌液為0. 2mol/L、PH值8. 9-9. 1的含有0. 05%疊氮化鈉的碳 酸鹽緩衝液。
進一步的，所述的樣品稀釋液為0.2!1101/1、？!1值8.9-9. 1的含有0. 05%疊氮化鈉的碳酸鹽緩衝液。
進一步的，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清，所述的陰性血清為健康 人血清。
進一步的，所述的共反應劑為三丙胺原液。
進一步的，所述的親和素磁珠為包被鏈黴親和素的磁珠。
本發明還提供了一種三聯吡啶釕標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單 克隆抗體。
本發明還提供了一種檢測日本血吸蟲循環抗原的方法，包括一個製備抗日本血吸 蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體的步驟，一個製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單 克隆抗體的步驟，還包括一個採用生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體 的步驟，還包括一個採用電化學發光劑標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗 體的步驟，然後將親和素磁珠與生物素標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體結 合物加入反應管內，保溫反應並洗滌後，加入血清待測樣品，保溫反應並洗滌後，加入電化 學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體，保溫反應並洗滌後，形成親和 素磁珠-生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體-循環抗原-電化學發光劑 標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體夾心複合物，再加入共反應劑，通過電化學 發光檢測儀檢測化學發光信號，確定樣品陰陽性結果，只有基線發光信號的為陰性樣品，同 時具有基線發光信號和有規律的增強發光信號的為陽性樣本。
進一步的，所述的共反應劑為三丙胺原液。
進一步的，所述的親和素磁珠為包被鏈黴親和素的磁珠。
進一步的，在一個製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體的步驟中，所 述的製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體又包括如下步驟，
1)製備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的步驟；
2)抗原免疫與收集免疫血清的步驟；
3)抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體的提取與純化的步驟。
進一步的，在一個製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體的步驟 中，所述的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體的步驟中又包括如下步驟，
1) 一個動物免疫的步驟，在所述的動物免疫的步驟中，先製備日本血吸蟲的可溶 性蟲卵抗原，然後通過日本血吸蟲的可溶性蟲卵抗原免疫動物；
2) 一個細胞融合的步驟；
3) 一個雜交瘤細胞篩選和克隆化的步驟；
4)將單克隆細胞株注入動物體內產生抗體的步驟；
5) 一個純化抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體的步驟。
本發明的一種抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體，由所述的小鼠雜 交瘤細胞單克隆細胞株CGMCC NO :3642產生。小鼠雜交瘤細胞單克隆細胞株CGMCC NO: 3642，其分類命名為小鼠雜交瘤細胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細胞株A1E3)，該細胞株 保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區北辰西路1號院(中科院微生物研究 所)，保藏日期為2010年3月3號，保藏號為3642，該細胞株是由小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與 免疫脾細胞融合得到的雜交瘤細胞株。
本發明的工作原理是本發明通過生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多 克隆抗體，然後和包被鏈黴親和素的固相載體相結合，再與待檢血清中的循環抗原和採用 電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體相結合，經過免疫反應後 形成鏈黴親和素固相載體-生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體-循環 抗原-電化學發光劑標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體夾心複合物，然後採用 電化學發光檢測儀檢測，通過電化學發光信號強度來鑑定待檢血清中的日本血吸蟲循環抗 原。
本發明和現有技術相比，其效果是積極和明顯的。本發明的檢測日本血吸蟲循環 抗原的雙抗體夾心法敏感性高、特異性強、重複性好，適合批量標本的檢測和療效考核；本 發明的一種檢測日本血吸蟲循環抗原的電化學發光免疫試劑盒操作簡便、快速，適合醫院 檢驗科、疾病防控中心、社康中心等部門用於日本血吸蟲病的臨床診斷、療效考核和流行病 學調查，具有很高的實用價值。


圖1是本發明的一種檢測日本血吸蟲循環抗原的方法的原理圖，其中，1代表包 被鏈黴親和素的固相載體；2代表生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體； 3代表血清(循環抗原)；4代表電化學發光劑標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克 隆抗體；5代表鏈黴親和素固相載體-生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗 體-循環抗原-電化學發光劑標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體夾心複合物。
圖2是採用電化學發光檢測儀檢測陰性血清後的電化學圖。
圖3是採用電化學發光檢測儀檢測陰性血清後的化學發光圖。
圖4是採用電化學發光檢測儀檢測陽性血清後的的電化學圖。
圖5是採用電化學發光檢測儀檢測陽性血清後的化學發光圖。
具體實施方式
本發明還將結合實施例作進一步詳述
實施例1生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體IgG的製備方法如 下
1.日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的製備將感染日本血吸蟲尾蚴1500條/只 的7隻紐西蘭兔在42天後按常規方法解剖，從肝臟中分離收集蟲卵並凍幹。取幹卵稱重， 按1 %的比例溶於0. 9%的生理鹽水中，置4°C冷浸4天，期間每天振搖2次，每次2分鐘。4 天后冰浴超聲粉碎，每次3分鐘，間歇3分鐘，共3次。再如上冷浸2天，10000rpm4°C離心 30分鐘，取上清，收集分裝，用Braford法測定抗原蛋白濃度，_20°C保存備用。
2.抗原免疫及血清收集將SEA抗原150 μ g與等體積的弗氏完全佐劑用勻漿器 混勻半小時，充分乳化後分別經背部皮下多點注射家兔，每隻1ml。4周後，再取150yg的 SEA抗原與等體積弗氏不完全佐劑用勻漿器混勻半小時，充分乳化後加強免疫一次，劑量同 上。以後每隔2周直接用抗原150 μ g加強免疫一次，每隻0.5ml。共免疫三次後取全血離 心收集血清，-20°C保存。
3.特異性抗日本血吸蟲SEA多克隆抗體IgG的純化取20ml兔血清，加入20ml 的PBS緩衝液，冰浴磁力攪拌中緩慢滴加40ml的飽和硫酸銨溶液，使達到50%飽和，充分 混合，待有白色沉澱產生後加蓋，4°C靜置1小時。分裝後3000r/min離心20min，棄上清。 加入PBS溶解後合併定容至20ml，冰浴磁力攪拌中緩慢滴加IOml飽和硫酸銨溶液，使達到 33%飽和，混勻後4°C靜置1小時。再次分裝，3000r/min離心20min，棄上清後PBS溶解並 重複滴加飽和硫酸銨達33%飽和度，4°C靜置1小時後3000r/min離心20min，儘量去上清， 將收集的蛋白沉澱溶於IOmlPBS中，用生理鹽水4°C透析後離心收集上清，分裝後_20°C保 存。
4.特異性抗日本血吸蟲SEA多克隆抗體IgG的標記用0. 5mol/l的硼酸緩衝液 將純化後的多抗濃度稀釋為lmg/ml並對多抗進行充分透析，取濃度為lmg/ml溶解於DMSO 的生物素酯溶液120 μ 1加入Iml抗體中，混勻後在室溫下攪拌孵育4h。再加入9. 6 μ 1氯 化銨溶液，室溫下攪拌10分鐘。用磷酸緩衝液4°C充分透析，-20°C保存。
實施例2電化學發光劑標記抗日本血吸蟲SEA特異性單克隆抗體的製備方法如 下
1.抗原免疫按實施例一方法製備SEA抗原。取蛋白濃度為％ig/ml的SEA抗 原75 μ 1與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化後經腹腔注射BALB/C小鼠5隻，每隻 0. 5ml。4周後，用相同劑量的SEA抗原與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化後加強免疫一次， 注射劑量同上。2周後直接用等量抗原加強免疫一次，注射劑量同首次。2周後測血清抗體 水平，選擇抗體效價高的小鼠2隻，按每鼠50μ g/0. 2ml尾靜脈注射抗原。4天後進行細胞 融合試驗。
2.細胞融合取正常BALB/C小鼠1隻，經酒精消毒後打開腹部表皮暴露腹膜，吸 取5毫升RPMI-1640完全培養基注入小鼠腹腔，搖晃後吸出並稀釋加入96孔培養板，每 孔1滴。另取免疫小鼠1隻，消毒後打開腹腔，取下脾臟放至裝有少量無血清培養基的培 養皿內研磨，吸取上層液體至離心管內。加入約1/10細胞量的SP2/0骨髓瘤細胞，IOOOr/ min離心10分鐘，棄上清，輕輕彈打離心管底使細胞充分混勻，將離心管底浸入37°C水浴 內，邊搖邊在1分鐘內加入聚乙二醇(PEG)。靜置2分鐘，再在2分鐘內加入無血清培養基 12-15毫升，1000r/min離心10分鐘，棄上清，輕輕晃動離心管底，加入25毫升含有次黃嘌 呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin, A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine, T)的 HAT 培養基，輕輕吹散管底細胞，加入96孔培養板，每孔1滴。37°C培養。
3.雜交瘤細胞篩選和克隆化每日觀察細胞生長情況，第4-5天小堆雜交瘤細胞 生長，第一次換培養液，第8天雜交瘤細胞長至孔底十分之一左右，第二次換培養液。第11 天選取雜交瘤細胞長至孔底三分之一的孔，ELISA法測上清液的抗體OD值。在OD值較高的 陽性孔上做好標記準備第一次細胞克隆。選取標記好的雜交瘤細胞打勻後取少許加入含少 量HT培養基的1號尖底離心管內，混勻後取兩滴細胞液計數，取平均值。取2號尖底離心 管加入與細胞計數平均值等量滴數的HT培養基，將1號管內的細胞懸液打勻，吸取少量加1 滴至2號管內，混勻後加入96孔培養板，每孔1滴。4-5天後換培養液，8-9天後測上清液 的抗體OD值並按上述方法進行第二次克隆。再按照同樣的方法於第18天左右進行第三次 克隆。直到獲得分泌穩定的針對SEA的單克隆抗體細胞株。一種抗日本血吸蟲可溶性蟲卵 抗原(SEA)的單克隆細胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細 胞株A1E3)，該細胞株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中， 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區北辰西路1號院 (中科院微生物研究所)，保藏日期為2010年3月3號，保藏號為3642。
4.腹水收集將此小鼠雜交瘤細胞(CGMCC 3642)轉入培養瓶中擴大培養，1~2周 後收集細胞懸液，lOOOr/min離心10分鐘，棄上清，再用生理鹽水將細胞數調至lX106/ml 腹腔注射小鼠，每隻0.5ml。接種後9-12天將小鼠消毒後抽取腹水。離心收集上清，_20°C 保存。
5.抗日本血吸蟲SEA特異性單克隆抗體的純化
①飽和硫酸銨溶液的配製500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室 溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調pH至7.8。
②鹽析吸取IOml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶 液5. Oml ；繼續緩慢攪拌30min ； 10000r/min離心15min ；棄去上清液，沉澱物用1/3飽 和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30min，同法離心；重複前一步1 2次；沉澱物溶於1. 5ml PBS (0. 01mol/L pH7. 2)或 Tris-HCl 緩衝液中。
③脫鹽常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過kphadex G_50層析柱， 以PBS或Tri s-HCl緩衝液作為平衡液和洗脫液，流速lml/min。第一個蛋白峰即為脫鹽的 抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHC03, lmmol/L EDTA溶液中煮lOmin，用蒸餾水清洗 透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋lOmin，冷至室溫即可使用(並可於0.2mol/L EDTA 溶液中，4°C保存備用)。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50 100倍體積的PBS或Tris-HCl 緩衝液透析) 12 M小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑(碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml)檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。
④蛋白質含量的測定(Pr)(mg/ml) = (1. 45X0D280-0· 74X0D260) X 稀釋倍數； 或(Pr) = 0D280X稀釋倍數/3
⑤分裝凍存備用。
6.抗日本血吸蟲SEA特異性單克隆抗體的標記將純化後的單抗IOOyg用0.2mol/l的碳酸緩衝液稀釋至1毫升，用1/20濃度的碳酸緩衝液透析過夜後加入容量瓶。 稱取Img的三聯吡啶釕用二甲基甲醯胺(DMF)溶解後加入容量瓶。避光室溫振蕩孵育3小 時。10000r/min 超濾 5min 後 4°C保存。
實施例3 —種檢測日本血吸蟲循環抗原的方法包括如下步驟
(一 )選擇抗日本血吸蟲SEA的多克隆抗體IgG用於製備生物素標記結合物2，抗 日本血吸蟲SEA特異性單克隆抗體用於製備電化學發光劑標記結合物4 ；
(二)將購自於挪威Dynal公司的鏈黴親和素磁珠1與抗日本血吸蟲SEA多克隆 抗體IgG生物素標記結合物2加入反應管內，保溫反應並洗滌後，加入血清待測樣品3，保 溫反應並洗滌後，加入電化學發光劑標記抗日本血吸蟲SEA單克隆抗體4，保溫反應並洗滌 後，形成鏈黴親和素磁珠-生物素標記抗日本血吸蟲SEA多克隆抗體IgG-循環抗原-電化 學發光劑標記抗日本血吸蟲SEA單克隆抗體夾心複合物5，加入共反應劑三丙胺(TPA)，通 過電化學發光檢測儀檢測化學發光信號，確定樣本陰陽性結果。陰性樣本只有基線發光信 號，陽性樣本除基線發光信號外，還可檢測到規律的增強發光信號。(如圖1、圖2、圖3、圖 4和圖5所示)
實施例4 一種檢測日本血吸蟲循環抗原的電化學發光免疫試劑盒及其操作方法
技術領域：
本發明還提供了 一種檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，包括親和素磁珠1、生物 素標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體2、電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲 可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體4、洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、陰性血清和 共反應劑。
進一步的，還包括反應管，所述的反應管為容量為2ml的聚苯乙烯試管。
所述的磁珠1為購自於挪威Dynal公司的包被鏈黴親和素的商品化產品，濃度為10mg/mlο
所述的生物素標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體2的濃度為1.3mg/ml。
所述的電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體4 為濃度為0. 2mg/ml的三聯吡啶釕標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體。
所述的洗滌液為0. 2mol/L PH值8. 9-9. 1的含有0. 05%疊氮化鈉的碳酸鹽緩衝液。
所述的樣品稀釋液為上述洗滌緩衝液。
所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清，所述的陰性血清為健康人血清。
所述的共反應劑為三丙胺原液。
具體操作方法如下將親和素磁珠1(50 μ 1)與生物素標記多抗2 (20 μ 1)加入反 應管內，37°C振蕩孵育lh，洗滌液清洗兩次，每次清洗過程包括混勻、靜置、磁板吸附和拍幹四個步驟，具體要求充分混勻後靜置2分鐘，磁板吸附5分鐘，棄上層液體後拍幹，分別加入 稀釋的陰、陽性血清、待檢血清3 (50 μ 1)，混勻後37°C振蕩孵育lh，洗滌液清洗三次，方法 同上，加入電化學發光劑標記單抗4(20μ 1)，混勻後37°C振蕩孵育lh，洗滌液清洗三次，方 法同上，加入150 μ 1洗滌液和75 μ 1共反應劑，混勻後用電化學發光檢測儀檢測發光信號。
2、結果判定
本實驗陰性對照僅檢測到基線發光信號，而陽性樣本在基線發光信號的基礎上， 還檢測到規律的增強發光信號(結果如圖2、圖3、圖4和圖5所示)。如果待檢血清的電化 學圖和化學發光圖如圖2和圖3所示，則表明未感染日本血吸蟲。如果待檢血清的電化學 圖和化學發光圖如圖4和圖5所示，則表明感染了日本血吸蟲，需要及時的治療。
權利要求
1.一種檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒包括親和素磁 珠、生物素標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體、電化學發光劑標記的抗日本 血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體、洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、陰性 血清和共反應劑。
2.如權利要求1所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的電化 學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體為三聯吡啶釕標記的抗 日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體。
3.如權利要求1所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的親和 素磁珠為包被鏈黴親和素的磁珠。
4.如權利要求1所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的洗滌 液為0. 2mol/L、PH值8. 9-9. 1的含有0. 05%疊氮化鈉的碳酸鹽緩衝液。
5.如權利要求1所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的樣品 稀釋液為0. 2mol/L、PH值8. 9-9. 1的含有0. 05%疊氮化鈉的碳酸鹽緩衝液。
6.如權利要求1所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的血吸 蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清，所述的陰性血清為健康人血清。
7.如權利要求1所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，其特徵在於所述的共反 應劑為三丙胺原液。
8.一種三聯吡啶釕標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體。
9.一種檢測日本血吸蟲循環抗原的方法，包括一個製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗 原的多克隆抗體的步驟、一個製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體的步 驟，其特徵在於還包括一個採用生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體 的步驟，還包括一個採用電化學發光劑標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗 體的步驟，在上述步驟完成後，將親和素磁珠與生物素標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗 原多克隆抗體結合物加入反應管內，保溫反應並洗滌後，加入血清待測樣品，保溫反應並洗 滌後，加入電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體，保溫反應並洗 滌後，形成親和素磁珠-生物素標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體-循環抗 原-電化學發光劑標記抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原單克隆抗體夾心複合物，再加入共反 應劑，通過電化學發光檢測儀檢測化學發光信號，確定樣品陰陽性結果，只有基線發光信號 的為陰性樣品，同時具有基線發光信號和有規律的增強發光信號的為陽性樣本。
10.如權利要求9所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的方法，其特徵在於所述的共反應 劑為三丙胺原液。
11.如權利要求9所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的方法，其特徵在於所述的親和素 磁珠為包被鏈黴親和素的磁珠。
12.如權利要求9所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的方法，其特徵在於在製備抗日本 血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體的步驟中，又包括如下步驟，1)製備日本血吸蟲的可溶性蟲卵抗原的步驟；2)抗原免疫與收集免疫血清的步驟；3)抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的多克隆抗體的提取與純化的步驟。
13.如權利要求9所述的檢測日本血吸蟲循環抗原的方法，其特徵在於在製備抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體的步驟中，又包括如下步驟，1)一個動物免疫的步驟，在所述的動物免疫的步驟中，先製備日本血吸蟲的可溶性蟲 卵抗原，然後通過日本血吸蟲的可溶性蟲卵抗原免疫動物；2)一個細胞融合的步驟；3)一個雜交瘤細胞篩選和克隆化的步驟；4)將單克隆細胞株注入動物體內產生抗體的步驟；5)一個純化抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體的步驟。
全文摘要
本發明提供了一種檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒，包括鏈黴親和素磁珠、生物素標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體、電化學發光劑標記的抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原特異性單克隆抗體、洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、陰性血清和共反應劑。本發明還提供了一種檢測日本血吸蟲循環抗原的方法。本發明的一種檢測日本血吸蟲循環抗原的試劑盒操作簡便、快速，適合醫院檢驗科、疾病防控中心、社康中心等部門用於日本血吸蟲病的臨床診斷、療效考核和流行病學調查，具有很高的實用價值。本發明的檢測日本血吸蟲循環抗原的雙抗體夾心法敏感性高、特異性強、重複性好，適合批量標本的檢測和療效考核。
文檔編號G01N21/76GK102033131SQ20101055594
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月22日 優先權日2010年11月22日
發明者儲言紅, 周卉, 張永年, 李 浩, 田利光, 蔡玉春, 郭儉, 陳家旭, 陳木新, 陳海寧, 陳韶紅 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所