一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測系統和方法與流程
2023-12-05 05:00:31
本發明屬於中藥生產技術領域，具體涉及一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測系統和方法。
背景技術：
三七為五加科植物植物panaxnotoginseng(burk)f.h.chen的乾燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，是一種重要的常見中藥，在中國已有上百年的使用歷史。其中，三七的皂苷類成分被認為是其中藥藥效物質，以三七總皂苷為原料的中藥注射製劑，如血塞通和血栓通等，年銷售額已近百億，是中藥注射劑界的「重磅炸彈」。
三七總皂苷為三七的主要有效成分，具有活血、心肌保護、抗腦出血/缺血損傷、抗炎、鎮痛、抗衰老、抗氧化等藥理作用。三七總皂苷中含量最多的皂苷為三七皂苷r1、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1和人參皂苷rd。
三七總皂苷的主要生產工藝包括提取、濃縮、水沉過濾、柱層析、炭吸附等。其中，柱層析純化工藝包括大孔樹脂柱層析純化和大孔樹脂柱層析脫色。大孔樹脂柱層析純化的工藝參數較多，影響因素複雜且控制難度大，柱層析產品的批次間質量一致性成為柱層析工藝環節的主要問題。典型的原因包括上樣液質量波動、層析填料質量波動及性能下降、生產環境因素(如溫度)不穩定等。固定的柱層析控制策略無法有效應對上述問題：一方面，無法實時判斷上樣是否穿透及穿透的百分比；另一方面，無法準確判斷洗脫進程，無法靈活確定洗脫收集點和洗脫終點，如何確定柱層析流出液的收集策略成為了挑戰。
因此，有必要藉助合適的pat(過程分析技術)工具，實現三七總皂苷柱層析流出液有效成分的在線監測，快速、及時地獲取過程信息，有助於柱層析過程實時控制，保證產品質量一致性。
作為一種軟測量技術，近紅外光譜(nearinfraredspectroscopy，nirs)能反映樣本中有機分子含氫基團(如c-h、n-h、o-h等)的特徵信息。近紅外光譜技術可用於中藥質量分析，樣本無需或僅需簡單處理，不消耗化學試劑，操作簡單、快速，在中藥質量控制領域具有巨大的應用潛力。將近紅外光譜技術結合化學計量學技術，用於三七藥材中主要藥效物質的快速檢測，對三七藥材及三七總皂苷類製劑的質量控制具有重要意義。
目前，尚未有對柱層析過程樣本，即柱層析流出液有效成分的在線檢測系統及方法。柱層析流出液有效成分的在線檢測系統亟需設計，檢測方法亟需開發。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測系統，以及利用該系統實時檢測三七總皂苷柱層析過程層析流出液皂苷濃度的方法，用以判斷上樣是否穿透以及確定洗脫收集點和洗脫終點。
本發明通過以下技術方案實現：
一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測系統，包括：層析柱，與所述層析柱通過柱下管道相連的流通池，與所述流通池相連的取樣閥及取樣口，與所述流通池通過光纖連接的近紅外光譜儀，取樣記錄按鈕，與所述近紅外光譜儀和取樣記錄按鈕相連的計算機。
優選地，柱層析流出液先經過所述流通池再經過所述取樣閥及取樣口。
優選地，所述取樣記錄按鈕位於取樣閥及取樣口附近。
本發明還提供了一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測方法，包括：
(1)經層析柱洗脫的樣本通過柱下管道進入流通池，近紅外光譜儀通過光纖實時在線採集流通池中樣本的近紅外光譜，同時按下取樣記錄按鈕，取樣記錄按鈕記錄取樣時間及樣品信息，並將採集和記錄結果傳輸到所述計算機中；
(2)通過取樣閥及取樣口採集樣本，並採用參考分析方法測定樣本中皂苷濃度；
(3)對步驟(1)中採集的樣本近紅外光譜進行異常樣本剔除和樣本劃分，然後選擇合適的光譜波段和預處理方法，提取光譜特徵信息；使用多變量數據分析方法構建近紅外特徵光譜與樣本中皂苷濃度之間的定量校正模型，將模型輸入至所述計算機中；
(4)模型的應用：根據步驟(1)實時在線採集待測樣本的近紅外光譜，根據步驟(3)建立的定量校正模型，實時輸出待測樣本中皂苷濃度。
所述樣本為三七總皂苷柱層析過程的柱層析流出液。
優選地，步驟(1)前還包括對所述近紅外光譜在線檢測系統進行考察，基本的考察項目包括：光譜測量序列運行時間、檢測時滯計算、光譜採集參數優化、流通池光窗氣泡檢測、取樣對光譜穩定性的影響、光譜質量評價、流通池光窗清潔殘留檢測等。
所述流通池的光程為2mm，近紅外光譜採集以空氣為背景，光譜範圍為12000～4000cm-1，解析度為8cm-1，掃描次數為64次。
步驟(2)中，所述參考分析方法為高效液相色譜法(hplc)或/和超高效液相色譜法(uplc)。
所述皂苷包括三七皂苷r1、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1和人參皂苷rd及5種皂苷濃度的總和。
步驟(3)中，所述多變量數據分析方法為偏最小二乘(pls)回歸法。
步驟(3)中，根據交叉檢驗結果，剔除顯示異常的樣本。
如何挑選具有代表性的樣本建立模型是近紅外分析技術的關鍵問題之一，有代表性的校正集樣本不但可以減少建模的工作量，而且直接影響所建模型的適用性和準確性。步驟(3)中，常用的樣本劃分方法包括隨機法、kennardstone(ks)法、spxy法等。
光譜波段範圍直接影響到模型的模型性能和運算效率，通過波段篩選能夠避免引入冗餘信息。優選地，本發明選擇光譜波數範圍為9400～7500cm-1、7500～6100cm-1、6100～5450cm-1、5450～4600cm-1、4600～4250cm-1任一波段或其組合波段參與建模。
步驟(3)中，所述預處理方法包括無光譜預處理、消除常數偏移量、減去一條直線、矢量歸一化(snv)、最小-最大歸一化、多元散射校正(msc)、一階導數、二階導數及其組合。
優選地，步驟(3)中還包括對所建立的定量校正模型的預測性能進行評價的步驟；評價指標包括決定係數r2、交叉驗證均方根偏差rmsecv；進一步地，若r2接近於100％，rmsecv值越小，則所述定量校正模型適用於待測樣品的檢測；反之，則不適用。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：實現三七總皂苷柱層析流出液有效成分的在線監測，實時測定流出液中三七皂苷r1、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1、人參皂苷rd濃度及以上5種皂苷濃度總和，快速、及時反映當前物料信息，有助於柱層析過程監測及可視化，提高生產過程的質量控制水平。
附圖說明
圖1為本發明三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測系統示意圖；
圖2為三七總皂苷柱層析洗脫過程的在線近紅外光譜圖；
圖3為皂苷濃度根據交叉驗證得到近紅外預測值和參考值之間的相關圖；其中，a：三七皂苷r1，b：人參皂苷rg1，c：人參皂苷re，d：人參皂苷rb1，e：人參皂苷rd，f：5種皂苷總和(sum)；
圖4為實驗例1中六種皂苷模型預測值與實測值相關圖；其中，a：三七皂苷r1，b：人參皂苷rg1，c：人參皂苷re，d：人參皂苷rb1，e：人參皂苷rd，f：5種皂苷總和(sum)。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施例1
一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測系統，如圖1所示，包括：層析柱1，與所述層析柱1通過柱下管道2相連的流通池6，與所述流通池6相連的取樣閥及取樣口7，與所述流通池6通過光纖5連接的近紅外光譜儀4，取樣記錄按鈕8，與所述近紅外光譜儀4和取樣記錄按鈕8相連的計算機3。
柱層析流出液先經過所述流通池6再經過所述取樣閥及取樣口7。
所述取樣記錄按鈕8位於取樣閥及取樣口7附近。
所述流通池6的光程為2mm，光譜採集以空氣為背景，光譜範圍為12000～4000cm-1，解析度為8cm-1，掃描次數為64次。
在進行在線檢測前，需要安裝近紅外光譜在線檢測系統，同時考察安裝的近紅外光譜在線檢測系統能否正常應用於三七總皂苷柱層析工藝環節，以達到實時採集準確、真實的光譜數據及輸出結果達標的目的。基本的考察項目包括：光譜測量序列運行時間、檢測時滯計算、光譜採集參數優化、流通池光窗氣泡檢測、取樣對光譜穩定性的影響、光譜質量評價、流通池光窗清潔殘留檢測等。
一種三七總皂苷柱層析過程的近紅外光譜在線檢測方法，包括：
(1)經層析柱1洗脫的樣本通過柱下管道2進入流通池6，近紅外光譜儀4通過光纖5實時在線採集流通池6中樣本的近紅外光譜，同時按下取樣記錄按鈕8，取樣記錄按鈕8記錄取樣時間及樣品信息，並將採集和記錄結果傳輸到所述計算機3中；
本實施例中近紅外光譜儀4使用brukermatrix-f型近紅外光譜儀，光譜採集參數：光譜範圍12000～4000cm-1，解析度8cm-1，掃描次數64次，光譜採集間隔約50～60s。在線採集到的洗脫液原始近紅外光譜如圖2所示。洗脫過程關鍵工藝環節中，除開始點和結束點外，期間每0.5h取樣一次，取樣需按下取樣記錄按鈕8，記錄取樣時間及樣品信息。共獲取7個批次的光譜數據與過程樣本。
(2)通過取樣閥及取樣口7採集樣本，並採用超高效液相色譜法(uplc)測定全部樣本的三七皂苷r1、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1、人參皂苷rd濃度，以上述5種皂苷濃度及其濃度總和(sum)作為參考值。具體測定方法如下：
色譜條件：色譜柱acquitybehc18(1.7μm，2.1×50mm)，以流動相a：乙腈，流動相b：水，按以下梯度洗脫：0min(19％a)，3min(19％a)，3.5min(29％a)，5min(35％a)，8min(40％a)，9min(90％a)，11.9min(90％a)，12min(19％a)；流速為0.7ml/min；檢測波長203nm；柱溫30℃；進樣量1μl。
標準品溶液的製備：精密稱定已知含量的三七總皂苷粉末2951.30mg，置於250ml容量瓶中，以甲醇溶解並定容，得「標1」。準確移取「標1」20ml於100ml容量瓶中，以甲醇稀釋並定容，得「標2」。準確移取「標2」20ml於100ml容量瓶中，以甲醇稀釋並定容，得「標3」。
標準曲線的製備：將標準品溶液分別按上述色譜條件進樣分析，以各指標濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪製標準曲線。
供試品溶液的測定：樣品恢復至室溫，準確移取一定體積樣品至10ml容量瓶，以甲醇定容，搖勻，經微孔濾膜過濾，進樣分析。以標準曲線法計算各樣品上述指標的濃度。
(3)對步驟(1)中採集的樣本近紅外光譜進行異常樣本剔除和樣本劃分，然後選擇合適的光譜波段和預處理方法，提取光譜特徵信息；使用偏最小二乘(pls)回歸法構建近紅外特徵光譜與樣本中皂苷濃度之間的定量校正模型，將模型輸入至所述計算機3中；
模型參數自動優化後，以使rmsecv最小的模型參數交叉檢驗，剔除交叉檢驗的結果中opus軟體提示異常的樣本，重新進行參數優化，直至無異常樣本。此外，比較不剔除異常樣本的模型預測性能，選擇預測性能最佳的模型。
本實施例中以6批洗脫過程數據作為校正集，以第7個批次的過程樣本為驗證集。
pls算法及預處理方法、建模波段的優選均通過opus軟體(version7.5build，brukeroptikgmbh)實現。以6批洗脫過程數據作為校正集，將步驟(1)中採集的光譜數據和步驟(2)中測定的皂苷濃度數據導入opus軟體(層析過程光譜結合取樣時間選擇，每個樣品對應1張光譜)，設置數據類型為「校正」、「測試光譜」或「排除」，以交叉檢驗(凍結樣品的數目為1)所得rmsecv值作為模型參數選擇依據，各個指標依次進行優化。
為了除去近紅外光譜中的噪音和幹擾，採用9400～7500cm-1、7500～6100cm-1、6100～5450cm-1、5450～4600cm-1、4600～4250cm-1任一波段或其組合波段參與建模。分別比較了無光譜預處理、消除常數偏移量、減去一條直線、矢量歸一化(snv)、最小-最大歸一化、多元散射校正(msc)、一階導數、二階導數、一階導數+減去一條直線、一階導數+矢量歸一化和一階導數+多元散射校正這11種光譜預處理方法。
以5種皂苷濃度總和定量模型為例，分別以每種光譜預處理方法優化波段，所建模型性能參數見表1。可見，對於不同的光譜預處理方法，優選的波段不盡相同。經過不同光譜預處理方法和波段組合，模型的性能顯著提高，rmsecv值可降至0.733mg/ml。綜上，對於5種皂苷濃度總和的定量校正模型，選擇的光譜預處理方法為一階導數+矢量歸一化(snv)，選擇的波段為9403.5-7498.1cm-1和6101.9-5446.2cm-1。其餘5個指標的模型參數優化過程與此相同。
表1不同光譜預處理方法及相應優化波段所得5種皂苷濃度總和(sum)模型結果比較
經過異常樣本剔除、樣本劃分及預處理方法和建模波段的優化後，最終選用模型的各項參數及性能見表2，模型校正集r2均大於0.88，rmsecv值較小，表明模型性能良好。圖3為皂苷濃度根據交叉驗證得到近紅外預測值和參考值之間的相關圖，相關圖同樣表明所建回歸模型具有較好的擬合效果及預測能力。
表2模型參數及性能
將步驟(3)中建立的定量校正模型對第7批柱層析洗脫過程樣本進行預測，圖4為模型預測值與實測值的關係圖。結果表明，各指標預測值與實測值變化趨勢一致，能夠對三七總皂苷柱層析洗脫過程皂苷濃度快速分析，滿足工業生產過程分析的要求。
(4)模型的應用
三七總皂苷柱層析洗脫過程中，使用與校正集光譜相同的光譜採集參數在線連續採集柱層析洗脫液的近紅外光譜，將光譜輸入至步驟(3)所建定量校正模型，檢測系統實時輸出洗脫液中三七皂苷r1、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1、人參皂苷rd濃度及以上5種皂苷濃度總和，從而快速、及時反映當前物料信息。同時，檢測系統將上述指標隨層析時間的變化趨勢可視化，有助於監測柱層析洗脫過程，為過程控制提供基礎。