螢光納米粒子Ru(bpy)₃/SiO₂、其製備方法及應用的製作方法

2023-08-11 17:53:36

專利名稱：螢光納米粒子Ru(bpy)3/SiO2、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種螢光納米粒子Ru(bpy)3/Si02、其製備方法及應用。
背景技術：
愛滋病是由人類免疫缺陷病毒感染所引起的一種嚴重的傳染性疾病。在目前尚無 疫苗用於預防愛滋病的情況下，及時正確的診斷HIV感染是治療和減少愛滋病傳播的重要 手段。目前，普遍採用的愛滋病常規診斷方法是ELISA法，但ELISA法一般在96孔板上進 行，有著試劑消耗量大，檢測成本高，檢測時間長，檢測靈敏度不夠高且不能實現高通量化 的缺點，難以實現對大量群體的高通量、高靈敏、快速檢測，如對疫情較嚴重地區人群的HIV 普查、監測，獻血血源篩查等。蛋白質微陣列晶片技術是採用微陣列方法，對樣品蛋白進行高通量、高靈敏、高特 異性的分析技術。Li QS等報導採用蛋白質微陣列晶片實行對HIV-1的早期診斷.Wu，JQ 等報導採用蛋白質微陣列晶片檢測愛滋病的CD4+和CD8+T細胞的表面抗原。Burgess等 報導以Cy3作螢光標記物採用蛋白質微陣列同步檢測HIV、HBV、HCV三種病毒。但以納米 粒子作標記物應用於蛋白質微陣列晶片檢測HIV尚未見文獻報導。蛋白質微陣列晶片的檢 測探針主要包括化學發光、酶、螢光等幾種。其中以螢光物質作探針的優點是可重複檢測、 可使用多種螢光物質進行多標記對多種分析物同時檢測等。目前使用的螢光探針主要包括 普通有機螢光染料、稀土配合物及螢光納米粒子等。相對於前兩者，螢光納米粒子的優勢是 光穩定性好、螢光強度高、檢測靈敏度高、生物相容性好等。因而，近年來將納米粒子作為熒 光探針應用於蛋白質微陣列晶片等生物分析領域得到迅速發展和廣泛應用。目前，可用作 探針的納米粒子主要有貴金屬納米粒子、半導體量子點、及摻雜螢光分子的矽納米顆粒等。 Petra Pavlickova利用納米金製備了可檢測血清免疫球蛋白抗體的蛋白質晶片。Jesse V. Jokerst等人利用CdSe/ZnS量子點作為蛋白質晶片上的螢光標記物成功檢測了三種主 要的癌症指標蛋白CEA，CA125和Her-2/Neu。Zhang Heng等運用稀土配合物摻雜的二氧化 矽納米顆粒對HBsAg進行時間分辨螢光免疫分析。Santra等人以螢光染料Ru(bpy)3與二 氧化矽複合的螢光納米顆粒標記羊抗人IgG，用於識別人外周血SmlgG+B淋巴細胞，均獲得 高的檢測靈敏度。由於摻雜螢光分子的矽納米顆粒的一個納米顆粒中可包裹大量的螢光分 子，因而具有強的螢光強度與檢測靈敏度，並且該類型納米粒子還具有良好的水溶性、生物 相溶性、易於製備和表面易修飾等特點，因而成為目前研究的熱點。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種螢光納米粒子Ru (bpy) 3/Si02。本發明的目的之二在於提供該螢光粒子的製備方法。本發明的目的之三在於利用該螢光粒子在檢測HIV p24抗原的應用—種螢光納米粒子Ru (bpy) 3/Si02，其特徵在於該螢光納米粒子為核殼結構，核殼 結構以三聯吡啶釕為內核，在三聯吡啶釕的表面覆蓋網狀結構的二氧化矽，在二氧化桂表面帶有活性氨基基團，其中三聯吡啶釕與二氧化矽的質量比為1 180 1 190，且每毫 克納米粒子含有70 80nmc)l氨基。上述的螢光納米粒子為規則球形，平均粒徑為64 76nm。一種製備上述的螢光納米粒子Ru(bpy)3/Si02的方法，其特徵在於該方法的具體 步驟為將環己烷、正己醇和Triton X-100按20 1 10 25 1 14的體積比混合 均勻後，加入水至溶液澄清透明，在再入Ru(bpy)jjC溶液，控制Triton X-100與Ru(bpy)3 的摩爾比為6340 1 6360 1 ；攪拌均勻後按10 1 5 10 1 7的摩爾比依 次加入正矽酸乙酯、3-氨丙基三甲氧基矽烷和氨水，並且正矽酸乙酯和Triton X-100的摩 爾比比為1 9 1 10;避光下攪拌反應22 26小時；加入丙酮破乳，超聲分散，離心 分離，然後分別用無水乙醇和超純水洗滌以除去表面活性劑及未反應的原料雜質，真空幹 燥後，得到表面帶有氨基的Ru(bpy)3/Si02螢光納米粒子。一種上述的Ru(bpy)3/Si02螢光納米粒子作為螢光探針在檢測HIV p24抗原中的應用。所製備的核殼型染料摻雜的矽螢光納米粒子Ru(bpy)3/Si02大小均一，單分散性 好，平均粒徑為70士6nm ；且具有很好的光穩定性，用100W氙燈在最大發射波長照射90分 鍾後其螢光強度只衰減了 8% ；在水溶液中不易發生染料洩露，連續超聲1小時後洩露的染 料不到0. 05%。本發明首次將該螢光探針標記鏈酶親和素後應用於蛋白質微陣列晶片檢測 HIV p24抗原，採用的分析方法為夾心式螢光免疫分析法，結果顯示螢光強度與p24濃度呈 良好的正相關性，分析靈敏度為3. Ing/mL。結果表明，該納米粒子作為一種新型的螢光探針 可應用於高靈敏檢測的蛋白質微陣列晶片及螢光免疫分析等系統。


圖1為本發明的Ru(bpy)3/Si02納米螢光顆粒的TEM圖。圖2 為 lmg/mLRu (bpy) 3 和 0. 5mg/mL 納米螢光粒子 Ru (bpy) 3/Si02 的紫外-可見 吸收光譜。圖3 為 lmg/mLRu (bpy) 3 和 0. 5mg/mL 納米螢光粒子 Ru (bpy) 3/Si02 的 452nm 激發 的螢光光譜。圖4為本發明的Ru(bpy)3/Si02納米螢光粒子在水中的光漂白實驗。圖5為本發明的Ru(bpy)3/Si02納米螢光粒子在水中的染料洩露實驗。圖6為本發明的Ru(bpy)3/Si02納米螢光粒子標記SA後在452nm激發下的螢光光 譜，其中 Ru(bpy)3/Si02、Ru(bpy)3/Si02-BSA 及 Ru (bpy) 3/Si02-BSA_SA 的濃度分別為 0. 5、 0. 25、0. 25mg/mL)。圖7為本發明的Ru(bpy)3/Si02納米螢光粒子標記SA的原理示意8為晶片掃描圖(第1 6點陣，p24抗原濃度分別為330，33，3. 3,0. 33,0. 033， Oy g/mL。每個點陣的固相抗體濃度從上至下分別為，0. 1，1，10，50，100,200,500u g/mL)。圖9為微陣列蛋白質晶片的p24分析曲線(固相抗體、生物素-羊抗HIV p24多 克隆抗體及納米粒子-鏈酶親和素標記物濃度分別為100 u g/mL，0. 2mg/mL,0. 3mg/mL)。
具體實施例方式一、儀器與試劑Hitachi F-7000螢光分光光度計(日本日立公司)；Hitachi U-3010紫外-可見分光光度計(日本日立公司)；Hitachi CR22G/II高速離心機(日本日立 公司)JEOL 200CX透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。Genepix 4000B晶片掃描儀(美 國 Axon Instruments 公司)；QminiGrid 300 晶片點樣儀(美國 Genomics Solution 公司)。三聯吡啶釕(Rubpy) 3、3_氨丙基三甲氧基矽烷(APTMS)、正矽酸乙酯(TE0S)、 TritonX-100等均為分析純，購自SIGMA公司；正己醇、丙酮、氨水等均為分析純，購自上海 豪申化學試劑有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、鏈酶親和素(SA)等均購自北京欣京科生物 技術有限公司。HIV p24抗原，生物素-羊抗HIV p24多克隆抗體，購於美國Fitzgerald公 司，羊抗HIV p24單克隆抗體，購於北京博菲康生物技術有限公司。醛基玻片，購於上海百 傲科技有限公司。各種緩衝液為分析緩衝液(稀釋緩衝液)0. lmol/1 PBS，0. 1%BSA,
0.Tween-20，pH7. 4。洗滌液0. 05mol/l PBS，0. 05% Tween-20，pH7. 4。封閉液0. lmol/ L PBS，pH7. 4,2% BSA,0. 01%疊氮鈉。點樣buffer 60% 0. 01mol/l PBS+40%甘油，pH7. 4。二、實驗方法1. Ru (bpy) 3/Si02螢光納米粒子的製備將7. 5. mL環己烷，1. 7mL正己醇，
1.8mLTriton X-100依次加入到圓底燒瓶中，攪拌20分鐘使其混合均勻，再加入400 y L水， 繼續攪拌至溶液澄清透明，加入100 U L 5mg/mL Ru (bpy) 3水溶液，攪拌5分鐘後再依次加入 100uL TE0S和10 ii L APTMS, 10分鐘後加入60 y L氨水，避光攪拌下反應24小時。反應完 成後加入適量丙酮破乳，超聲分散，在12000轉/分鐘下離心分離，然後分別用無水乙醇和 超純水洗三次以除去表面活性劑及未反應的原料等雜質，真空乾燥後，得到表面帶有氨基 的Ru(bpy)3/Si02納米顆粒。圖1為合成的核殼螢光納米顆粒Ru(bpy)3/Si02的透射電子顯 微鏡圖，由圖1可以看出納米粒子呈規則球狀，大小比較均一，粒徑為70 士 6nm，納米微粒之 間沒有相互粘連，單分散性很好。參見圖2，Ru(bpy)3/Si02納米粒子與Ru(bpy)3的吸收光譜圖相似，它們的最大 吸收波長均為452nm，其中Ru (bpy) 3/Si02納米粒子的最大吸收峰變緩是由於在納米粒子 中Ru(bpy)3相對含量的降低造成的。參見圖3，Ru(bpy)3/Si02納米粒子最大發射波長為 590nm，與Ru(bpy)3的最大發射波(600歷)相比，其最大發射波長藍移了約lOnm。這是由於 Ru(bpy)3的最大發射波長與其周圍環境有較大關係，在水溶液中時，包裹後的Si02殼層阻 礙了 Ru(bpy)3與極性水分子之間的相互作用，從而使得最大發射波長發生藍移。實驗測得 lmg/mL純Ru(bpy)3的螢光強度反而比0. 5mg/mL納米顆粒低是由於高濃度的Ru(bpy)3發 生自身螢光淬滅所致。2.光漂白實驗和染料洩露試驗將濃度為lmg/mL的純Ru(bpy)3染料和Ru (bpy) 3/Si02納米粒子水溶液分別用 100W氙燈作為激發光源進行照射，樣品距氙燈的距離為5cm，每隔15分鐘測量一次最大發 射波長處的螢光強度，共測試90min，觀測二種溶液的螢光強度隨照射時間的變化。將製備好的納米顆粒取lmg分散到4mL水中，測其螢光強度，測完後超聲15分鐘， 離心分離，棄去上清液，將沉澱下來的納米顆粒又重新分散在4mL水中並測其螢光強度，然 後再超聲15min，再離心分離並將沉澱重新溶於4mL水中測其螢光強度，重複上述步驟數 次，通過螢光強度的變化測量Ru(bpy)3/Si02納米粒子在水溶液中超聲不同時間後染料分子Ru(bpy)3&洩漏程度。參見圖4，純如0^7)3染料經過90min的氙燈照射後螢光強度衰減了 56%左右，而 Ru(bpy)3/Si02納米粒子只衰減了約8%，表明其具有良好的抗光漂白的能力。參見圖5，納 米顆粒經過染料洩露實驗後的螢光強度只減少了不到0. 05%，說明Ru(bpy)3/Si02納米粒 子在水溶液中具有良好的穩定性，幾乎沒有發生染料洩露。3.納米顆粒表面氨基定量實驗利用氨基化合物與水合茚三酮反應生成藍紫色物質在563nm處有明顯吸收峰的 原理測定氨基。向2支5. 0ml離心管中分別加入5 ii L APTMSU. Omg Ru(bpy) 3/Si02納米 顆粒，然後向每支離心管加入0. 5mL 0. 056mol/L的水合茚三酮溶液和1. 5mL水，最後向離 心管中分別加入0. lmL 0. lmol/L的NaOH溶液，80°C水浴加熱5分鐘，冷卻後用U-3010紫 外_可見分光光度計測量其在563nm處的吸收。在測定Ru (bpy) 3/Si02納米粒子的表面氨基數量時，以APTMS作為標準 物測量563nm處的吸光度做標準工作曲線，相關係數為0. 996，相關直線方程為y =-0. 00155x-0. 00362。然後將Ru (bpy) 3/Si02納米粒子用同樣的方法測定563nm處的吸 光度(假設納米粒子內部的氨基不發生反應)，代入上述直線方程，即可算出納米球表面氨 基的數量。結果為加入lOiUAPTMS的條件下所製備的直徑為70nm左右的納米球每毫克含 有約385nmol氨基。4納米顆粒標記SA取lmg Ru (bpy) 3/Si02納米顆粒，超聲分散於0. lmol/L磷酸鹽緩衝溶液中 (pH7. 2)，加入4. OmgBSA和0. 3mL 1 %的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應24小時，然後將納米 顆粒離心、磷酸鹽緩衝溶液充分洗滌以除去未反應的BSA分子等，再分散到lmL磷酸鹽緩 衝溶液中，加入100 y g的SA和100 ii L 0. 1 %的戊二醛水溶液，室溫下繼續攪拌反應24小 時，加入0. 5mg的NaBH4，室溫反應2小時。表面標有SA分子的納米粒子經離心、洗滌後，以 pH8. 0的0. 05mol/LNH4HC03水溶液為洗脫液，用S印hadex G-50 (1. 0 X 30cm)柱進行進一步 分離純化，將螢光強度高且在280nm處有最大吸收的組分收集在一起，最終得2mL納米粒子 標記的SA溶液，加入1 % BSA後分裝冰凍保存。Ru (bpy) 3/Si02納米粒子標記SA的原理示意圖，參見圖7，將表面氨基化的納米粒 子首先與BSA鍵合，然後再通過戊二醛將SA連接到BSA包裹的納米微粒上。這樣由於在SA 和納米粒子之間存在柔韌性較好的BSA橋梁，使得標記SA的納米粒子更容易與其它生物分 子反應，且保持SA的活性。用螢光分光光度計分別測量Ru(bpy)3/Si02納米粒子、納米粒 子-BSA結合體及納米粒子-BSA-SA結合體的螢光光譜，結果參見圖6所示，可以發現，它們 的發射光譜圖相似，其最大發射波長都為590nm。5微陣列蛋白晶片檢測HIV p24抗原將羊抗HIV p24單克隆抗體用分析緩衝液稀釋成濃度系列0，0. 1，1，10，50，100， 200,500ug/mL,點樣，8X8array，點間距300iim，共點6個微陣列點陣於同一片醛基玻片 片基上，4°C過夜。每點陣加40iiL封閉液4°C過夜，洗滌。往1 6點陣依次加入25 iiL不 同濃度p24抗原，p24抗原濃度系列為0,0. 033,0. 33，3. 3，33，330 y g/mL，37°C反應lh，洗 滌，各點陣分別加入25 ill 0. 2mg/mL生物素-羊抗HIV p24多克隆抗體，37°C反應1. 5h，洗 滌。往各點陣分別加入25 ii L 0. 3mg/mL納米粒子-鏈酶親和素標記物(NPs_SA)，室溫反應lh，洗滌後於晶片掃描儀上測量。 在晶片測試實驗中，根據條件實驗的結果，當固定其它條件不變，改變生物素_羊 抗HIV p24多克隆抗體的濃度，分別進行螢光免疫分析測試，結果發現，測得的螢光強度值 隨生物素-羊抗HIV p24多克隆抗體的濃度的增加而增加，但當其濃度達到一定值(0. 2mg/ mL)時，螢光信號不再隨其濃度的增大而增大。固定其它條件不變，改變NPs-SA的濃度， 測得的螢光強度值隨NPs-SA濃度的增加而增大，但當NPs-SA濃度達到0. 3mg/mL時，出現 平臺。因此，我們選擇生物素-羊抗HIV p24多克隆抗體及NPs-SA的濃度分別為0.2及 0.3mg/mL。晶片掃描結果如圖8和圖9所示。由圖8、9可以看出，同一微陣列點陣，隨著固 相抗體濃度的增加，螢光強度增大，不同微陣列點陣，固相抗體濃度相同情況下，螢光強度 隨P24抗原濃度增大而增大，且螢光強度與p24濃度呈良好的正相關性。當固相抗體點樣 濃度為100 u g/mL時，以本底信號(n = 10)標準偏差的3倍作為最低檢測限計算此方法的 檢測HIV p24抗原的最低檢測限為3. Ing/mL。
權利要求
一種螢光納米粒子Ru(bpy)3/SiO2，其特徵在於該螢光納米粒子為核殼結構，該核殼結構以三聯吡啶釕為內核，在三聯吡啶釕的表面覆蓋網狀結構的二氧化矽，在二氧化桂表面帶有活性氨基基團，其中三聯吡啶釕與二氧化矽的質量比為1∶180～1∶190，且每毫克納米粒子含有70～80nmol氨基。
2.根據權利要求1所述的螢光納米粒子Ru(bpy) 3/Si02,其特徵在於該螢光納米粒子為 規則球形，平均粒徑為64 76nm。
3.一種製備根據權利要求1所述的螢光納米粒子Ru(bpy)3/Si02的方法，其特徵在於 該方法的具體步驟為將環己烷、正己醇和Triton X-100按20 1 10 25 1 14 的體積比混合均勻後，加入水至溶液澄清透明，在再入Ru (bpy) 3水溶液，控制Triton X-100 與Ru(bpy)3的摩爾比為6340 1 6360 1 ；攪拌均勻後按10 1 5 10 1 7 的摩爾比依次加入正矽酸乙酯、3-氨丙基三甲氧基矽烷和氨水，並且正矽酸乙酯和Triton X-100的摩爾比比為1 9 1 10;避光下攪拌反應22 26小時；加入丙酮破乳，超聲 分散，離心分離，然後分別用無水乙醇和超純水洗滌以除去表面活性劑及未反應的原料雜 質，真空乾燥後，得到表面帶有氨基的Ru(bpy)3/Si02螢光納米粒子。
4.一種根據權利要求1所述的Ru(bpy)3/Si02螢光納米粒子作為螢光探針在檢測HIV P24抗原中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種螢光納米粒子Ru(bpy)3/SiO2、其製備方法及應用。該螢光納米粒子為核殼結構，該核殼結構以三聯吡啶釕為內核，在三聯吡啶釕的表面覆蓋網狀結構的二氧化矽，在二氧化桂表面帶有活性氨基基團，其中三聯吡啶釕與二氧化矽的質量比為1∶5～1∶8，且每毫克納米粒子含有約385nmol氨基。本發明的矽螢光納米粒子Ru(bpy)3/SiO2大小均一，單分散性好，平均粒徑為70±6nm；且具有很好的光穩定性，在水溶液中不易發生染料洩露。該螢光探針標記鏈酶親和素後應用於蛋白質微陣列晶片檢測HIV p24抗原，採用的分析方法為夾心式螢光免疫分析法，結果顯示螢光強度與p24濃度呈良好的正相關性，分析靈敏度為3.1ng/mL。結果表明，該納米粒子作為一種新型的螢光探針可應用於高靈敏檢測的蛋白質微陣列晶片及螢光免疫分析等系統。
文檔編號C09K11/06GK101864291SQ201010185659
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者劉斌虎, 尹東光, 張樂, 張禮, 謝春娟 申請人:上海大學