Braf基因突變的快速檢測的製作方法

2023-07-23 10:06:06

專利名稱：Braf基因突變的快速檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和醫學領域，具體涉及一種BRAF基因突變的高靈敏快速檢 測。
背景技術：
BRAF基因屬於RAF家族成員，位於染色體7q34，大小為190Kb，含有七個轉錄區， 包括18個外顯子，編碼一個67KD-99KD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞的增殖、分化 和凋亡。BRAF基因可在甲狀腺乳頭狀癌、惡性黑色素瘤、腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中發生突 變。2002年Davie等在66%的惡性黑色素瘤和一系列的其它腫瘤中檢測到BRAF基因體細 胞突變，該突變主要見於BRAF基因11和15外顯子的激酶結構域內，80%以上的突變都是 15外顯子1799位核苷酸上的單鹼基顛換，致使其編碼的胺基酸由纈氨酸轉變為穀氨酸。之 後，不同國家和地域的學者在甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroid cancer, PTC)中檢測到 了 BRAFv6°°e突變。由於該突變中在599位的蘇氨酸活化性磷酸化位點附近插入了一個負性 調節殘基，可模擬活化區域的磷酸化過程，使BRAF基因與維持其失活態的ATP結合環活化 區的聯繫中斷，從而級聯式激活，並通過RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信號傳導通路而引起細胞 的異常增殖和分化，最終導致腫瘤的形成。B-Raf基因突變被發現存在於黑色素瘤、大腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中。本檢測 試劑盒用於輔助臨床醫生篩選出病患B-Raf基因突變情況。為臨床醫生用藥提供指導和依 據，降低醫生治療風險以及患者經濟負擔。檢測BRAF基因突變，對判斷腫瘤的發生和發展後以及了解腫瘤的治療效果具有 一定意義。(1)正常人血檢中出現BRAF基因異常，提示存在腫瘤易感性；(2)大量研究表明， 無BRAF基因突變的結直腸癌等腫瘤患者，經帕尼單抗和愛比妥靶向藥物治療療效明顯，因 此，通過檢測BRAF基因突變狀態可以篩選用藥人群，實現腫瘤患者的個體化治療，延長患 者生存期。惡性腫瘤病人血漿或血清中存在高水平的循環DNA，這種DNA來源於惡性腫瘤細 胞。新近研究已經從癌症患者血漿或血清DNA中發現了幾種腫瘤特異的基因改變，表明這 是檢測腫瘤相關基因改變的一條新途徑。由於取材方便，血漿分子檢測迅速成為腫瘤研究 的一個熱點。目前，血漿突變檢測可以作為腫瘤分子診斷的一種新方法。由於BRAF基因的突變對如甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤的相關性，所以檢測BRAF的突 變基因對及早診斷和治療癌症有很大的臨床意義。本發明主要是利用高解析度溶解曲線分 析來進行BRAF基因突變的高靈敏快速檢測。本試劑盒可用於高靈敏度、高通量、低成本檢測BRAF突變，協助臨床醫生實現腫 瘤病人的個體化治療，降低治療風險以及患者負擔。目前普遍應用的BRAF基因突變檢測方法為限制小片段長度多態性分析法(RFLP 法)和DNA直接測序法等。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結合的方法。但是該方法存在 以下缺點RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性，非閉管操作，易於汙染，難以滿足臨床檢測要求。DNA直接測序該方法存在以下缺點檢 測周期較長，花費昂貴，非閉管操作，難以避免交叉汙染，通量不高。DNA直接測序的靈敏度 較低，雜合突變、膠壓縮、GC富集區的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數據， 需要多次重複測序才可能避免假陽性等，因此直接測序方法不適用於臨床要求。臨床迫切需要開發一種快速、準確、操作簡便和避免汙染的BRAF基因突變檢測技 術，滿足臨床用藥和檢測診斷方面的時效性和高靈敏度的要求。

發明內容
本發明目的在於提供一種快速、準確、操作簡便和有效避免汙染的檢測BRAF基因 突變的試劑盒，解決了現有技術中進行BRAF基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、精確 度低和汙染等問題，尤其提供了除組織之外的非創傷性如血清或血漿等檢測本發明提供的技術方案是一種檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括用於特 異性擴增BRAF基因靶向序列的若干個引物對，所述引物對含有BRAF基因的第11外顯子 BRAF11或第15外顯子BRAF15中至少15個連續的核苷酸構成的連續核苷酸序列，所述 BRAF 11具有SEQ ID No 1的連續核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No 2的連續核苷 酸序列。優選的，所述連續核苷酸序列所述連續核苷酸序列為SEQ ID No 3 20序列之一 的正向或反向核苷酸序列。優選的，所述引物為SEQ ID No 3 20序列之一的正向引物或反向引物。優選的，所述試劑盒還包括PCR緩衝液、dNTPs、螢光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反應體系，所述PCR反應體系終濃度組成為 優選的，所述PCR反應體系終濃度組成為 優選的，所述螢光染料選自EvaGreen飽和性染料、LC Green染料，ResoLight染 料、SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混 合液；所述PCR緩衝液包括Tris *cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；-20°C下pH值在8. 0-9. 0間。本發明的另一目的在於一種檢測BRAF基因外顯子位點突變的方法，其特徵在於 所述方法包括以下步驟(1)設計並選取包括含有BRAF基因的第十一外顯子BRAF11或第十五外顯子 BRAF15中至少15個連續的核苷酸構成連續核苷酸序列構成的若干個引物對；(2)提取模板DNA，利用步驟(1)得到的引物對對模板DNA中BRAF基因進行PCR 擴增；(3)根據高解析度溶解曲線法對擴增後的BRAF基因進行突變位點檢測。優選的，所述步驟(2)中模板DNA從選自外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔 道的脫落物、病變組織中提取，進行PCR反應的條件為92 97°C預變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50個循環。優選的，所述步驟(2)和步驟(3)在螢光定量PCR儀上進行，在螢光定量PCR儀上 擴增後，運行溶解曲線進行基因掃描分析，所述高解析度溶解曲線法的條件為92 97°C 變性lmin ；40°C復性lmin ；然後初始溶解溫度60°C開始程序升溫溶解至95°C，並在溶解過 程中實時檢測螢光信號，30 50次每秒。本發明的又一目的在於提供一種PCR反應試劑盒在腫瘤診斷相關的BRAF基因突 變檢測方面的應用，本試劑盒選用各種組織來源的基因組DNA如血細胞、口腔黏膜細胞和 腫瘤組織，尤其是採用非細胞體系血清或血漿來源的游離DNA片段。BRAF基因序列如SEQ ID No :21所示，所述的突變常發生在BRAF的第11個外顯 子的突變和發生在BRAF的第15個外顯子的突變
6 本發明提供了一種檢測BRAF基因突變的試劑盒，適用於BRAF第11外顯子G463、 G465、G468的突變和第15個外顯子1799T > A的突變，所述的試劑盒包括以下試劑陰性 對照DNA、用於擴增樣本DNA中BRAF基因的引物、用於擴增樣本DNA中BRAF基因的PCR反 應試劑。較佳地，所述試劑盒還包含反應所需的buffer、dNTP、引物、螢光染料、MgCl2、Taq酶。所述的PCR引物，用化學合成或PCR擴增獲得的突變位點兩端10-50個序列的模 板，以及與之配對的反向序列。所述的PCR引物，下表所示的引物對 所述的PCR引物，用於擴增BRAF基因靶序列，優選為下表所示的引物對，BRAF的 第 11 個外顯子的序列 SEQ ID No 1 ；CGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGGGACA AAGAATTGGATCTGGATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTAAGTATGTAATGTGGTGACA ；BRAF 的第 15 個外顯子的序列 SEQ ID No 2 ；TTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGAC CTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTo 所述的陰性對照DNA，用常規方法從正常人組織中提取獲得的DNA。所述的正常人 組織，包括外周血、體液、腔道的脫落物，以及用這些組織製成的石蠟塊、石蠟切片。所述的PCR反應體系，包括PCR緩衝液、dNTP混合液、螢光染料、MgC12、Taq酶、 DNA模板。所述的PCR緩衝液，包括三羥甲基氨基甲烷鹽(Tris*Cl)，氯化鉀，硫酸銨，氯化 鎂；酸鹼度(PH值)8. 0-9. 0 (20°C )。所述的PCR緩衝液，，包括10x緩衝液，終濃度15mM的 氯化鎂，終 pH 8.7。所述的 dNTP 混合液，包括 10mMdATP、10mM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合液。所述的螢光染料，包括EvaGreen飽和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、 SYT0 9 染料。所述的 MgCl2 為 10-30mM MgCl2。所述的 MgCl2 為 25mM MgCl2。所述的Taq酶，包括濃度5units/ul，反應底物為dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/ min at 72 °C，存儲緩衝液 10_40mM Tris cl，50_200mM 氯化鉀(KCL)，0-5. OmM 二硫蘇 糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA)，0-2. 0 % (V/V)乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet)P-40,0-2. 0% (V/V)吐溫 20 (Tween 20) ,30-70% (v/v)甘油(glycerol)，穩定 劑(stabilizer) :pH 7. 0-10. 0(20°C )所述的存儲緩衝液，包括終濃度為20mM Tris cl、100mM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.0. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v) 穩定劑的終 pH值為9.0。所述的DNA模板，用常規方法從患者組織中提取獲得的DNA。所述的患者組織，包括外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、糞 便、病變組織、腫瘤組織，以及用這些組織製成的石蠟塊、石蠟切片、冰凍切片等。利用試劑盒進行檢測時，包括PCR擴增和HRM程序，其反應條件(PCR反應條件和 HRM的條件)如下表所示 更為優選的， 最為優選的， 本發明在另一方面，提供了一種檢測BRAF基因突變的方法，該方法是檢測來自 於待測個體樣本中的BRAF基因是否存在突變位點，其突變位置分別是第11外顯子G463、 G465、G468點突變和第15外顯子V600E (T1799A)點突變。其中，所述的檢測方法包括如下步驟(1)在血液包括細胞或血清或血漿、分泌物或是組織中提取核酸樣本(2)用上述試劑盒中的陰性DNA，引物及試劑，以第(1)步中提取的DNA為模板進 行實時螢光定量PCR(3) PCR反應條件及HRM條件見下表 進行數據分析，運行溶解曲線觀察峰圖是否呈光滑的單峰，再運行Genescan自動 分析，通過與陰性進行對比來判斷樣本是否發生了待檢測的BRAF位點的突變。
所述的方法中，通過使用所述的試劑盒、DNA模板，按所述的反應條件在螢光定 量PCR儀上進行序列擴增、運行溶解曲線，進行數據分析，得到分型的圖譜。所述的螢光定 量PCR儀，包括LightCyeler 480 (羅氏公司，巴塞爾，瑞士)、ABI7500 (美國應用生物系 統公司，紐約，美國)、ABI7900(美國應用生物系統公司，紐約，美國)、QiagenRotor-Gene 6000 (德國Qiagen公司，杜塞道夫，德國)、Idaho LightScanner (美國Idaho公司，愛達 荷州，美國)。在使用時，將待測樣本稀釋到同一濃度，同時放入陰性對照，加入MIX，進行 PCR反應，配套的基因分型軟體即可自動區分野生型與突變型。採用的陰性對照樣品可以包 括BRAF-463和BRAF-1799陰性對照樣品。本發明的試劑盒可以提供與腫瘤用藥選擇和診斷相關的BRAF基因突變的快速檢 測，所述的腫瘤，包括胰腺癌、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、急性白血病、結直腸癌、甲狀腺乳頭 狀癌、皮膚癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、腦瘤、視網膜母細胞瘤、鼻腔 有鼻癌、鼻竇癌、口腔有舌癌、牙齦癌、甲狀腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮細胞癌、肉瘤、腺 癌、淋巴細胞癌。較為優選的，所述的腫瘤包括胰腺癌、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、急性白血 病、結直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌。檢測BRAF基因突變的用於PCR反應的試劑盒，適用於BRAF第—^一外顯子及第 十五外顯子突變的檢測。本發明檢測BRAF基因突變時，所述引物用於擴增BRAF基因靶向 序列，包括以下引物對(1)第一引物序列含有BRAF-463的至少15個連續的核苷酸，第二 引物序列含有BRAF-463的至少15個連續的核苷酸；⑵第一引物序列含有BRAF-1799的 至少15個連續的核苷酸，第二引物序列含有BRAF-1799的至少15個連續的核苷酸。優選的，本發明的檢測BRAF基因突變的方法，包括以下步驟(1)在血液包括細胞或血清或血漿、分泌物或是組織中提取核酸樣本(2)用上述的試劑盒和引物，以步驟(1)提取的核酸、陰性對照為模板，進行實時 定量PCR檢測(3)分析數據，運行溶解曲線觀察是否單峰，再運行Genescan自動分析程序，與陰 性對照參比，判斷樣本DNA中KRAS基因的各位點是否突變。在本發明中，術語「試劑盒」是指用於PCR反應的混合物，它包括反應所需的緩衝 液(buffer)、dNTP混合液、引物、螢光染料、MgCl2、Taq酶。在本發明中，術語「引物」是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作為在一定條件下誘發DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發合成與核酸鏈相互補的 引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆 轉錄酶)存在下，在一種合適的緩衝液並在合適的溫度下進行上述合成。優選的引物是單 股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決於該引物的設計用途，但在一般在15 25個核 苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩定的雜交複合物。 引物不必反應模板的準確序列，但必須充分互補，已與模板雜交並引發DNA合成。引物設計遵循以下原則①引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。②產 物不能形成二級結構。③引物長度一般在15 30鹼基之間。④G+C含量在40% 60% 之間。⑤鹼基要隨機分布。⑥引物自身不能有連續4個鹼基的互補。⑦引物之間不能有連 續4個鹼基的互補。⑧引物5'端可以修飾。⑨引物3'端不可修飾。⑩引物3'端要避開 密碼子的第3位。
弓Li殳if 白勺^^牛* Primer Premier 5, Beacon Designer 7。本發明所用引物由上海英濰捷基公司通過亞磷醯胺三酯法合成，亞磷醯胺三酯法 是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向 5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3' -5'磷酸二酯鍵連接。具體方法如下1、將預先連接 在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5' _羥基的保護基 團DMT，獲得游離的5'-羥基。2、合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四 氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶 液中游離的5'-羥基發生縮合反應。3、帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數 5'-羥基沒有參加反應(少於2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應，這 種短片段可以在純化時分離掉。4、在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙 酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被接上 去。最後通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC，PAGE等手段純化引 物。本發明中使用的引物序列選自採用以下序列之一的任意引物 相對於現有技術中的方案，本發明的優點是1.高通量1次可同時檢測該突變位點10-384個樣本2.高敏度在腫瘤研究中低突變率樣品基因突變檢測，最低檢測到0. 的突變 樣品基因突變，即檢測到1000個正常細胞中1個突變細胞，適用於手術和其它微量組織中 突變檢測。本發明試劑盒由於靈敏度非常高，可以使用在各種組織來源的基因組DNA如血 細胞、口腔黏膜細胞和腫瘤組織，尤其是採用非細胞體系血清或血漿來源的游離DNA片段。 這採用現有技術中的檢測方法是不可能實現的。3.特異性好PCR產物無需後續處理，特異性高達100%。直接未知雜合突變鑑定 準確性100%，特異性100%。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為本發明實施例不同片段大小的引物進行PCR擴增得到的電泳圖；圖2為本發明實施例進行引物驗證得到的電泳圖；圖3為本發明實施例陰性對照DNA的電泳圖；圖4為本發明實施例陰性對照DNA的測序圖；圖5為本發明實施例不同活性的酶進行PCR擴增的電泳圖；圖6為本發明實施例不同螢光染料進行HRM的溶解曲線圖；圖7為本發明實施例不同MgCl2終濃度進行PCR-HRM的溶解曲線圖和得到的PCR 產物電泳圖；圖8為本發明實施例不同標本DNA模板進行檢測的溶解曲線圖；圖9為本發明實施例靈敏度實驗圖；圖10為本發明實施例準確度實驗圖；圖11為本發明應用例甲狀腺乳頭狀癌患者石蠟切片模板DNA進行擴增後檢測的 溶解曲線圖。圖12為本發明應用例正常人血漿標本模板DNA進行擴增後檢測的溶解曲線圖13為本發明應用例甲狀腺乳頭狀癌患者血漿模板DNA進行擴增後檢測的溶解 曲線圖。圖14為本發明應用例甲狀腺乳頭狀癌患者血清模板DNA進行擴增後檢測的溶解 曲線圖。圖15為本發明應用例黑色素瘤患者血清模板DNA進行擴增後檢測的溶解曲線圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明 本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做 進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1 引物的設計、合成及驗證按照BRAF突變第11外顯子和第15外顯子的序列，進行引物設計。對引物的不同 序列長度進行擴增比較，篩選特異性好的引物。弓丨物片段大小的引物進行PCR擴增的特異性結果圖1所示，圖la為5_9bp的引物 PCR擴增的電泳圖，圖lb為13-16bp的引物PCR擴增的電泳圖，圖lc為18-24bp的引物PCR 擴增的電泳圖，圖Id為25-29bp的引物PCR擴增的電泳圖，圖le為30_37bp的引物PCR擴 增的電泳圖，圖1 f■為39-45bp的引物PCR擴增的電泳圖。表1不同引物大小的PCR擴展結果 根據表1結果和圖1所示，可知最佳引物為18_24bp大小的引物。引物合成上海Invtrogen公司合成引物驗證用聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳對合成的引物進行鑑定，包括以下步 驟使用加有7M尿素的16%的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。取0. 2-0. 50D的引物，用尿 素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素乾粉直到飽和，上樣前加熱變性(95°C，2minS)。加入 尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，約2-3小時後，剝 膠，用螢光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件 許可，也可以用EB染色或銀染方式染色；得到電泳圖如圖2所示。實施例2陰性對照DNA的製作陰性對照DNA的提取1、抽取正常人外周血2.5ml於枸櫞酸鈉(1 9)抗凝管中。2、抗凝管中的血8000rpm離心5分鐘，分離血漿和細胞。3、血漿小心移入另一無菌管子，注意不要吸到白細胞，-20度保存(1周)，4. DNA提取將抗凝血8000rpm離心5min，吸出上層的血漿，用Blood Mini kit試 劑盒(德國QIAGEN公司生產)進行血液的提取，提取步驟參見試劑盒的說明書進行，其他 涉及產品同樣處理，提取的DNA-20 °C保存。
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5.定量使用Nano 1000定量儀，測定DNA濃度。合格指標1，符合0D值A260/ A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0 要求之間，再將 DNA 定量稀釋到 10ng/ul。6.電泳鑑定提取的DNA用1. 0%的瓊脂糖凝膠120V電泳25min，電泳條帶比較 單一，比較純，電泳結果如圖3 ；測序鑑定將提取的DNA進行PCR擴增後送英濰捷基測序， 測序結果如圖4。上述鑑定結果表明，按上述方法所獲得的DNA樣品符合陰性對照的要求。實施例3 腫瘤組織DNA的提取樣本採集取新鮮組織塊50 lOOmg以PBS或生理鹽水清洗乾淨，所用組織必須切至厚度在 0. 5cm以下，放入裝有1. 5ml體積RNAlater的凍存管中，充分混勻。(30分鐘內完成)室溫下放置1-2小時，4°C冰箱過夜，第二天轉至-20°C長期保存。DNA 提取使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因組 DNA 提取試 劑盒，按照試劑盒操作說明，提取DNA。DNA 純化(若提取的 DNA, 0D 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，沒有 在標準範圍內，則需要此步驟)加入等體積的氯仿-異戊醇(25 1)，向下翻轉離心管5min以充分混勻， 13000rpm離心lOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml離心管；加入1/10體積的醋酸鈉(pH5. 2，3M)，再加入兩倍上清液體積的無水乙醇，輕輕 搖勻，沉澱DNA13000rpm離心3min，輕輕倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,離 心3min，去上清液，倒置5-lOmin (倒置時間視DNA塊狀沉澱大小以及DNA乾燥的速度決 定，注意DNA不可太乾燥，否則DNA將難以被溶解，但離心管管壁的乙醇一定要除去)；加入 30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA充分溶解。實施例4 血液中血漿DNA的提取抽取病人外周血l_2ml於枸櫞酸納(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管， 吸取部分血液至離心管8000rpm離心5分鐘，分離血漿和細胞。血漿小心移入另一無菌管 子，注意不要吸到白細胞，"20度保存(1周)，管身標示病人名字和編號，註明日期即可。然後進行DNA提取，可以按照如下步驟血漿用Blood Mini kit試劑盒(德國 QIAGEN公司生產)進行血液的提取，提取步驟參見試劑盒的說明書進行，其他涉及產品同 樣處理，提取的DNA-20 V保存。實施例5血液中血清DNA的提取抽取病人外周血l_2ml至非抗凝的收集管，8000rpm離心5分鐘，吸取血清移入另 一無菌管子，注意不要吸到白細胞，"20度保存(1周)，管身標示病人名字和編號，註明日期 即可。然後進行DNA提取，可以按照如下步驟血清用Blood Mini kit試劑盒(德國 QIAGEN公司生產)進行血清DNA的提取，提取步驟參見試劑盒的說明書進行，其他涉及產品 同樣處理，提取的DNA-20°C保存。實施例6石蠟切片組織DNA的提取刮削5-10 ym厚的切片1-5片(如果標本已暴露空氣中，棄去最初的2_3層)。用 二甲苯脫蠟後用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德國QIAGEN公司生產)，按照試劑盒的操作說明提取DNA，其他涉及產品同樣處理，提取的DNA-20°C保存。實施例7 :PCR-HRM條件優化實驗1)熱啟動Taq酶選擇用不同廠家的酶進行實驗，選擇活性比較高的酶，結果如下表和圖5，圖5中1、2、 3、4 分別為 HotStarTaq 酶、FastStartTaq 酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G 快速熱啟動 DNA聚合酶的酶活性檢測結果圖，根據該圖最終確定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活 性最高。表2不同廠家的熱啟動Taq酶活性 2)螢光染料的選擇用不同廠家的染料進行實驗，選擇結合效果好的染料；實驗結果如圖6所示，圖6 中 1、2、3、4、5 分別為 Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo 螢光染料的實驗結 果，據圖可知最佳染料為Eva Green和LC Green。表3不同廠家的染料的螢光結合效果 染料Eva Green和LC Green的效果最好。3) PCR條件的優化在退火溫度、Mgcl2濃度兩方面PCR條件進行優化調整，結果如表表4不同MgCl2終濃度和退火溫度的PCR擴增結果 60°C時，MgC12 濃度為 2. 0mM，2. 5mM 的實驗圖如圖 7(BRAF-463 和 BRAF-1799)所 示，可以看出，選擇退火溫度為60°C，Mgcl2終濃度為2. 5mM時為最佳的條件。4)HRM條件優化HRM條件的優化溶解的起始溫度、每秒鐘監測螢光的次數兩方面調整表5不同檢測螢光次數和起始熔解溫度的熔解曲線效果 最佳HRM條件的確定 5)DNA來源樣本分別從外周血、口腔拭子、組織、石蠟切片中進行檢測模板DNA，檢測結果如下表和 圖8所示表6不同來源的模板DNA檢測結果 圖8A D分別為外周血血漿、口腔、組織、石蠟切片的檢測結果，由圖可知，外周 血、口腔拭子、組織、石蠟切片中的DNA均可檢測，差異性不大。
6)靈敏度實驗用實施例1 5獲得的材料和優化的條件，確定檢測的靈敏度。實驗中，同時放入 陰性對照樣本、1 %突變樣本、5%突變樣本、10%突變樣本、15%突變樣本。如圖9和表七所 示如圖9所示，經實驗確定，試劑盒檢測靈敏度最高可達到1%。其他檢測方法對照 文獻Mutation Research 635(2007) 105-117的檢測方法靈敏度數據，如下表所示，本試劑 盒達到目前多種突變檢測方法中最高靈敏度1%。表7本試劑盒與其它檢測方法靈敏度比較 如圖9所示，本試劑盒達到目前多種突變檢測方法中最高靈敏度1%。6)HRM檢測精度分析用實施例1 5獲得的材料和優化的條件，確定檢測的精確度。實驗中，用BRAF 的引物檢測肺癌患者石蠟切片組織，並與直接測序法相比較。如圖10所示本試劑盒的檢測結果如下表表8本試劑盒和測序檢測對照表 結論BRAF_1799引物檢測40例石蠟組織切片樣本實驗中，本試劑盒檢測出10例 樣本檢測有突變分型，實際測序有9例突變，HRM和測序檢測成功率100%，陽性檢測出率達 測序比較一致性100%，兩種方法檢測一致率為95%。從檢測結果分析，本試劑盒檢測突變 的靈敏度超過測序。應用例1甲狀腺乳頭狀癌石蠟切片組織BRAF突變掃描取甲狀腺乳頭狀癌患者的石蠟切片30例，提取DNA作為模板。使用儀器LightCyclerTM 480螢光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、刮削5-10 iim厚的切片1-5片(如果標本已暴露空氣中，棄去最初的2_3層)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德國QIAGEN公司生產)，按照試劑盒的操作 說明提取DNA
引物序列 PCR反應體系 PCR和HRM反應條件 結果討論用以上優化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結果在甲狀腺乳頭狀癌 病人中檢出BRAF G463突變的有5例(檢出率大約為16. 7% )，BRAF1799突變的有10例 (檢出率大約為33. 3% )，圖11A、11B為甲狀腺乳頭狀癌病人石蠟切片組織中BRAF-463和 BRAF-1799突變檢測圖。符合國內外研究報導的甲狀腺乳頭狀瘤中BRAF基因突變的機率。
應用例2甲狀腺乳頭狀癌血漿的基因掃描抽取病人(共20例)外周血l-2ml於枸櫞酸鈉(1 9)或EDTA抗凝管中，不用 肝素抗凝管，吸取部分血液至離心管8000rpm離心5分鐘，分離血漿和細胞。血漿小心移入 另一無菌管子，注意不要吸到白細胞。提取血漿中的DNA作為模板。使用儀器LightCyclerTM 480螢光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、將抗凝血8000轉離心5分鐘，取上層血漿。2、用Qiagen Blood Mini kit (德國QIAGEN公司生產)。按照試劑盒的操作說明 提取血漿DNA。引物序列 PCR反應體系 PCR和HRM反應條件
得到如圖12A、12B為正常人樣本中BRAF-463和BRAF-1799突變檢測圖以及如圖 13A、13B為甲狀腺乳頭狀癌患者樣本中BRAF-463和BRAF-1799突變檢測圖。結果討論用以上優化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結果在甲狀腺 乳頭狀癌病人中檢出BRAF G463突變的有3例(檢出率大約為15% ),BRAF1799突變的有 5例(檢出率大約為25%)。符合國內外研究報導的甲狀腺乳頭狀瘤中BRAF基因突變的幾 率。應用例3甲狀腺乳頭狀癌血清BRAF突變檢測抽取病人(20例)外周血l-2ml於非抗凝管中，吸取部分血液至離心管8000rpm 離心5分鐘，分離血清和細胞。血清小心移入另一無菌管子，注意不要吸到白細胞。提取血 清中的DNA作為模板。使用儀器LightCyclerTM 480螢光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、將非抗凝血8000轉離心5分鐘，取上層血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德國QIAGEN公司生產)。按照試劑盒的操作說明 提取血清DNA。引物序列
外顯子引物序列
BRAF的第 11 個外顯 Forward 5，-CGAGTGATGATTGGGAGATTC-3， PCR反應體系 PCR和HRM反應條件 結果討論用以上優化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結果在甲狀腺乳頭狀癌 病人中檢出BRAF G463突變的有3例(檢出率大約為15% ),BRAF1799突變的有5例(檢 出率大約為25% )，圖14A、14B為樣本中BRAF-463和BRAF-1799突變檢測圖。符合國內外 研究報導的甲狀腺乳頭狀瘤中BRAF基因突變的機率。應用例4黑色素瘤血清BRAF突變掃描抽取病人(20例)外周血l_2ml於非抗凝管中，吸取部分血液至離心管8000rpm 離心5分鐘，分離血清和細胞。血清小心移入另一無菌管子，注意不要吸到白細胞。提取血 清中的DNA作為模板。使用儀器Light Cycler 480螢光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、將非抗凝血8000轉離心5分鐘，取上層血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德國QIAGEN公司生產)。按照試劑盒的操作說明 提取血清DNA。引物序列
PCR反應體系 PCR和HRM反應條件 結果討論用以上優化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結果在黑色素 瘤人中檢出BRAF G463突變的有8例(檢出率大約為40% )，BRAF1799突變的有10例(檢 出率大約為50% )，圖15A、15B為樣本中BRAF-463和BRAF-1799突變檢測圖。。符合國內 外研究報導的黑色素瘤中BRAF基因突變的機率。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是 能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括用於特異性擴增BRAF基因靶向序列的若干個引物對，所述引物對含有BRAF基因的第11外顯子BRAF11或第15外顯子BRAF15中至少15個連續的核苷酸構成的連續核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQ ID No1的連續核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No2的連續核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述連續 核苷酸序列為SEQ ID No 3 20序列之一的正向或反向核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述引物 為SEQ ID No 3 20序列之一的正向引物或反向引物。
4.根據權利要求1所述的檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述試劑 盒還包括PCR緩衝液、dNTPs、螢光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反應體系， 所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩衝液終濃度1 10 X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列終濃度為0. 1 0. 5 y M ；模板 DNA0. 1 1. 5ng/ii L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. 10U/ u L ；MgCl2終濃度為1 3mM ；螢光染料1 3X。
5.根據權利要求4所述的檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述PCR 反應體系終濃度組成為PCR緩衝液終濃度1 5X;dNTPs0. 2 0. 3mM ；引物序列終濃度為0. 2 0. 3M ；模板 DNA0. 5 1. Ong/ u L ；TaqDNA 聚合酶0. 03 0. 06U/ u L ；MgCl2終濃度為2 3mM ；螢光染料1 2X。
6.根據權利要求1所述的檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述螢光 染料可選自DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料、 SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR緩衝液包括Tris cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；-20°C下pH值在8. 0-9. 0間。
7.—種檢測BRAF基因外顯子位點突變的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(1)設計並選取包括含有BRAF基因的第十一外顯子BRAF11或第十五外顯子BRAF15中 至少15個連續的核苷酸構成連續核苷酸序列構成的若干個引物對；(2)提取模板DNA，利用步驟(1)得到的引物對對模板DNA中BRAF基因進行PCR擴增；(3)根據高解析度溶解曲線法對擴增後的BRAF基因進行突變位點(BRAF11和BRAF15) 檢測。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)中模板DNA從選自外周血細 胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、病變新鮮組織、冰凍病變切片、石蠟病變切片中提取，進行PCR反應的條件為92 97°C預變性4 15min ；92 97°C變性10 30s， 56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50個循環。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)和步驟(3)在螢光定量PCR 儀上進行，在螢光定量PCR儀上擴增後，運行溶解曲線進行基因掃描分析，所述高解析度溶 解曲線法的條件為92 97°C變性lmin ；40°C復性lmin ；然後初始溶解溫度60°C開始程序 升溫溶解至95°C，並在溶解過程中實時檢測螢光信號，30 50次每秒。
10.一種PCR反應試劑盒在腫瘤用藥選擇和診斷相關的BRAF基因突變檢測方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測BRAF基因突變的PCR反應試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括用於特異性擴增BRAF基因靶向序列的若干個引物對，所述引物對含有BRAF基因的第11外顯子BRAF11或第15外顯子BRAF15中至少15個連續的核苷酸構成的連續核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQID No1的連續核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No2的連續核苷酸序列。本發明的試劑盒採用飽和探針和高解析度溶解曲線分析技術，完成對樣品基因型的判斷，從而為多種腫瘤包括甲狀腺乳頭狀癌、惡性黑色素瘤、腸癌、卵巢癌等的選擇用藥和診斷提供指導。
文檔編號C12Q1/68GK101875971SQ20101013421
公開日2010年11月3日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者王弢, 王秀娟, 秦勇, 陳菲 申請人:蘇州工業園區為真生物醫藥科技有限公司