用以調節細胞膜重封的組合物和方法

2023-07-23 01:00:01 2

專利名稱：用以調節細胞膜重封的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用於調節細胞膜修復的多肽組合物及其應用方法。
背景技術：
為了維持細胞的穩態，真核細胞必須通過針對不同損傷來源進行活性再循環和修 復而保持其質膜的完整性。例如，針對外部損傷和內部變性，機體的細胞必須修復每一個單 細胞周圍的膜以便維持其功能和生物體的健康。修復質膜損傷是一個需要若干步驟的活性和動態過程，包括可檢測質膜急性損傷 的分子感受器的參與、分子內囊泡在損傷部位成核以及囊泡融合以能夠形成膜片。已經證 實，胞外鈣的內流與胞內囊泡與質膜的融合有關，然而，感應受損膜信號所涉及的分子機制 和用於修復片形成的成核過程(nucleation process)尚未得到徹底解決。細胞修復外膜能力的缺陷與廣譜的疾病和病症有關，例如神經變性疾病(如帕金 森病，BSE和阿爾茨海默氏病(Alzheimer』 s))、心臟病發作、心臟衰竭、肌肉營養不良、褥 瘡、糖尿病性潰瘍、氧化性損傷、以及組織損傷，如作為來自化療藥劑給予的副作用而發生 的鼻竇炎。此外，與多種疾病相關的肌肉無力和萎縮以及正常衰老過程也與膜修復改變有 關。為了這些細胞應對急性損傷而修復其膜，這些細胞利用在細胞內的小膜袋，也稱為囊 泡。這些囊泡通常存在於細胞內部，但是一旦細胞膜發生損傷，則這些囊泡移至損傷部位並 形成膜片以維持細胞完整性。在沒有該必要功能的情況下，細胞可能死亡，且這種細胞損傷 的累積效應可以最終引起組織或器官的功能障礙。因此，目前需要開發細胞膜修復過程的藥物調節劑，用於治療與急性和慢性細胞 及組織損傷有關的病症。

發明內容
本發明涉及驚人和意外發現了細胞膜損傷的修復中所涉及的蛋白和過程。本發明 通常涉及核酸以及從本發明的核酸編碼的多肽，其可單獨地或與其他組分一起調節寬泛範圍的細胞和組織類型中細胞膜重封的過程。本發明還涉及組合物，例如多肽、編碼胞漿、核、 膜結合、和分泌型多肽的核酸；以及載體、宿主細胞、抗體、重組蛋白、假肽、融合蛋白、化合 物以及用於生成這些物質的方法。在某些方面，本發明還涉及作為治療和預防與細胞和/或組織損傷有關的疾病 和病症的治療劑有用的組合物。本發明的治療性組合物包括MG53多肽、以及編碼MG53 多肽的核酸，例如SEQ ID NO. 1蛋白以及MG53多肽突變體、同系物、片段、截短體(平截， truncation)、假肽、肽類似物、和肽模擬物(擬肽，p印tidomimetics)(本文中，「MG53多 肽」)、以及可調節MG53活性或MG53與其他蛋白例如CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3 (SEQ ID NO. 8)、軸突周圍蛋白、和髓鞘鹼性蛋白的分子間相互作用的化合物。如本文所述，MG53介 導對細胞膜損傷的修復，因此針對和調節MG53基因表達、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互 作用代表一種用於組織修復的新型治療性幹預。在另一方面，本發明涉及發現了包含可促進細胞膜修復的胺基酸組分或結構域的 多肽組合物。例如，本發明該方面的實施方式包括分離或重組的多肽，其包含某些胺基酸組 分，包括RING鋅指結合結構域，B-盒鋅結合結構域(B-box zinc-binding domain)、亮氨酸 拉鏈捲曲螺旋結構域、磷脂結合結構域、氧化還原敏感性胺基酸、E3連接酶結構域和SPRY 結構域，其中所述組分共價鄰接於單個多肽中，且該多肽促進細胞膜修復。在進一步方面，本發明涉及包含本發明的多肽以及協同調節本發明多肽的膜修 復活性的試劑的組合物。在某些實施方式中，所述調節性試劑包括例如磷脂醯絲氨酸 (phosphotidylserine)；鋅，例如以鋅鹽、鋅載體或鋅結合物的形式；三七(notoginsing)； 以及氧化劑。在某些另外的方面，本發明涉及與組織損傷治療相關的組合物及方法。在某些示 例性實施方式中，本發明包括例如給予有效量的本發明的治療性組合物，用於預防和/或 治療細胞膜損傷；創傷癒合；改善手術創傷、治療和/或預防作為衰老過程的自然副作用 發生的老年性組織修復缺陷；治療和/或預防任何類型肌肉組織的損傷，例如患心血管疾 病和/或運動相關的損傷的受治療者中發生的損傷；治療和/或預防肌肉營養不良、心肌 缺血、心臟衰竭、老年性變性、神經變性、膿毒症、細菌感染、齦炎、齦退縮、牙周疾病、防皺 (wrinkle protection)、皮膚擦傷(dermal abrasion)、UV損傷、氮芥(化學起皰劑)、潰瘍、 C0PD、創傷癒合、老年醫學、抗炎或其任何組合；以及通過美容或個人護理來修復和再生機 體組織。此外，本發明涉及核酸(包括幹擾性核酸)和編碼MG53相互作用蛋白的多肽，例 如CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3(SEQ ID NO. 8)、軸突周圍蛋白和髓鞘鹼性蛋白、突變體、截 短體、片段、同系物、假肽和肽模擬物，以及可調節其活性或者其與MG53分子間相互作用的 化合物。因此，在另外的方面，本發明包括用於針對CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3(SEQ ID NO. 8)、軸突周圍蛋白和髓鞘鹼性蛋白基因表達、活性和/或分子間相互作用的方法，用於 治療或預防受治療者的疾病或病症，例如用於促進如本文所述的組織修復。前述一般應用領域僅通過實例給出，而並不用於限制本發明披露內容和所附權利 要求的範圍。根據本發明的權利要求、說明書和實施例，本領域普通技術人員將能理解本發 明的另外的目的和優勢。例如，本發明的不同方面和實施方式可以以多種組合應用，所有的 組合根據本發明的描述均被明顯地預期。這些另外的目的和優勢也明顯地包含在本發明的範圍之內。


併入並形成說明書的一部分的附圖，示出了本發明的幾個實施方式，且與描述部 分一起用於解釋本發明的原理。附圖僅是為了示出本發明的實施方式，而不應當解釋為限 制了本發明。圖1 :MG53是TRIM蛋白家族中的一種肌肉特異性成員。比對不同生物的MG53蛋 白序列(見SEQ ID NOs. :1、3、5、9-16)表明該蛋白是TRIM家族的一個成員。功能性結構 域用灰色框出，而箭頭表示該結構域延伸至序列的另一行上。帶框的亮氨酸殘基表示高度 保守的亮氨酸拉鏈基序的位置。圖2 示出了包含在MG53中存在的一個或多個保守性三聯基序的某些同源性蛋白 的示例性結構域比較。MG53的獨特之處在於其能夠易位至多種形式損傷後細胞膜處的受損 部位並介導受損膜的修復_這是一種所列出的其他TRIM家族蛋白未表現出的功能。儘管 這些TRIM蛋白均包含類似的結構域和/或表達於橫紋肌中，但均未完全重現MG53的結構 域機化(結構域結構，domain organization)。圖3 :MG53包含獨特的TRIM和SPRY基序，且主要表達於肌肉細胞內。A. MG53基 序結構的圖。根據cDNA克隆和同源性搜索的結果，在如示出的MG53中檢測到幾個基序序 列。兔和小鼠的序列MG53 cDNA已經分別以登錄號AB231473和AB231474存儲於資料庫 中。B.蛋白質印跡(Western blot)分析示出了骨骼肌和心肌中MG53的特異性表達。來自 小鼠組織(肺、腎、骨骼肌、肝、心臟、腦)的裂解物(每個泳道20iig總蛋白)利用抗小鼠 MG53多克隆抗體進行分析。C.來自小鼠骨骼肌細胞的縱橫切面的免疫螢光染色。比例尺 是 125u m。圖4.由於細胞膜損傷增加，可觀察到mg53-/_骨骼肌中病狀的遞增。A.蘇木素 和伊紅(H/E)染色表明與幼齡(3m)野生型(wt)或mg53-/_小鼠相比，老齡mg53-/_肌 肉(10m)中中央核(箭頭)的數目增加。B.與老齡(8-10個月)野生型對照(黑色，n = 562)相比，老齡(8-10個月)mg53-/_小鼠(藍色，n = 541)中肌纖維的直徑有所降低，而 幼齡(3-5個月)wt(n = 765)與mg53-/-(n = 673)肌肉之間則不存在差異。與wt相比 時，mg53-/_骨骼肌中顯示中央核的肌纖維百分比隨年齡增加。數據為均值士s. e.m.，*p < 0. 05，AN0VA。C.小鼠進行30分鐘的下坡跑運動後，取其完整比目魚肌，按照所描述步驟， 利用體外電壓刺激流程，評估收縮性能的示蹤記錄。黑色跡線代表wt肌肉，藍色跡線則對 應於mg53-/_肌肉。D.疲勞刺激之前(刺激前，空心棒)，與wt (黑色)相比，老齡mg53-/_肌 肉(藍色)中以g/mg總蛋白標準化的最大強直性張力顯著較低(n = 4)。疲勞刺激之後6 分鐘(刺激後，實心棒)，與mg53-/"肌肉相比，wt肌肉恢復顯著更大。*p < 0. 05，AN0VA。 E.當與wt肌肉中的極低染色相比時，廣泛的伊文思藍染色表明，經受下坡跑的mg53-/_骨 骼肌中損傷嚴重。F.運動後，利用甲醯胺從老齡mg53-/-(藍色)和wt (黑色)骨骼肌所提 取伊文思藍染料量的圖。數據表示每g肌肉中的伊文思藍(ng)均值士 s. e.m.。n = 8_12， *p 20個在分離過程中表現出損傷的不同肌纖維。(b)雷射誘導的肌纖維膜損傷後，從wt小鼠分離的FDB肌纖維中膜不通透 性FM-143螢光染料的排除。(c)雷射誘導的損傷後，FM-143螢光染料內流入從mg53-/_小 鼠分離的FDB肌纖維。指出了雷射損傷後的時間。(d)雷射損傷肌纖維膜誘導的FM-143在 FDB肌纖維內的時間依賴性累積。數據為均值士s. e.m.，從wt小鼠獲得的纖維n = 30，而 從mg53-/_小鼠獲得的纖維n = 18。圖6. MG53敲除小鼠易感於心肌損傷。來自未運動野生型小鼠的石蠟包埋心肌切 片表現為正常形態(左圖)且無伊文思藍染色(右圖)。相反，mg53-/_小鼠表現出伊文思 藍滲入肌原細胞內，表明mg53-/_心臟內的膜完整性存在明顯缺陷。圖7.MG53的喪失增加了對心肌缺血再灌注損傷的易感性。從野生型(WT)和 mg53-/"小鼠分離心臟並在Langendorff裝置上灌注。灌注液流動停止30分鐘後誘發全身 缺血。灌注液流動恢復後(時間點0)心臟內產生的損傷，可通過(a)肌酸激酶(CK)或(b) 乳酸脫氫酶(LDH)的酶分析而測定。來自mg53-/_小鼠的心臟(虛線)表現出比WT(實 線)更多的損傷。所列出每一個時間點的數據均以均值士S.D.示出。圖8.物理性創傷後，含MG53的囊泡在質膜內形成膜片。a)利用微量吸管損傷 C2C12成肌細胞膜導致GFP-MG53在損傷部位(箭頭)的快速累積。圖像代表n = 40個分 離的細胞。b)針對嚴重損傷如細胞膜分離的成熟C2C12肌管的恢復，與GFP-MG53募集至 癒合部位相關(ri = 28)。c)比較野生型和mg53-/_原代骨骼肌管的存活率。該數據表明， MG53對於橫紋肌細胞中的膜重封來說是必需的。圖9. TRIM和SPRY結構域在將MG53靶向於肌細胞的細胞表膜中的作用。A.MG53缺 失融合蛋白構建體的圖，其中GFP融合於N末端或C末端。參照SEQ ID NO. 1/『TRIM」表示 a. a. 1-287，而「SPRY」表示a. a. 288-477，且既包括PRY又包括SPRY基序。B.代表性的共焦 圖像示出了每一種缺失構建體在C2C12細胞中的細胞內定位。比例條是5iim。C.MG53通過 TRIM基序與小窩蛋白_3相互作用。將來自共轉染GFP-MG53或GFP-TRIM和pcDNA-Cav_3 的CH0細胞的細胞裂解物與抗小窩蛋白-3(小鼠單克隆抗體)進行IP。(泳道1，混合細胞 裂解物，作為陽性對照；泳道2，正常小鼠IgG，作為陰性對照；泳道3，來自過表達GFP-MG53 的細胞的裂解物；泳道4，來自過表達GFP-TRIM的細胞的裂解物)。圖10. TRIM和SPRY結構域在將MG53靶向於非肌肉CH0細胞中細胞表膜中 的作用。代表性的共焦圖像示出，GFP-MG53表現出細胞內囊泡、膜靶向性和出芽，然而 MG53-GFP在天然情況下主要為可溶的(上圖)；SPRY-GFP和GFP-SPRY均呈胞質性分布(中 圖)；TRIM-GFP和GFP-TRIM主要為細胞內囊泡，而不靶向於質膜(下圖)。「TRIM」表示 a. a. 1-287，而「SPRY，，表示a. a. 288-477，且既包括PRY又包括SPRY基序。比例條是5 y m。圖11.MG53可以與驅動蛋白家族成員ll(Kifll)相互作用。(a)從穩定表達 FLAG-標記型的 RFP (mRFP)、RFP_MG53 (MG53)或 C29L 突變 RFP-MG53 (C29L)的 HEK293 細胞 中分離細胞裂解物。將提取物與抗FLAG抗體進行免疫共沉澱，隨後在SDS-PAGE凝膠上電 泳。考馬斯染色揭示了將通過該方法co-IP(免疫共沉澱)的特異性條帶。一條主要條帶 對於Kifll (箭頭)。(b)質譜分析用來鑑定來自這些凝膠的特殊條帶。該代表性質譜示蹤 證實MG53可從細胞裂解物沉降Kifll。圖12. MG53可以與C0P9複合物同系物亞單位6 (CSN6)相互作用。HEK293細胞用 HA標記的人MG53和myc標記的CSN6進行瞬時轉染，隨後用於利用抗重組性標籤的抗體進行免疫共沉澱(IP)。利用蛋白質免疫印跡(IB)來證實沉降後該蛋白的存在。MG53可沉降 CSN6，且CSN6也可沉降MG53。這為這兩種蛋白可在細胞內相互作用提供了證據。泳道1 = HA-hMG53+hCSN6+DMS0,泳道 2 = HA-hMG53+hCSN6+MG132,泳道 3 = HA-mMG53+hCSN6+DMS0, 泳道 4 = HA-mMG53+hCSN6+MG132。圖13. MG53可與髓鞘鹼性蛋白或軸突周圍蛋白相互作用。(a)用於從野生型(WT) 或mg/53-/-(K0)骨骼肌的囊泡成分的生化分離方法的示意圖。(b)用a中所示方法分離的 成分使用15% (左圖)的梯度(右圖)SDS-PAGE凝膠進行電泳。考馬斯亮藍(CBB)染色表 明差異地存在於WT或K0肌肉中的特異性條帶。通過質譜分析將兩種顯著條帶鑑定為髓鞘 鹼性蛋白或軸突周圍蛋白(箭頭)。圖14. MG53通過與磷脂醯絲氨酸結合與細胞膜相互作用以介導囊泡運輸。當在這 些mg53(-/_)肌管中表達GFP-MG53時，該蛋白將適當定位於質膜和細胞內囊泡(上圖)。 PIP2-Strip (條帶)脂質點印跡分析表明，重組MG53(li!g/ml)特異性結合磷脂醯絲氨酸 (PS)而非其他膜脂質，包括鞘氨醇-1-P、磷脂酸、磷脂醯膽鹼(phosphotidylcholine), 磷脂醯乙醇胺和多種肌醇磷脂代謝產物(phosphainositol metabolite) (B) 0利用 Annexin-V-GFP,我們觀察到Annexin-V_GFP在C2C12成肌細胞受損部位的快速標記。轉染 入C2C12成肌細胞內的Annexin-V-GFP(—種具有明確的結合PS的能力的分子)顯示用微 電極創傷細胞後的易位最小(左圖)，而Armexin-V-GFP與RFP-MG53的共表達(右圖)引 起Annexin-V-GFP的加速累積(C)。通過RFP-MG53的共表達，加速了 Annexin-V-GFP的累 積(0. 93 士0. 21 AF/F0對照；2. 9 士0. 63 A F/F0+MG53)。細胞外Ca2+通過受損質膜內流使得 Annexin-V與PS的結合，導致其從細胞損傷前的可溶性模式轉化為到質膜與細胞內囊泡的 獨特的定位(D)。從細胞外液中去除Ca2+阻斷了在損傷部位PS被Armexin-V-GFP標記，保 持RFP-MG53至損傷部位的易位(E)。圖15.急性質膜破損導致細胞內面暴露於外部的氧化環境。(A和B)在通過加入 二硫蘇糖醇(DTT)產生的還原環境中，MG53主要作為單體存在。(C)在細胞外液中包含5mM DTT，對C2C12細胞中MG53介導的膜修復過程產生顯著影響。硫柳汞氧化半胱氨酸殘基的 巰基。(E)多個保守的半胱氨酸殘基被突變為丙氨酸-保持了膜靶向性，但徹底破壞了其促 進膜修復過程的能力；即，未觀察到C242A在損傷部位的累積。圖16. (A)在還原性細胞外環境(+DTT)下，很大程度上破壞了 GFP-MG53至損傷部 位的易位。將氧化劑(硫柳汞)加入細胞外液中導致GFP-MG53至細胞膜上的損傷部位的 易位增加。這些實驗在C2C12細胞中進行。(B)具有C242A突變的MG53 (GFP-C242A)不能 易位至質膜上的損傷部位。因為一種不同的保守性半胱氨酸突變體，C313A，在氧化條件下 保持寡聚化模式，並表現出與野生型GFP-MG53類似的易位和膜修復功能。因此Cys242的 氧化很可能誘導MG53的寡聚化，提供一個在損傷部位用於修復複合體(repairsome)形成 的成核位置。用C2C12細胞進行這些實驗。(C)調整細胞外氧化還原狀態可影響已分離肌 纖維膜的重封，因為將DTT加入細胞外液中阻礙了膜重封，如通過細胞外施用的FM-143染 料內流增加而測量的。圖17. MG53介導的修復複合體形成和急性肌纖維膜損傷的恢復。在用GFP-MG53和 GFP-C242A轉染的mg53-/_肌管中，使用FM4-64 (FM1-43的紅移變異體)的內流作為膜修復 能力的指標。在UV脫去綠色螢光後，在損傷部位發生GFP-MG53的快速易位，而GFP-C242A則由於其有缺陷的寡聚特性而保持靜止。與GFP-C242A相比，觀察到在用GFP-MG53轉染的 細胞內FM4-64內流顯著較少，表明損傷後該突變體不能恢復膜完整性(B)。MG53寡聚化似 乎是修復複合體形成中的一個步驟，因為wt骨骼肌中表達的GFP-C242A突變體表現出對天 然MG53的顯性負性作用(C)。與GFP-MG53相比，GFP-C242A在成年wt肌纖維中的過表達 抑制了肌纖維膜的修復功能(C)。圖18.由MG53催化的體外泛素化。將一種重組性麥芽糖結合蛋白(MBP)與MG53 的融合蛋白(MBP-MG53)與ATP、泛素、E1和E2酶一起孵育，並用抗MBP抗體進行免疫印跡 分析。當MBP-MG53與Ubc4或UbcH5 (作為E2) —起孵育時，觀察到源自泛素化的高分子量 梯(梯形條帶，ladder) (a)。在C29L突變體中，MG53的固有E3連接酶活性顯著降低(b)。 (c)蛋白質印跡表明，全長GFP-MG53和GFP-C29L蛋白存在於已分化的C2C12肌管中，因此 C29L突變體是穩定的，這些融合蛋白的降解可能不會促成GFP-C29L的差異亞細胞分布。GFP-C29L在C2C12肌管中主要呈現一種胞漿模式(d，左圖)。蛋白質印跡表明，全 長GFP-MG53和GFP-C29L蛋白存在於已分化的C2C12肌管中(c)，因此這些融合蛋白的降解 可能不會促成圖(d)中觀察到的GFP-C29L和GFP-MG53差異亞細胞分布。利用這些融合蛋 白在源自mg53-/_新生鼠的原代培養骨骼肌管中的瞬時表達可觀察到類似現象，其中對於 GFP-C29L突變體，GFP-MG53至肌纖維膜和細胞內囊泡的靶向性則減弱(d，右圖)。急性膜 損傷後，可觀察到GFP-MG53在C2C12成肌細胞中的快速累積，而GFP-C29L在膜損傷修複方 面則顯示為固定的和無效的(e，左圖)。C2C12肌管中也觀察到了與GFP-C29L類似的缺陷 (e，中圖)。此外，儘管損傷後在原代培養的mg53-/_肌管中GFP-MG53會易位至質膜，但這 些細胞中表達的GFP-C29L通常對急性細胞損傷保持無反應性(e，右圖)。圖19.在創傷表達GFP-MG53的C2C12成肌細胞之前將鋅(Zn)從細胞外液中去 除的影響。用N，N, N，N，-四(2-吡啶基-甲基)乙二胺(TPEN)螯合Zn可阻止GFP-MG53 易位至微電極穿透的部位(A)，表明Zn對於MG53功能是必需的。加入一種Zn離子載體， Zn-1-羥基吡啶-2-硫酮(Zn-l-hydroxypyridine-2-thine) (Zn-HPT)，可誘導 C2C12 細胞 中GFP-MG53的易位(B)。野生型FDB肌纖維+Zn-HPT減少了通過UV雷射誘發損傷後可以 內流入肌纖維的FM-1-43染料的量(C)。圖20. mg53-/"骨骼肌中，鋅在膜修復上的保護性效應喪失。(a)從野生型(WT) 小鼠(3-6個月)中分離單個趾短屈肌(FDB)肌纖維。將引起肌肉局部損傷的強UV雷射施 加至FDB纖維(箭頭)。FM1-43螢光染料(2. 5 y M)的內流用作測量膜修復能力的指標。 UV照射後200s照相(對照)。施用2 y M鋅離子載體(1-羥基吡啶-2-硫酮)(+Zn-HPT) 導致膜修復能力增加，如通過UV損傷後FM1-43染料內流量減少所反映的。加入40 y M TPEN (四-2-吡啶基亞甲基二胺)，鋅離子的一種特殊的緩衝液，導致膜修復能力受損，如通 過UV損傷後FM1-43染料內流顯著增加所反映的(+TPEN)。(b)從mg53-/_小鼠(3_6個 月)中分離的FDB肌纖維表現出膜修復功能的缺陷，如通過相同UV損傷處理後FM1-43染 料內流量提高所示出的(對照)。(c)利用Ca-EDTAdOOyM)，一種緩衝鋅而不改變細胞外 Ca濃度的試劑，也引起了 WT肌肉中膜修復能力的受損(左圖)。用Ca-EDTA進行處理未引 起mg53-/_肌肉中膜修復能力的任何顯著變化。(d)MG53中鋅結合基序的示意圖。MG53的 氨基末端包含兩個公認的鋅結合基序一個位於RING基序處(a. a. 1-56,人cDNA)，另一個 位於B-盒基序處(a.a.86-117，AcDNA)。指出了參與鋅結合的特異性胺基酸。
圖21.細胞外鋅內流促進了 MG53介導的囊泡易位至急性膜損傷部位。a)在C2C12 成肌細胞中表達GFP-MG53融合蛋白。靜止狀態下GFP-MG53呈現在細胞內囊泡和質膜處的 定位(左圖)。微電極穿透引起的細胞急性損傷(箭頭，右圖)。b)將C2C12細胞與40yM Ca-EDTA 一起孵育。c)將20 y M TPEN加入細胞外液中。d)將用GFP-MG53瞬時轉染的C2C12 細胞與20 ii M Zn-HPT 一起孵育。在對照條件(0分鐘)下，延長與Zn_HPT的孵育(15分 鍾)。e) Ca-EDTA和TPEN對C2C12成肌細胞中GFP-MG53介導的膜修復影響的總結數據。圖22.鋅結合於MG53的RING和B-盒基序。a)，在C2C12成肌細胞中瞬時表達的 MG53的RING和B-盒基序內位點特異性突變。在缺失DTT時，轉染後24小時，收集細胞，並 用針對MG53的特異性抗體通過蛋白質印跡分析不同GFP-MG53突變體的表達(左圖)。寡 聚模式標記為「二聚體」。在加入10mM DTT的情況下，所有突變構建體均表現為 75kD的 單體形式(GFP-MG53的預測分子大小)。圖23. MG53可以通過RING基序結合Zn。(a)MG53包含一個規則的TRIM結構域， 其包含一個Zn結合基序(Ring(環))和一個B盒基序。(b)細菌培養物通過聲處理而裂 解，離心，並在4度下在包含10 y M鋅的柱緩衝液中結合於直鏈澱粉樹脂過夜。隨後用無鋅 柱緩衝液(zinc free column buffer)接著用50ml含0. 3mM麥芽糖的無鋅柱緩衝液衝洗 樹脂。如所示出的，蛋白水平和穩定性通過SDS-PAGE凝膠進行確認。泳道1(標誌物)、泳 道2 (mMG53)、泳道3 (mC29L_MG53突變體)、泳道4 (mC29L/C105S雙重突變體DM克隆1)、泳 道 5 (mC29L/C105S 雙重突變體 DM 克隆 2)、泳道 6 (10mg/ml BSA)、泳道 7 (5mg/ml BSA)、泳 道8(2.5mg/mlBSA)、泳道9(lmg/ml BSA)。(c)首先檢測珠上的蛋白是否存在溶液中游離鋅 (根據製劑，為0.01至0. lyM或ND)。珠(等分部分(aliquot))用鋅特異性探針TSQ染 色，並在螢光顯微鏡和所採用的相對螢光強度下觀察螢光。然後將蛋白在56C下變性5分 鍾，渦旋、離心，並從溶液中再次獲取測量結果。該檢測採用TSQ(分子探針(Mol Probe)) 和鋅原子標準溶液(Sigma)用於校準。圖表顯示了結合於重組野生型(WT)MG53、C29L突變 體(C29L)和雙重突變體(DM)的鋅的量。兩種突變體均定位於TRIM結構域的Ring(環) 基序中。數據以均值士S. D.表示。與wt相比，*P < 0. 05，**P < 0. 001 ；n = 4 5。圖24.將從野生型小鼠分離的FDB肌纖維負載有2 u M TSQ, TSQ是一種細胞內液 中鋅的特異性螢光指示劑(下圖)。採用強UV雷射以引起對FDB肌纖維的局部損傷，如通 過FM4-64螢光染料(fluorescent day)在局部損傷部位的累積所反映的(上圖)。注意 在急性損傷部位可觀察到TSQ螢光的顯著升高(因此，較多的鋅)。圖25.從雜交瘤分離的抗hMG53的單克隆抗體(mAb4A3F6F2)在蛋白質印跡上檢 測人(和小鼠)MG53蛋白方面非常有效。圖26. MG53的重組表達。(a)利用Ni_NTA柱從Sf9昆蟲細胞分離的重組人MG53 蛋白(箭頭)成分的考馬斯亮藍染色凝膠。輸入=細胞提取物，FT =流出液，M=標誌物， E =洗提次數。(b)從Sf9昆蟲細胞分離的重組人TAT-MG53(箭頭)的考馬斯亮藍染色凝 膠。(c)從大腸桿菌發酵分離的重組小鼠TAT-MG53(箭頭)的考馬斯亮藍染色凝膠。圖27示出了 hMG53氨基末端的信號肽使得重組MG53作為分泌性蛋白輸出。蛋白 質印跡表明可從用改造的hMG53 cDNA瞬時轉染的CH0細胞的條件培養基中純化出大量的 MG53蛋白。圖28.在用Flag_MG53 (旗-MG53)融合蛋白構建體和一系列HA-MG53融合蛋白突變體轉染的HEK293細胞中進行的免疫共沉澱(Co-IP)實驗。(a)用抗Flag抗體在總細胞 提取物上實施Co-IP，隨後用抗HA抗體進行蛋白質印跡。(b) Co-IP實驗顯示，MG53 二聚體 的形成需要捲曲螺旋結構域的存在。圖29.表達RFP-MG53的穩定的HEK293 (人胚腎)細胞系。(a)穩定表達RFP (紅 色螢光蛋白)對照蛋白(呈現胞質表達模式)的細胞系。(b)僅用微電極損傷表達RFP的 HEK293細胞未引起RFP易位至損傷部位(箭頭)。細胞外緩衝液㈩的過度內流會發生FRP 螢光的部分脫色。(c)穩定表達RFP-MG53的HEK293細胞呈現至細胞內囊泡的定位。(d)損 傷表達RFP-MG53的HEK293細胞導致MG53在少於90秒之內大量易位至損傷部位(箭頭)。圖30.在C2C12細胞中表達的GFP-MG53，隨後用來自三七的醇提取物對這些細胞 進行灌注。應用三七可以快速誘導MG53在灌注後2分鐘內易位至質膜。圖31.重組MG53作為組織修複試劑的治療性應用。將RFP-MG53 ( 一種包含紅色 螢光蛋白的MG53融合蛋白)在HEK293細胞中表達、分離並施加至正在培養的C2C12成肌 細胞周圍的外部介質。細胞用微電極進行機械創傷，同時利用共焦顯微鏡觀察融合蛋白的 定位。可觀察RFP-MG53以易位至這些膜損傷的部位(圓圈)。圖32. MG53的遺傳過表達可防止膜損傷。用RFP-MG53或RFP轉染人胚腎(HEK293) 細胞，隨後用不同強度的電場進行電穿孔。通過評估乳酸脫氫酶(LDH)從由電穿孔產生的 質膜中的孔漏出至細胞外介質中的量，而測定膜損傷的程度。膜發生損傷越嚴重，關於LDH 測定的讀數將越高。圖33.螢光染料內流可用來測定電穿孔後的膜損傷。將人胚胎顎間(HEPM)細胞 (IX IO6)置於PTI螢光系統的旋轉比色皿(spinning cuvette)中。將FM1-43染料(day) 加入細胞外，並用479nm的激發光和598nm的發射光顯示最小螢光。當細胞用50V/cm或 lOOV/cm的場強度進行電穿孔時，在所檢測到的螢光中存在劑量依賴性增加。電穿孔在不存 在染料的細胞中未產生自發螢光(對照)。圖34.螢光染料內流可用來測定機械損傷後的膜損傷。將人胚胎顎間(HEPM)細 胞(IX IO6)置於PTI螢光系統的旋轉比色皿中。將FM1-43染料加入細胞外，並用479nm 的激發光和598nm的發射光顯示最小螢光。將細胞從比色皿中取出(傾倒)，用28號針頭 (gauge needle)剪切(剪切)，引起FM1-43螢光的增加。機械剪切應力在作為對照的不存 在染料的細胞中未產生自發螢光(無染料)。圖35.重組MG53可保護腎細胞不受細胞膜損傷。(a)用10ug/mL重組人MG53或 媒劑對照處理HEK293細胞(8X IO4)，隨後在不同的場強度下進行電穿孔。細胞外重組MG53 可防止電穿孔引起的損傷。(b)將MG53或媒劑對照加入重組LDH中以產生LDH活性的標準 曲線。圖36.重組MG53可保護齦襯裡細胞不受細胞膜損傷。(a)用10ug/mL重組人MG53 或媒劑對照處理HEPM細胞(5X IO4)，隨後在不同的場強度下進行電穿孔。細胞外重組MG53 可防止電穿孔引起的損傷。(b)將MG53或媒劑對照加入重組LDH中以產生LDH活性的標準 曲線。圖37.重組MG53可保護腎細胞不受機械性細胞膜損傷。用玻璃微珠處理HEK293 細胞(8X IO4)，以誘導機械損傷。當將玻璃珠加入介質中時，將不同劑量的重組人MG53或 媒劑對照施加至樣品。將細胞在定軌搖床上轉動，隨後分析上清液的LDH水平。
圖38. MG53的作用特異於該蛋白的功能。MG53已證實在重封Hela宮頸上皮細胞 損傷時是有效的，其中損傷由於暴露於玻璃珠而產生。當重組蛋白煮沸時，該蛋白不能再促 進膜重封。圖39.氮芥誘導的人角質化細胞的膜損傷可通過MG53加以預防。不同劑量的氮 芥(一種皮膚發皰劑)可引起LDH從原代人角質化細胞中釋放。插入的照片示出了暴露於 皮膚發皰劑的效應。圖40.外部施加的重組MG53需要磷脂醯絲氨酸(PS)結合來重封受損膜。用重組 人MG53或媒劑處理HEK293細胞，隨後通過在玻璃微珠(黑棒)存在的情況下搖動而損傷 細胞。通過用在488nm下記錄的比色測定(colormetric assay)所記錄的來自細胞的LDH 釋放來測定膜損傷。用磷脂醯絲氨酸(PS)同時處理細胞可阻礙質膜的重封。*p<0.05。圖41與另一種磷脂醯絲氨酸(PS)結合蛋白的競爭。用重組人MG53或媒劑處理 HEK293細胞，隨後通過在玻璃微珠(黑棒)存在的情況下搖動而損傷細胞。通過用在488nm 下記錄的比色測定所記錄的來自細胞的LDH釋放來測定膜損傷。用過量(5 1)的磷脂醯 絲氨酸(PS)結合蛋白和Annexin V同時處理細胞。*p < 0. 05。圖42. MG53在人胚胎顎間(HEPM)牙細胞中的表達。GFP-MG53正確定位於這些細 胞類型中，還可在通過微電極的物理穿透或用皂角甙去垢劑處理的膜損傷後有效易位至質膜。圖43. MG53在人胚胎顎間(HEPM)牙細胞中的表達。GFP-MG53正確定位於這些細 胞類型中，還可在通過微電極的物理穿透或用皂角甙去垢劑處理的膜損傷後有效易位至質膜。圖44.脂多糖(Lipopolysaccaride)可誘導HEPM細胞中的膜損傷，其可通過暴露 於MG53而避免。當用LPS(lmg/mL)處理HEPM細胞達24小時後，可觀察到LDH釋放，表明 已發生膜損傷。施加MG53可阻止正常水平的LDH從HEPM細胞中釋放，而與LPS和MG53共 孵育則表現為LDH從細胞正常釋放。圖45. MG53可易位至胃細胞中的膜修復部位。用GFP-MG53轉染人胃腺癌(AGS) 細胞，隨後通過微電極針穿透(上圖)或用0. 005%皂角甙處理以透化膜(下圖)造成機械 性膜損傷。通過活細胞共焦顯微鏡監測GFP-MG53至損傷部位(箭頭)的易位。圖46.在神經細胞中，MG53可易位至膜修復部位。用GFP-MG53轉染小鼠原代星 形膠質細胞，隨後通過微電極針穿透(上圖)或用0. 005%皂角甙處理以透化膜(下圖)造 成機械性膜損傷。通過活細胞共焦顯微鏡監測GFP-MG53至損傷部位(箭頭)的易位。圖47.在氣道上皮細胞中，MG53可易位至膜修復部位。用GFP-MG53轉染人C38 氣道上皮細胞，隨後通過微電極針穿透(上圖)或用0. 005%皂角甙處理以透化膜(下圖) 造成機械性膜損傷。通過活細胞共焦顯微鏡監測GFP-MG53至損傷部位(箭頭)的易位。圖48.在氣道上皮細胞中，外部MG53可重封膜損傷。用外部重組人MG53或媒劑 對照處理人IB3氣道上皮細胞，隨後暴露於由玻璃珠引起的機械性膜損傷。通過用在488nm 下記錄的比色測定所記錄的來自細胞的LDH釋放來測定膜損傷。*p < 0. 05。圖49.在免疫細胞中，MG53可易位至膜修復部位。用GFP-MG53轉染小鼠白血病 單核巨噬細胞(RAW 264. 7)細胞，隨後通過微電極針穿透(上圖)或用0.005%皂角甙處理 以透化膜(下圖)造成機械性膜損傷。通過活細胞共焦顯微鏡監測GFP-MG53至損傷部位(箭頭)的易位。圖50. a)在包含額定(nominal)游離鋅的細胞外液中，C2C12細胞中表達的 GFP-C29L突變體(左圖)表現為至急性損傷部位的缺陷運動(中圖)。加入2μΜ Zn-HPT(其 作為鋅跨質膜內流的離子載體)可部分復甦(resCUe)GFP-C29L向急性損傷部位的運動 (右圖)。右圖中展示的圖像為在含2 μ M Zn-HPT的細胞外液中，用微電極穿透後50s從單個 C2C12細胞中獲得的。b)在包含額定游離鋅的細胞外液中，C2C12細胞中表達的GFP-C105S 突變體(左圖)在微電極穿透後不能移至急性損傷部位(中圖)。c)在包含額定游離鋅的 條件下(中圖)或加入2μΜ Zn-HPT後(右圖)，C2C12細胞中表達的GFP-C29L/C105S雙 重突變體(左圖)完全喪失了急性膜損傷的修復能力。圖51.修復C2C12細胞中急性膜損傷時，C29L、C105S、以及C29L/C105S對鋅內流 依賴性的總結數據。其他MG53突變體的數據總結於表1中。圖52.圖示說明了本發明人目前對MG53所介導的膜修復機制的假說。儘管不限 於任何特定理論，但實驗證據表明MG53很可能由於其與含磷脂醯絲氨酸的囊泡結合而定 位於質膜內表面。在正常條件下，MG53很可能是單體，並由於與小窩蛋白_3結合而鄰近於 膜表面螯合(sequester)。細胞膜MG53損傷後，通常處於其還原形式的MG53暴露於一個局 部氧化性環境，其觸發二硫橫橋形成以及分子間MG53寡聚化。MG53寡聚化使含磷脂醯絲氨 酸的囊泡聚集於損傷部位。
具體實施例方式本發明說明書出於所有目的將WO 2008/054561 ；Cai et al.，MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nature Cell Biol. ,11(1) :p_-_ (January 2009)；禾口Cai et al. ,MG53 regulates membrane budding and exocytosis in muscle cells. Journal of Biological Chemistry (2008 年 11 月 24 日在線發表)的全部
內容均結合於此供參考。本發明部分地與驚人地和意外地發現重組核酸序列及相關多肽(見SEQ ID NOs. 1-15)有關，該重組核酸序列及相關多肽能夠促進細胞膜的修復。特別地，本發明人發現急 性膜修復過程中的囊泡融合由mitsugumin 53 (MG53) (SEQ ID NOs. 1_15)驅動，MG53是一 種新型的肌肉特異性三聯基序(TRIM)家族蛋白。MG53表達有利於細胞內囊泡運輸至質膜 並與質膜融合。動態膜修復不僅對於長期保持細胞完整性而且對於急性細胞損傷的恢復均是必 需的。細胞膜的修復需要細胞內囊泡的運輸，其與囊泡在質膜處的累積有關。細胞膜的急 性創傷導致募集含MG53的囊泡以修補損傷部位的膜。不存在MG53的細胞對多種應激包括 雷射誘導性損傷、運動誘發的肌肉損傷表現出膜修複方面的缺陷，以及疲勞後肌肉收縮功 能的受損恢復。因此，MG53是構成細胞膜急性修復和重建基礎的囊泡運輸事件中的一種關 鍵組分。本發明包括的生物聚合體組合物在本文中被總稱為和可互換地稱為「MG53核酸」 或「MG53多核苷酸」或「編碼膜修復多肽的核酸」或「膜修復蛋白核酸」，所對應的編碼多肽 稱為「MG53多肽」或「MG53蛋白」或「膜修復多肽」。除非另外指出，「MG53」 一般用來指任 何MG53相關的和/或MG53來源的生物聚合體，如本文中所明確、含蓄或本質地描述的。此外，如本文中所應用的，「膜修復多肽」和「促進膜修復的多肽」可互換地用於指本發明的多 肽及其生物學活性。除非另外指出，本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域中的 普通技術人員通常所理解的相同的含義。本文提到的所有公開物、專利申請、專利、以及其 他參考文獻的全部內容均結合於此供參考。在衝突的情況下，將以本說明書(包括定義) 為準。另外，材料、方法和實施例僅是為了說明而並不用於限制本發明。對於外部損傷和內部變性，機體細胞必須修復每一個單細胞周圍的膜以便維持其 功能和生物體的健康。細胞修復外膜能力的缺陷與多種疾病有關，例如神經變性疾病(帕 金森病)、心臟病發作、心臟衰竭和肌肉營養不良。此外，與多種疾病以及正常衰老過程相 關的肌肉無力和萎縮，也與膜修復改變有關。而且，膜損傷發生於除慢性疾病以外的多種其 他病理狀態。由於UV暴露引起的皮膚老化，小割傷、皮膚擦傷、手術切口以及糖尿病和其他 健康患者中的潰瘍均牽涉到對細胞膜損傷的某些組分。這些細胞為了針對急性損傷修復其 膜，其利用了細胞內部的小膜袋(稱為囊泡)。這些囊泡通常位於細胞內部，但是一旦發生 細胞膜損傷，這些囊泡移至損傷部位，並形成膜片以維持細胞完整性。在沒有該必要功能的 情況下，細胞可能死亡，且該細胞損傷的累積效應可能最終引起組織或器官功能障礙。預期 本發明提供了用於治療和/或預防細胞損傷有害效應的組合物和方法。如上文所述，在某些方面，本發明涉及核酸、以及從本發明核酸編碼的多肽，其可 單獨地或與其他組分一起調節寬泛範圍的細胞和組織類型中的細胞膜重封的過程。本發明 還涉及組合物，例如多肽、編碼胞漿、核、膜結合以及分泌型多肽的核酸；以及載體、宿主細 胞、抗體、重組蛋白、假肽、融合蛋白、化合物以及用於生產這些物質的方法。例如，在某些方面，本發明包括編碼多肽的分離的或重組的核酸，所述多肽包括 胺基酸和/或肽組分(即結構組分或胺基酸結構域)的組合，其當結合在一起時，得到 具有如本文所描述膜修復活性的多肽。在本發明該方面的一個實施方式中，所述組分包 括RING鋅指結合結構域，B-盒結合結構域、亮氨酸拉鏈捲曲螺旋結構域、磷脂結合結構 域、氧化還原敏感性胺基酸、E3連接酶結構域和SPRY結構域，其中所述組分共價鄰接於 單個多肽中，且該多肽促進細胞膜修復。編碼各個胺基酸或肽結構域的核酸可從任何所 需母本基因克隆而來，並利用標準的分子生物學技術結合入單個連續多肽中。在另外 的實施方式中，本發明包括通過表達基因或cDNA構建體而形成的新型膜修復多肽，該 構建體通過結合編碼來自TRIM家族其他成員的胺基酸或肽組分的核苷酸而構成，其中 TRIM 家族其他成員，例如(登錄號)TRIM1(NM_012216，NM_052817) ；TRIM2 (AF220018)； TRIM3(AF045239) ；TRIM4(AF220023) ；TRIM5(AF220025) ；TRIM6 (AF220030)； TRIM7 (AF220032) ；TRIM8 (AF281046) ；TRIM9(AF220036) ；TRIMlO(Y07829)； TRIMll(AF220125) ；TRIM13 (AF220127, ΝΜ_001007278) ；TRIM14(NM_014788, NM_033221)； TRIM15(NM_033229) ；TRIM16(AF096870) ；TRIM17(AF156271) ；TRIM18(AF230976, AF230977) ；TRIM19 (NM_033244,NM_033250,NM_033240,NM_033239,NM_033247,NM_002675, NM_033246, NM_033249, NM_033238) ；TRIM20(NM_000243) ；TRIM21(NM_003141)； TRIM22(NM_006074) ；TRIM23(NM_033227, NM_001656, NM_033228) ；TRIM24(NM_003852, NM_015905) ；TRIM25(NM_005082), TRIM26(NM_003449) ；TRIM27(AF230394, AF230393)； TRIM28(NM_005762) ；TRIM29(AF230388) ；TRIM31(AF230386) ；TRIM32(ΝΜ_012210)；TRIM33(AF220136) ；TRIM34(NM_130390，NM_001003827, NM_130389, NM_001003819)； TRIM35(AB029021) ；TRIM36(AJ272269) ；TRIM37(AB020705) ；TRIM38 (U90547)； TRIM39(NM_021253, NM_172016) ；TRIM40(AF489517) ；TRIM41(NM_033549, NM_201627)； TRIM42(AF521868) ；TRIM43(NM_138800) ；TRIM44(NM_017583) ；TRIM45(NM_025188)； TRIM46(NM_025058) ；TRIM47(AY026763) ；TRIM_48(AF521869) ；TRIM49(NM_020358)； TRIM50(AY081948) ；TRIM51(NM_032681) ；TRIM52(NM_032765) ；TRIM53(XR_016180)； TRIM54(NM_032546, NM_187841) ；TRIM55 (NM_184087，NM 184085，NM_184086, NM_033058) ；TRIM56 (NM_030961) ；TRIM57 (i. e. , TRIM59) ；TRIM58 (ΝΜ_015431)； TRIM59(NM_173084) ；TRIM60(NM_152620) ；TRIM61(XM_373038) ；TRIM62(NM_018207)； TRIM63(NM_032588) ；TRIM64(XM_061890) ；TRIM65(NM_173547) ；TRIM66(XM_001716253)； TRIM67(NM_001004342) ；TRIM68(NM_018073) ；TRIM69(AF302088) ；TRIM70(DQ232882, NM_001037330) ；TRIM71(ΝΜ_001039111) ；TRIM72(i. e. , MG53 ；ΝΜ_001008274)； TRIM73(AF498998) ；TRIM74(ΝΜ_198853) ；TRIM75(ΧΜ_939332)。在另一個實施方式中，本發明包括由本發明的核酸編碼的分離的或重組的多肽， 具有RING鋅指結合結構域，B-盒結構域、亮氨酸拉鏈捲曲螺旋結構域、磷脂結合結構域、氧 化還原敏感性胺基酸、E3連接酶結構域、SPRY結構域、以及可選的鈣結合結構域，其中所述 組分共價鄰接於單個多肽中，且該多肽促進細胞膜修復。本發明強調了用於產生能夠促進膜修復的多肽的重要胺基酸結構組分或特徵 (即，RING鋅指結合結構域，B-盒結構域、亮氨酸拉鏈捲曲螺旋結構域、磷脂結合結構域、氧 化還原敏感性胺基酸、E3連接酶結構域、SPRY結構域)。重要的是，應注意到，如上文所述， 儘管RING鋅指結合結構域，B-盒結構域、亮氨酸拉鏈捲曲螺旋結構域、磷脂結合結構域、氧 化還原敏感性胺基酸、E3連接酶結構域、SPRY結構域、以及鈣結合結構域在進化相關蛋白 以及無關蛋白之間可能有所不同，但存在大量屬於TRIM家族的基因，包括MG53，其包含上 述結構組分或結構域的一種或全部。如本領域技術人員應當理解的，這些結構域可以易於 從TRIM家族成員的基因或cDNA克隆而來，並利用分子生物學中熟知的技術移植或克隆入 另一個TRIM家族基因(即MG53)的框架內，以便產生新蛋白。此外，因為通常認為進化保 守的胺基酸序列可可類似地發揮功能，因此按照本發明的教導產生另外的蛋白、以及評估 重組蛋白促進膜修復的能力都在本領域技術人員的能力之內，而無需過多的實驗。同樣，從 TRIM家族成員的結構域組裝的重組蛋白，例如，上文鑑定的那些蛋白明確地預期在本發明 的範圍之內。在另一個實施方式中，本發明包括編碼如在SEQ ID NOs. :1、3、5、7、8、9_15中所 列出的MG53多肽和/或其同系物或片段的分離的或重組的核酸，其中該多肽促進細胞膜修復 ο在另外的方面，本發明涉及包含本發明的多肽連同能夠調節膜的至少一種其他試 劑的組合物。在某些實施方式中，所述試劑通過與本發明的多肽直接或間接相互作用而協 同起作用以促進細胞膜修復。例如，如本文所示，諸如磷脂醯絲氨酸、鋅、氧化劑和植物提 取物的試劑可以調節本發明多肽的膜修復活性。(參見實施例)。因此，在另外的實施方 式中，本發明涵蓋的含膜修復多肽的組合物中的任何一種也可以共同包含有效量的磷脂； 含鋅試劑；氧化劑；植物提取物中的至少一種或其組合。在某些實施方式中，磷脂是磷脂醯絲氨酸。在另外的實施方式中，含鋅試劑是鋅離子載體，例如，Zn-I-羥基吡啶-2-硫酮 (Zn-HPT)。在其他實施方式中，氧化劑是硫柳汞。在另外的實施方式中，植物提取物是三七 提取物。在某些另外方面，本發明涉及一種包含本發明的分離的或重組的多肽連同藥用載 體的組合物。在另外的實施方式中，該組合物還可以進一步共同包括有效量的磷脂；含鋅試 劑；氧化劑；植物提取物中至少一種或其組合。在某些實施方式中，磷脂是磷脂醯絲氨酸。 在另外的實施方式中，含鋅試劑是鋅離子載體，例如，Zn-I-羥基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)。 在其他實施方式中，氧化劑是硫柳汞。在另外的實施方式中，植物提取物是三七提取物。本發明還涉及驚人地和意外地發現，本發明的多肽可以修補多種不同細胞類型和 組織中的膜。不限於任何特定理論，可以認為修復機制通過多肽寡聚體如二聚體的形成通 過蛋白中的捲曲螺旋結構域而介導，該捲曲螺旋結構域包含亮氨酸拉鏈蛋白-蛋白相互作 用基序。最驚人的發現之一是本發明所多肽的膜修復活性對急性膜損傷後的細胞外鈣的 內流僅具有較小的依賴。這與細胞外鈣內流(calcium entry)是細胞膜修復的唯一信號的 本領域中目前範例(paradigm)形成對比。目前的結果表明本發明的多肽如MG53的膜修復 活性主要由氧化性細胞外環境內流入細胞區室內的還原環境誘導而不是鈣內流誘導。該機 制允許膜修復多肽作為細胞氧化還原狀態的感受器發揮作用，並通過與細胞膜的特異性脂 質組分相互作用而在質膜處寡聚化以形成同源性複合物。例如，如本文中詳細描述的，鋅 (Zn)對於MG53介導的膜重封來說是必需的，另外的Zn的存在可以提高MG53的活性；來自 植物三七的提取物也可提高MG53在膜重封方面的功能；MG53需要其內源性E3連接酶活性 以產生急性損傷後的膜修復。本發明另外的方面涉及驚人的發現，細胞外施加或給予膜修復多肽例如MG53也 可以促進膜重封，表明與穿膜肽(細胞穿透肽)如HIV-TAT蛋白(參見WO 2008/054561，其 結合於此供參考)的耦聯對於重組性MG53作為有效治療劑起作用可能並不是必需的。同 樣，該方面的某些實施方式包括的治療性組合物包含本發明的膜修復多肽例如MG53、連同 一種藥用載體，其中該治療性組合物全身性給予，並且該全身性給予的組合物在促進膜修 複方面是有效的。在某些另外的實施方式中，本發明的治療性組合物連同本發明的膜修復多肽，進 一步包含一種或多種另外的組分，包括磷脂；含鋅試劑；氧化劑；植物提取物或其組合，其 對本發明多肽的膜修復具有協同效應。在另外的實施方式中，本發明的治療劑可以包含一 種或多種生物學活性成分，諸如鎮痛藥、抗酸藥、抗焦慮藥、抗心律不齊藥、抗菌劑、抗生素、 抗凝劑和溶栓劑、抗驚厥藥、抗抑鬱劑、止瀉劑、止吐藥、抗真菌藥、抗組胺劑、抗高血壓藥、 消炎藥、抗腫瘤藥、抗精神病藥、解熱藥、抗病毒藥、巴比妥酸鹽、β _阻滯劑、支氣管擴張藥、 感冒藥、皮質類固醇、鎮咳劑、細胞毒素藥、解充血藥、利尿藥、祛痰藥、激素、降血糖藥(口 服)、免疫抑制劑、緩瀉藥、肌肉鬆弛劑、鎮靜劑、性激素、安眠藥、鎮靜劑、維生素或其組合。在另外的方面，本發明涉及給予個體有效量的編碼膜修復多肽如MG53、其同系物、 片段和衍生物的核酸用於治療和/或預防體外、體內或離體細胞膜損傷的方法。如本文所 示，本發明的膜修復多肽能夠促進多種細胞和組織類型中的膜修復，且可以提供抗多種病 症的有效治療途徑，所述病症涉及受損的膜通透性。在某些實施方式中，所述細胞包括例如成纖維細胞、不同來源(卵巢、腎等)的上皮細胞、神經元細胞、角質化細胞、牙細胞、胃細 胞、免疫細胞、骨骼肌和心肌細胞。促進幾乎任何細胞和組織類型中細胞膜修復的能力易於 按照本發明的教導內容確定。此外，熟練技術人員應當認識到，這樣的實施方式為本發明人 所掌握，根據本發明的教導內容，檢測修復活性的能力完全在本領域普通技術人員的技能 範圍內，而無需過多的實驗。在另外的方面，本發明涉及治療和/或預防與細胞或組織損傷相關的疾病或病理 狀態的方法，包括給予個體有效量的組合物，該組合物包含編碼膜修復多肽例如MG53、其同 系物、片段或衍生物的核酸或膜修復多肽連同藥用載體，其中該組合物在治療和/或預防 細胞或組織損傷方面是有效的。在某些實施方式中，與細胞或組織損傷相關的疾病或病理 狀態包括肌肉營養不良、心肌缺血、心臟衰竭、老年性變性、神經變性、膿毒症、細菌感染、齦 炎、齦退縮、牙周疾病、防皺、皮膚擦傷、UV損傷、氮芥(化學起皰劑)、潰瘍、C0PD、創傷癒合、 老年醫學、抗炎或其任何組合。在本文所述方法的任何一種中，本發明的核酸或多肽可以任何藥用形式和以任何 藥用途徑遞送或給予，如下文將進一步詳細描述的。例如，包含本發明核酸和/或多肽的組 合物可全身遞送或直接給予細胞或組織用於治療和/或預防細胞膜損傷。在某些另外的實 施方式中，本發明的核酸和/或多肽包含載體部分，該載體部分可提高生物可利用度、增加 藥物半衰期、使治療劑靶向於特定細胞或組織類型或其組合。在另外的方面，本發明涉及一種分離的或重組的膜修復多肽複合物。如下文詳細 示出的，MG53多肽表現出與多種其他細胞蛋白相互作用(例如，以非共價鍵結合)並形成 複合物的能力。在該方面的一個實施方式中，本發明包括一種分離的或重組的膜修復多肽， 例如MG53、其同系物、片段和衍生物、連同CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白_3、軸突周圍蛋白和髓 鞘鹼性蛋白中的至少一種，其中該組合形成一種蛋白複合物，且其中該複合物能夠促進細 胞膜修復。本發明進一步包括一種治療或預防細胞損傷的方法，包括以與CSN6、驅動蛋白、 小窩蛋白-3、軸突周圍蛋白和髓鞘鹼性蛋白中至少一種的蛋白複合物形式給予細胞有效量 的分離或重組膜修復多肽，其中該複合物能夠促進細胞膜修復。在又一種另外的實施方式 中，本發明包括一種治療或預防與細胞或組織損傷有關的疾病或病理狀態的方法，包括以 與CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3、軸突周圍蛋白和髓鞘鹼性蛋白中至少一種的蛋白複合物 形式給予個體有效量的分離或重組膜修復多肽例如MG53，其中該複合物能夠減緩疾病或病 理狀態的影響。調節MG53活性的方法包括調節CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3、軸突周圍蛋白、和髓 鞘鹼性蛋白中任何一種或其組合的表達水平或活性或二者。在又一另外的方面，本發明涉及篩選調節細胞膜修復的化合物的方法，其中通過 使MG53、CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白_3、軸突周圍蛋白、髓鞘鹼性蛋白中至少一種或其組合 與測試化合物相接觸；以及測定該測試化合物的結合，和/或CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3、 軸突周圍蛋白、髓鞘鹼性蛋白的活性，和/或測定對細胞膜修復的效應。如下文詳細描述的，以及如本領域中技術人員所易於理解的，重組的膜修復多肽 可以在原核細胞或真核細胞例如哺乳動物細胞中生成，然後通過蛋白改造分泌入細胞外溶 液中，這是一種能生成大量功能蛋白的途徑。在某些方面，本發明還涉及作為治療和預防與細胞和/或組織損傷相關的疾病和病症的治療劑有用的組合物。本發明的治療組合物包括膜修復多肽，例如MG53多肽、以及 編碼MG53多肽，例如SEQ ID NO. 1蛋白以及MG53多肽突變體、同系物、片段、截短體、假肽、 肽類似物和肽模擬物(本文中，「MG53多肽」)的核酸，以及可調節MG53活性或MG53與其 他蛋白例如CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3(SEQ ID NO. 8)、軸突周圍蛋白、和髓鞘鹼性蛋白的 分子間相互作用的化合物。如本文所述，MG53介導對細胞膜損傷的修復，因此針對和調節 MG53基因表達、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用代表一種用於組織修復的新型治療 性幹預。在另外的方面，本發明涉及發現包含可促進細胞膜修復的胺基酸組分或結構域的 多肽組合物。例如，本發明該方面的實施方式包括分離的或重組的多肽，其包含某些胺基酸 組分，包括RING鋅指結合結構域、B-盒鋅結合結構域、亮氨酸拉鏈捲曲螺旋結構域、磷脂結 合結構域、氧化還原敏感性胺基酸、E3連接酶結構域、SPRY結構域、以及鈣結合結構域(其 中所述組分共價鄰接於單個多肽中，且該多肽促進細胞膜修復)連同一種協同調節本發明 多肽膜修復活性的試劑。在某些實施方式中，該調節性試劑包括磷脂，例如磷脂醯絲氨酸； 鋅，例如以鋅鹽、鋅載體或鋅結合物的形式；三七；氧化劑或其組合。在某些另外的方面，本發明涉及與組織損傷治療相關的組合物和方法。在某些示 例性實施方式中，本發明包括例如給予有效量的本發明的治療組合物，用於預防和/或治 療細胞膜損傷、創傷癒合；緩解手術創傷，治療和/或預防作為衰老過程的自然副作用發生 的老年性組織修復缺陷；治療和/或預防任何類型肌肉組織的損傷，例如患心血管疾病和 /或運動相關的損傷的受治療者中發生的損傷；治療和/或預防肌肉營養不良、心肌缺血、 心臟衰竭、老年性變性、神經變性、膿毒症、細菌感染、齦炎、齦退縮、牙周疾病、防皺、皮膚擦 傷、UV損傷、氮芥(化學起皰劑)、潰瘍、C0PD、創傷癒合、老年醫學、抗炎或其任何組合；以 及通過化妝品或個人護理來修復和再生機體組織。此外，本發明涉及核酸(包括幹擾性核酸)和編碼MG53相互作用蛋白的多肽，例 如CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3(SEQ ID NO. 8)、軸突周圍蛋白和髓鞘鹼性蛋白、突變體、截 短體、片段、同系物、假肽和肽模擬物，以及可調節其活性或其與MG53的分子間相互作用的 化合物。因此，在另外的方面，本發明包括用於調節CSN6、驅動蛋白、小窩蛋白-3(SEQ ID NO. 8)、軸突周圍蛋白和髓鞘鹼性蛋白基因表達、活性和/或分子間相互作用的方法，用於 治療和/或預防受治療者的疾病或病症，例如用於促進如本文所述的組織修復。在本文所 述的任何一個實施方式中，治療性組合物可以以如本文所述或如本領域中眾所周知的任何 適當的藥物形式給予。在一個方面，本發明提供了一種編碼膜修復多肽分子例如MG53核酸分子的分離 核酸以及編碼與SEQ ID而3:2、4和6中所披露核酸具有至少30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90%或100%同一性的膜修復多肽的核酸。在某些實施方式中，本發明的分離核酸分 子將在嚴格條件下雜交於與包括膜修覆核酸序列的蛋白編碼序列的核酸分子互補的核酸 序列。本發明還包括一種編碼膜修復多肽例如MG53多肽或其片段、同系物、類似物、融合蛋 白、假肽、肽模擬物或衍生物的分離核酸。例如，該核酸可編碼與包括SEQ IDNOS :1、3、5、7、 8和9-15的胺基酸序列的多肽至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一 性的多肽。該核酸可以為例如包括SEQ ID NOS :2、4和6中任何一個的核酸序列的基因組 DNA片段或cDNA分子。
本發明還包括一種寡核苷酸，例如包括膜修覆核酸如MG53核酸(例如SEQ ID NOS :2、4和6)中至少6個連續核苷酸的寡核苷酸或所述寡核苷酸的互補物。本發明還包括基本上純化的膜修復多肽，例如MG53多肽(SEQ ID NOS :1、3、5、7、8 和9-15)。在某些實施方式中，膜修復多肽例如MG53多肽包含與人MG53多肽(SEQ ID NO: 1)的胺基酸序列基本上相同的胺基酸序列。本發明還表徵了免疫選擇性結合於膜修復多肽例如MG53多肽或其片段、同系物、 類似物、假肽、肽模擬物或衍生物的抗體。另一方面，本發明包括藥物組合物，該藥物組合物包括治療或預防有效量的治療 劑和藥用載體。所述治療劑可以為核酸例如MG53核酸，如肽核酸、cDNA或RNA如小抑制性 RNA;膜修復多肽例如MG53;或特異於MG53多肽的抗體。在進一步方面，本發明包括在一個 或多個容器中的治療或預防有效量的該藥物組合物。在進一步方面，本發明包括一種通過在適於表達由DNA編碼的多肽的條件下培養 包含內源性或外源性表達的編碼膜修復多肽的核酸例如MG53核酸的細胞而生成多肽的方 法。如果需要，隨後可回收該多肽。在又一方面，本發明包括一種通過培養包含編碼膜修復多肽的內源性核酸(例如 MG53核酸，分布於外源性啟動子上遊或下遊)的細胞而生成多肽的方法。在某些實施方式 中，該外源性啟動子通過同源重組、鏈斷裂或錯配修復機制而整合入宿主細胞的基因組中。在另一個方面，本發明包括一種檢測樣品中膜修復多肽如MG53多肽存在的方法。 在該方法中，使樣品與適於在多肽與化合物之間形成複合物條件下選擇性結合於多肽的化 合物相接觸。如果存在，則檢測該複合物，從而鑑定樣品中的膜修復多肽例如MG53多肽。本發明還包括基於其表達編碼膜修復多肽的核酸例如MG53核酸、膜修復多肽或 其相關融合多肽而鑑定特殊細胞或組織類型的方法。例如，在某些實施方式中，本發明包括 含「標籤」或指示劑部分和膜修復多肽例如MG53部分的融合蛋白。在某些方面，該標籤或指 示劑部分可以為適合於純化目的的肽，例如FLAG標籤、6xHis標籤、麥芽糖結合蛋白(MBP) 標籤等。在其他方面，標籤肽包括適合於提供信號的肽，如抗體表位或螢光肽。其他的方 面還包括MG53與適合於介導亞細胞定位或跨細胞膜易位的肽的融合，例如來自HIV病毒的 TAT融合蛋白以促進細胞通透性或細胞定位改變的標籤以將MG53耦聯至特定細胞的細胞
ο本發明還包括一種檢測檢測樣品中本發明的核酸分子存在的方法，其中通過使樣 品與核酸探針或引物相接觸並檢測核酸探針或引物是否結合於樣品中編碼膜修復多肽的 核酸例如MG53核酸分子。在進一步方面，本發明提供一種通過使包括MG53多肽的細胞樣品與結合於MG53 多肽的化合物以足以調節所述多肽的活性的量接觸而調節膜修復多肽例如MG53多肽的活 性的方法。該化合物可以為例如小分子如核酸、肽、多肽、肽模擬物、碳水化合物、脂質或者 其他有機(含碳)或無機分子，如下文進一步描述的。本發明的治療劑在製備用於治療或預防疾病或症候群的藥物中的應用，也包括在 本發明的範圍之內，所述疾病或症候群包括例如心血管疾病、心肌病、動脈粥樣硬化、高血 壓、先天性心臟缺損、主動脈瓣狹窄、房間隔缺損(ASD)、房室(A-V)管缺損、動脈導管、肺 動脈狹窄、主動脈狹窄(subaortic stenosis)、室間隔缺損(VSD)、瓣膜病、高凝血症、血友病、潰瘍、創傷、損傷、割傷、擦傷、氧化性損傷、老年性組織變性、手術相關損傷、燒傷、肌肉 無力、肌肉萎縮、結締組織病、特發性血小板較少性紫癜、心臟衰竭、由心臟衰竭和高血壓引 起的繼發性病狀、低血壓、心絞痛、心肌梗塞、結節性硬化症、硬皮病、移植、自身免疫病、紅 斑狼瘡、病毒/細菌/寄生蟲感染、多發性硬化症、自身免疫病、過敏症、免疫缺陷、移植物 抗宿主病、哮喘、肺氣腫、ARDS、炎症和免疫應答的調節、病毒發病(viral pathogenesis), 老年病、Thl炎性疾病如類風溼性關節炎、多發性硬化症、炎性腸病、AIDS、創傷修復、心臟 病發作、心臟衰竭、肌肉營養不良、褥瘡、糖尿病性潰瘍、氧化性損傷，以及組織損傷如鼻竇 炎或黏膜炎、皺紋、溼疹或皮炎、皮膚乾燥、肥胖、糖尿病、內分泌疾病、厭食症、貪食症、腎 動脈狹窄、間質性腎炎、腎小球性腎炎、多囊性腎病、全身性腎小管性酸中毒(systemic， renal tubular acidosis) > IgA WW ι^ΙδΕ^ Lesch-NyhanVon
Hippel-Lindau (VHL)症候群、創傷、再生(體外和體內)、Hirschsprung病、Crohn病、闌尾 炎、子宮內膜異位症、喉炎、銀屑病、光化性角化病、痤瘡、毛髮生長/脫落、禿髮症、色素沉 著病、重症肌無力症、α-甘露糖苷貯積症、β-甘露糖苷貯積症、其他貯積病、過氧化物酶 體病如腦-肝-腎症候群(Zellweger syndrome)、嬰兒雷夫敘姆病、肢根軟骨發育不全(斑 點狀軟骨發育異常，肢根)、以及高哌啶酸血症、骨質疏鬆、肌肉疾病、尿瀦留、Albright遺 傳性骨發育不全症、潰瘍、阿爾茨海默氏病、中風、帕金森病、亨廷頓病、大腦性癱瘓、癲癇、 Lesch-Nyhan症候群、多發性硬化症、運動失調性毛細血管擴張症、行為失常、成癮性、焦慮、 疼痛、神經保護、中風、無晶狀體、神經變性疾病、神經系統疾病、發育性缺陷、與GRK2在大 腦內以及趨化因子受體調節中的作用相關的疾病、腦脊髓炎、焦慮、精神分裂症、躁狂憂鬱、 譫妄、痴呆、重度精神發育遲緩和運動障礙、Gilles de la Tourette症候群、腦白質營養不 良、癌症、乳腺癌、CNS癌、結腸癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、結腸癌、前列 腺癌、成神經細胞瘤和宮頸癌、新生物；腺癌、淋巴瘤；子宮癌、良性前列腺肥大、生育力、對 生長和發育/分化相關功能諸如但不限於成熟、泌乳和青春期、生殖功能障礙、和/或其他 類似病變和病症的控制。在某些實施方式中，本發明的治療性組合物包括例如編碼膜修復多肽的核酸， MG53核酸；結合編碼膜修復多肽的核酸的核酸；MG53編碼核酸；MG53多肽、基於其的肽類 似物、假肽或肽模擬物；膜修復多肽、MG53或膜修復多肽或MG53蛋白-蛋白相互作用的小 分子調節劑；或MG53特異性抗體或其生物活性衍生物或片段。如本文所述，MG53介導細胞 膜損傷的修復。因此，針對這些核酸、多肽和其同系物的表達和/或活性將提供一種與組織 修復相關的多種急性和慢性疾病和病症的新型治療。在某些其他方面，本發明包括用於治療或緩解組織損傷和/或與組織損傷相關病 症的方法，包括將有效量的本發明組合物給予需要其的受治療者。在某些實施方式中，本發 明包括用於治療組織損傷或創傷如割傷、擦傷、損傷、潰瘍、燒傷、褥瘡、齦疾病、黏膜炎等的 方法，包括將有效量的本發明治療性組合物給予需要其的受治療者。在其他的實施方式中，本發明包括作為手術佐劑有用的治療性組合物。在本文所 述的任何一個實施方式中，本發明的手術佐劑組合物可以作為一種獨立的治療劑直接地使 用或施加至手術部位，或者其可整體地與手術或醫療器械結合，例如本發明的治療劑可以 結合至(conjugate)基於聚合物的支架(stent)、管或其他可植入性設備，使得該治療劑以 可控方式彌散入作用部位，以加速癒合和/或將來自侵入性手術操作的創傷降到最低。在另一個實施方式中，本發明的治療性組合物作為例如醫療設備的膜或塗層而應用，使得該 治療劑彌散入血流或周圍組織和/或衰減，從而直接遞送至組織損傷部位；將由於應用手 術器具而導致的細胞損傷的量降到最低或有所緩解。在其他的實施方式中，本發明包括用於治療和/或預防作為衰老過程(例如，嫩 膚、退縮齦、骨退變、關節炎、阿爾茨海默氏病、帕金森等)的自然副作用而發生的組織修復 缺陷的方法。在該實施方式的某些方面中，本發明包括將有效量的本發明治療性組合物給 予患有組織修復能力、組織完整性、和/或組織彈性的老年性缺陷的受治療者。在某些實施 方式中，該老年性缺陷是皺紋、魚尾紋(crows feet)、面部線條、斑點(pot mark)、疤痕、類 纖維瘤、曬斑等中的至少一種或其組合。此外，由於內源性MG53基因表達的肌肉特異性特性，本發明包括用於治療和/或 預防任何類型的肌肉或脈管細胞/組織損傷例如由於心血管疾病如心肌梗塞而發生的組 織損傷；或強體力活動發生的損傷例如運動相關的損傷的方法，包括將有效量的本發明的 治療劑給予需要其的受治療者。在其他的實施方式中，本發明包括用於機體組織的修復、再生或恢復的化妝品組 合物，該化妝品組合物包含本發明的治療劑以及一種美容用適合的載體或賦形劑。在該實 施方式的一個方面，本發明包括一種改善皮膚外觀的方法，包括將有效量的本發明的治療 性組合物以化妝品形式給予受治療者。在本發明的任何方面，本發明的治療性組合物可以以任何藥用形式並通過任何藥 用途徑給予，例如該治療性組合物可以作為口服劑型(每天單次劑量或單元劑型)給予，用 於治療由於心肌梗塞、硬化性病灶(sclerotic lesion)引起的肌肉損傷，或由於運動相關 活動引起的肌肉撕裂，以促進受損肌肉組織的再生和修復。這些藥用載體和賦形劑以及給 藥方法對於本領域技術人員來說是顯而易見的，且包括USP_NF2008(美國藥典/國家藥品 集，其全部內容結合於此供參考)中描述的組合物和方法。術語「藥學或藥理學可接受的」指當給予動物或人時(視情況而定)不產生不良、 過敏或其他不適當反應的分子實體和組合物。如本文中使用的，「藥用載體」包括任何以及 所有溶劑、分散介質、塗層、抗細菌和抗真菌試劑、等張和延緩吸收試劑等。這些介質和試劑 用於藥物活性物質的用途在本領域中是總所周知的。除了在與活性成分不相容的任何常規 介質或試劑範圍內以外，還預期了其在治療性組合物中的應用。還可以將補充活性成分摻 入組合物中。通常將活性化合物配製用於腸外給藥，例如配製用於通過靜脈內、關節內、鞘內、 肌內、皮下、病灶內或甚至腹膜內途徑進行注射。根據本發明披露內容，對於本領域技術人 員來說，製備包含癌標誌物抗體、結合物、抑制劑或其他作為活性組分或成分的試劑的水性 組合物將是已知的。典型地，這樣的組合物可以製備成注射劑、作為液態溶液或懸浮液；還 可以製備成適合用來在注射前加入液體後製備溶液或懸浮液的固態形式；還可以將該製劑 乳化。此外，本發明涉及核酸(包括幹擾性核酸)、和編碼膜修復相互作用蛋白和/或 MG53相互作用蛋白的多肽、及其同系物；假肽和肽模擬物；以及可調節膜修復多肽或MG53 的活性或其分子間相互作用的化合物。例如，本發明的組合物具有用於治療患有上文所披露的疾病和病症和/或其他類似病狀和病症的受治療者的效果。該多肽可以用作生成特異於本發明的抗體的免疫原以及 用作疫苗。它們還可以用來篩選可能的激動劑和拮抗劑化合物。此外，當給予需要其的受 治療者時，編碼本發明膜修復多肽如MG53的cDNA可能在基因治療方面是有用的。通過非 限制性實例，本發明的組合物將具有用於治療患有上文所披露的疾病和病症和/或其他類 似症狀和病症的受治療者的效果。本發明進一步包括一種用於篩選病症或症候群的調節劑的方法，該病症或症候群 包括例如上文所披露疾病和病症和/或其他類似的病狀和病症。該方法包括使測試化合物 與膜修復多肽例如MG53多肽相接觸，並測定該測試化合物是否結合於所述膜修復多肽或 MG53多肽。測試化合物與膜修復多肽或MG53多肽的結合表示該測試化合物是一種活性調 節劑，或對於上述病症或症候群的潛伏期或誘因(predisposition)的調節劑。也在本發明的範圍之內的是一種用於篩選活性調節劑，或對於包括例如上文所披 露的疾病和病症和/或其他類似症狀和病症的病症或症候群的潛伏期或誘因的調節劑的 方法，該方法通過將測試化合物給予對於上述病症或症候群處於增加風險的測試動物。該 測試動物表達由本發明的核酸編碼的重組多肽。隨後檢測測試動物內本發明多肽的表達或 活性以及對照動物內蛋白的表達或活性，所述對照動物重組性表達本發明的多肽，但對於 該病症或症候群沒有增加的風險。接下來，比較測試動物和對照動物內本發明多肽的表達。 該多肽在測試動物內相對於對照動物內的活性變化表示該測試化合物是該病症或症候群 潛伏期的調節劑。在又一個方面，本發明包括一種用於測定受治療者(例如人受治療者)中與膜修 復多肽或編碼該膜修復多肽的核酸(例如MG53多肽，MG53核酸，或二者)水平改變相關的 疾病的存在或對於所述疾病的誘因的存在的方法。該方法包括檢測來自受治療者的測試樣 品內膜修復多肽的量以及比較測試樣品內該多肽的量以及對照樣品內存在的膜修復多肽 的量。如與對照樣品相比較，測試樣品內該膜修復多肽水平的改變表示受治療者中疾病的 存在或對於該疾病的誘因存在。優選地，所述誘因包括例如上文披露的疾病和病症和/或 其他類似病狀和病症。而且，本發明新的多肽的表達水平也可用於一種篩查多種病症以及 測定特定病症階段的方法中。在進一步方面，本發明包括一種治療或預防與哺乳動物內病症相關的病理狀態的 方法，其中通過將膜修復多肽、編碼膜修復多肽的核酸、或膜修復多肽特異性抗體以足以減 輕或預防該病理狀態的量給予受治療者(例如人受治療者)。在優選的實施方式中，所述病 症包括例如上文披露的疾病和病症和/或其他類似的病狀和病症。在又一個方面，本發明可以通過本領域中通常採用的多種技術中任何一種用於等 同於本發明的細胞受體和下遊效應子的方法中。這些方法包括但不限於雙雜交系統、親和 純化、與抗體或其他特異性相互作用分子的共沉澱。如本文中使用的，術語「膜修復多肽拮抗劑」或「MG53拮抗劑」或「膜修復多肽的 拮抗劑」或「MG53的拮抗劑」通常用來指一種能夠直接或間接抑制膜修復多肽例如MG53表 達、翻譯和/或活性的試劑。此外，如本文中使用的，「膜修復多肽受體」或「MG53受體」通 常涉及能夠經受結合於MG53蛋白的任何蛋白或其片段。在某些方面，膜修復多肽例如MG53活性的調節通過例如下述來實現，採用或調節 膜修復多肽如MG53結合伴侶，即結合於膜修復多肽如MG53並中和其生物學活性如中和抗MG53、膜修復多肽如MG53受體(如，或者小窩蛋白_3)、膜修復多肽如MG53受體片段、以及 膜修復多肽如MG53受體類似物的因子；採用結合併破壞膜修復多肽-受體相互作用的膜修 復多肽如MG53受體拮抗劑如抗小窩蛋白_3抗體、假肽、肽類似物或肽模擬物；抑制膜修復 多肽活性或分子間相互作用、或改變膜修復多肽正常構型、或抑制產生性膜修復多肽/膜 修復多肽_受體結合的小分子；或採用源自膜修復多肽基因和/或膜修復多肽受體基因的 核苷酸序列，包括編碼、非編碼、和/或調節性序列，以通過例如反義、核酶、和/或三鏈螺旋 法阻礙或減少膜修復多肽表達。 在另一個方面，本發明表徵一種核酸分子例如誘餌RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、微小 RNA、適配體(aptamer)、反義核酸分子，其下調編碼膜修復多肽、MG53蛋白、膜修復多肽結 合蛋白、MG53結合蛋白、膜修復多肽受體和/或MG53受體如小窩蛋白_3的序列的表達。在 另一個實施方式中，修改本發明的核酸分子以治療和/或預防組織損傷並促進組織修復。 在另一個實施方式中，本發明的核酸分子具有內切核酸酶活性，且是核酸酶複合體的一個 組分，並且切割具有膜修復多肽核酸序列或膜修復多肽受體核酸序列的RNA。在一個實施方式中，本發明的核酸分子包含在12至100個之間的互補於具有膜修 復或膜修復受體核酸序列的RNA的鹼基。在另一個實施方式中，本發明的核酸分子包含在 14至24個之間的互補於具有膜修復或膜修復受體核酸序列的RNA的鹼基。在本文描述的 任何一個實施方式中，該核酸分子可以按照本領域中熟知的方法進行化學合成。在另一個方面，本發明提供一種試劑盒，該試劑盒包括一種適合的容器，以藥用形 式設置於該容器中的能夠抑制膜修復多肽活性、表達或結合的活性劑，以及其使用的說明 書。在另一個方面，本發明涉及一種用於診斷或監測病症或疾病或發展的方法，包括 通過檢測膜修復或膜修復受體基因或蛋白或二者的表達水平來檢測與該疾病相關的膜修 復基因例如MG53基因中核苷酸多態性的存在。已經鑑定了與疾病嚴重性相關的多態性(參見，Zhong et al.，Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor gene by thin—film biosensor chips and application to rural field studies. Nucleic Acids Res. 2005 Aug 2 ；33 (13) :el21 ;Donn et al., A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2004 May ；50 (5) 1604-10, all of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.，出於所有目的將其全部內容結合於此供參考)。如本文中 使用的，「膜修復多肽」或「膜修復多肽受體基因」或「MG53或MG53受體基因」或「MG53或 MG53受體基因」包括5，UTR,3' UTR、啟動子序列、增強子序列、基因的內含子和外顯子DNA 以及mRNA或cDNA序列。如本領域普通技術人員所能理解的，與組織修復病症相關的MG53或MG53受體基 因多態性(因此根據本發明的方法用作診斷標誌物)可以在之前指出的的任何一個核酸區 域中出現。用於鑑定和檢測多態性的技術在本領域中是已知的，並在Wohlgemuth的美國專 利第6，905，827號中被詳細討論，出於所有目的將其全部內容結合於此供參考。本發明的某些方面包括利用一種或多種DNA分子檢測基因表達或多態性的方法，其中一種或多種DNA分子具有檢測與序列表中描述的寡核苷酸對應的基因表達的核苷酸 序列。在一種形式中，寡核苷酸檢測差異表達的基因的表達。該基因表達系統可以為候選 庫、診斷試劑、診斷性寡核苷酸組或診斷性探針組。DNA分子可以為基因組DNA、RNA、蛋白核 酸(PNA)、cDNA或合成的寡核苷酸。按照本文教導的步驟，本領域技術人員可以鑑定用於分 析基因表達或多態性的感興趣序列。這樣的序列可以預測疾病狀態。本發明的診斷性寡核苷酸如本文中使用的，術語「核酸分子」用來包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、 RNA分子(例如mRNA)、利用核苷酸類似物及其衍生物、片段和同系物生成的DNA或RNA類 似物。核酸分子可以為單鏈或雙鏈，但優選為包含雙鏈DNA。在某些方面，本發明涉及診斷性寡核苷酸和診斷性寡核苷酸組，對其而言，個體健 康狀態與該個體對應於核苷酸序列的RNA或蛋白產物的表達之間存在關聯性。在某些情 況下，僅一種寡核苷酸對於這種檢測是必需的。診斷性寡核苷酸組的成員可以通過能夠檢 測RNA或蛋白產物表達或多態性的任何方式進行鑑定，包括但不限於差異表達篩選、PCR、 RT-PCR、SAGE分析、高通量測序、微陣列、液體或其他陣列、基於蛋白的方法(例如，蛋白質 印跡、蛋白質組學、質譜分析、和本文中描述的其他方法)、以及數據挖掘方法，如本文進一 步描述的。在本發明的上下文中，核酸和/或蛋白可按照熟知的分子生物學技術進行處 理。在例如Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology(supplemented through 2000)John Wiley & Sons,New York (〃 Ausubel" ) ；Sambrook et al. Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989( " Sambrook "),禾口 Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. (" Berger")中描述了多種這些方法的詳細規程。下文對不同方面和實施方式的描述參照本發明的示例性核酸而提供。然而，不同 方面和實施方式也針對編碼其他膜修復蛋白、膜修復多肽結合蛋白、和膜修復多肽受體基 因的同系物、直系同源和旁系同源的基因，且包括所有的異構體、剪切變異體和多態性。可 利用所述用於膜修復多肽、MG53蛋白、膜修復多肽結合蛋白、MG53結合蛋白、膜修復多肽受 體和/或MG53受體基因的方法分析那些另外的基因的靶位點。因此，其他基因的抑制以及 這樣的抑制效果可以如本文所描述的而實施。「下調」是指基因的表達、或者RNA或編碼一種或多種蛋白的等效RNA的水平、或者 一種或多種蛋白如膜修復多肽和膜修復多肽受體基因的活性降低至在本發明的核酸分子 不存在的情況下觀察到表達、水平或活性以下。在一個實施方式中，利用酶性核酸分子進行 抑制或下調優選低於在酶失活或減弱分子存在的情況下觀察到的水平，該分子能夠結合於 靶RNA上相同的位點但不能切割該RNA。在另一個實施方式中，用反義寡核苷酸進行抑制或 下調優選低於在例如具有錯亂序列或具有錯配的寡核苷酸存在的情況下觀察到的水平。在 另一個實施方式中，在核酸分子存在的情況下，利用本發明核酸分子對膜修復多肽、膜修復 多肽結合蛋白、和膜修復多肽受體基因的抑制或下調高於其核酸分子不存在的情況。「上調」是指基因的表達、或者RNA或編碼一種或多種蛋白亞單位的等效RNA的水 平、或者一個或多個蛋白亞單位如膜修復多肽、膜修復多肽結合蛋白、和膜修復多肽受體基因的活性高於本發明的核酸分子不存在的情況下觀察到的表達、水平或活性。例如，可以增 加諸如膜修復多肽、膜修復多肽結合蛋白、和膜修復多肽受體基因的基因的表達以便治療、 預防、改善或調節由於基因表達缺失或水平較低引起或加劇的病理狀態。在一個實施方式 中，本發明涉及一種通過上調膜修復多肽、膜修復多肽結合蛋白、和膜修復多肽受體基因的 表達、釋放、和/或活性來用於治療或預防膀胱過度活動症的方法。「調節」是指上調或下調基因的表達、或者RNA或編碼一種或多種蛋白的等效RNA 的水平、或者一種或多種蛋白的活性，使得表達、水平或活性高於或低於本發明的核酸分子 不存在情況下觀察到的表達、水平或活性。「基因」是指編碼RNA的核酸，例如包括但不限於編碼多肽的節段的核酸序列。「互補性」是指通過常規Watson-Crick或其他非常規類型核酸與另一個RNA序列 形成氫鍵的能力。「RNA」是指包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。「核糖核苷酸」或「2' -0H」是 指在D呋喃核糖部分的2'位處具有羥基的核苷酸。「核苷酸」是指在與磷酸化蔗糖的N-糖苷鍵合中的雜環含氮鹼基。本領域中認為 核苷酸包括天然鹼基(標準的)、以及本領域中熟知的修飾鹼基。這樣的鹼基通常定位於 核苷酸糖部分的1'位。核苷酸通常包括一個鹼基、糖、和一個磷酸鹽(或酯)基團。核苷 酸在糖、磷酸鹽(或酯)和/或鹼基部分可以為非修飾或修飾的，(也可互換稱為核苷酸 類似物、修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標準核苷酸等；參見例如Usman and McSwiggen, supra ；Eckstein et al.，國際 PCT
發明者蔡傳喜, 諾厄·魏斯勒德, 麻建傑 申請人:新澤西醫科和牙科大學