一種參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法與流程

2023-07-23 01:46:26 4

本發明涉及藥物質量控制
技術領域：
，特別涉及一種參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法。
背景技術：
：參蘇製劑由黨參、紫蘇葉、葛根、前胡、茯苓、半夏(制)、陳皮、枳殼(炒)、桔梗、甘草、木香、生薑、大棗十三味藥材組成。該方具有益氣解表、祛痰止咳的功效，主要用於治療體虛感冒、風寒感冒、惡寒發熱、頭痛鼻塞、咳嗽多痰。參蘇飲出自宋代的《太平惠民和劑局方》，臨床應用較為廣泛。現有技術中，根據參蘇中藥方，已製得多種劑型的參蘇製劑，市場上參蘇製劑主要有口服液、丸劑、片劑、膠囊劑等。通常的製備工藝為：將原料藥材碎斷後，按現有常規方法製成口服液、丸劑、片劑或膠囊劑。參蘇製劑作為中成藥，其藥效是多種活性成分共同作用的結果。但目前參蘇製劑現有的質量標準僅測定單一指標成分葛根素的含量，未對其他有效成分進行監測，存在一定局限性，不能全面反映參蘇製劑的質量水平。針對參蘇製劑的質量檢測方法的公開專利只有一個，中國專利200810069061.8(公開號CN101474274A)，僅採用HPLC法控制其葛根素與橙皮苷的含量。針對參蘇製劑的質量檢測方法如下，《湖南中醫藥導報》2003年4月第9卷第4期《參蘇口服液的質量標準研究》、《中國醫藥導刊》2009年第11卷第9期《參蘇感冒片質量標準研究》、《中國實驗方劑學雜誌》2008年3月第14卷第3期《參蘇感冒片質量標準研究》等文章中記載了一種測定參蘇製劑中葛根素的含量的HPLC方法；《西北藥學雜誌》2014年5月第29卷第3期《提高參蘇丸質量標準的研究》記載了一種測定參蘇丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素的含量的HPLC方法；《中國藥房》2007年第18卷第18期《HPLC法測定參蘇丸中橙皮苷的含量》記載了一種測定參蘇丸中橙皮苷的含量的HPLC方法。現有技術中，尚無較全面的質量控制方法反映現有中藥材、中間體及成品的質量狀況，也無法對生產過程及產品質量有效控制，不能較好地保證其臨床療效。因此，建立參蘇製劑的質量檢測方法具有非常重要的意義。技術實現要素：有鑑於此，本發明提供了一種參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法。該參蘇製劑指紋圖譜檢測方法的建立有利於對其原料藥材、中間體及其終產品有效成分質量的有效控制及保證其臨床療效。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種參蘇製劑的檢測方法，包括如下步驟：將參蘇製劑製成供試品溶液，葛根素作為對照品，採用高效液相色譜法檢測獲到參蘇製劑的檢測結果，色譜條件為：色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為流動相A與流動相B組成的梯度洗脫液，流動相A為乙腈，流動相B為磷酸溶液，採用梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：作為優選，高效液相色譜的檢測波長為260～300nm。在本發明提供的一些實施例中，高效液相色譜的檢測波長為283nm。在本發明提供的另一些實施例中，高效液相色譜的檢測波長為260nm。在本發明提供的另一些實施例中，高效液相色譜的檢測波長為300nm。作為優選，磷酸溶液中磷酸的體積百分含量為0.05％～0.1％。在本發明提供的一些實施例中，磷酸溶液中磷酸的體積百分含量為0.05％。在本發明提供的另一些實施例中，磷酸溶液中磷酸的體積百分含量為0.1％。作為優選，高效液相色譜的柱溫為25℃～40℃。在本發明提供的一些實施例中，高效液相色譜的柱溫為30℃。在本發明提供的另一些實施例中，高效液相色譜的柱溫為25℃。在本發明提供的另一些實施例中，高效液相色譜的柱溫為40℃。作為優選，流動相的流速0.8～1.2mL/min。在本發明提供的一些實施例中，流動相的流速1.0mL/min。在本發明提供的另一些實施例中，流動相的流速0.8mL/min。在本發明提供的另一些實施例中，流動相的流速1.2mL/min。在本發明提供的一些實施例中，供試品溶液的進樣量為10μL。作為優選，色譜柱為UnitaryC18(5μm，4.6×250mm)，ThermoSyncronis-C18(5μm，4.6×250mm)，島津InertsilODS-2(5μm，4.6×250mm)。在本發明提供的一些實施例中，參蘇製劑為口服液，供試品溶液的製備方法採用直接稀釋的方法；參蘇製劑為丸劑、片劑或膠囊劑，供試品溶液的製備方法採用回流提取的方法。在本發明提供的一些實施例中，供試品溶液的製備方法為：取參蘇製劑，加甲醇或乙醇，採用加熱回流方法提取，用微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。作為優選，回流提取的溶劑為0％～50％甲醇或0％～50％乙醇。在本發明提供的一些實施例中，對照品的製備方法為：將葛根素溶解於50％～100％甲醇，製成對照品。作為優選，高效液相色譜的分析時間不低於60min。本發明還提供了一種參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法，其檢測方法包括如下步驟：將參蘇製劑製成供試品溶液，葛根素作為對照品，採用高效液相色譜法檢測，標定共有峰，獲到參蘇製劑指紋圖譜，色譜條件為：色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為流動相A與流動相B組成的梯度洗脫液，流動相A為乙腈，流動相B為磷酸溶液，採用梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：本發明指紋圖譜依據所得的10批參蘇中間體及其製劑的指紋圖譜，制定標準指紋圖譜；其中標準指紋圖譜具有12個共有峰，其中2號峰為5-乙氧基甲基糠醛，4號峰為葛根素，10號峰為柚皮苷，11號峰為橙皮苷，12號峰為新橙皮苷。本發明中，參蘇指紋圖譜與制定的標準指紋圖譜進行比對，其相似度為0.830～1.000，共有峰有12個，共有峰峰面積總和佔總峰面積的90％以上，以4號峰葛根素為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積。作為優選，各峰的相對保留時間分別為：(1)0.184～0.214、(2)0.500～0.561、(3)0.775～0.863、(S)1.000、(5)1.015～1.124、(6)1.047～1.162、(7)1.252～1.392、(8)1.689～1.879、(9)1.733～1.929、(10)1.808～2.014、(11)1.858～2.070、(12)1.929～2.151；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.027～0.117、(2)0.015～0.654、(3)0.177～0.392、(S)1.000、(5)0.131～0.285、(6)0.166～0.248、(7)0.144～0.332、(8)0.034～0.204、(9)0.115～0.669、(10)0.134～2.843、(11)0.296～1.378、(12)0.090～1.170。優選地，各峰的相對保留時間分別為：(1)0.194～0.203、(2)0.527～0.534、(3)0.816～0.821、(S)1.000、(5)1.069～1.070、(6)1.103～1.106、(7)1.318～1.325、(8)1.778～1.789、(9)1.825～1.837、(10)1.904～1.918、(11)1.956～1.971、(12)2.031～2.048；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.029～0.111、(2)0.016～0.622、(3)0.187～0.373、(S)1.000、(5)0.138～0.271、(6)0.175～0.236、(7)0.152～0.316、(8)0.036～0.194、(9)0.122～0.637、(10)0.141～2.707、(11)0.312～1.312、(12)0.095～1.114。作為優選，高效液相色譜的檢測波長為260～300nm。作為優選，磷酸溶液中磷酸的體積百分含量為0.05％～0.1％。優選地，磷酸溶液中磷酸的體積百分含量為0.05％。作為優選，高效液相色譜的柱溫為25℃～40℃。作為優選，流動相的流速0.8～1.2mL/min。優選地，流動相的流速1.0mL/min。作為優選，供試品溶液的進樣量為10μL。在本發明提供的一些實施例中，參蘇製劑為口服液，供試品溶液的製備方法採用直接稀釋的方法；參蘇製劑為丸劑、片劑或膠囊劑，供試品溶液的製備方法採用回流提取的方法。在本發明提供的一些實施例中，回流提取的溶劑為0％～50％甲醇或0％～50％乙醇。在本發明提供的一些實施例中，對照品的製備方法為：將葛根素溶解於50％～100％甲醇，製成對照品。作為優選，高效液相色譜的分析時間不低於60min。本發明提供了一種參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法。該參蘇製劑指紋圖譜檢測方法包括：將參蘇製劑製成供試品溶液，葛根素作為對照品，採用高效液相色譜法檢測，標定共有峰，獲到參蘇製劑的指紋圖譜，色譜條件為：色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為流動相A與流動相B組成的梯度洗脫液，流動相A為乙腈，流動相B為磷酸溶液，採用梯度洗脫。與現有技術相比，本發明的有益效果是：(1)本發明參蘇製劑的指紋圖譜檢測方法對各供試品的前處理方法簡單，特徵性成分保留完整，且供試品溶液穩定性良好；(2)該高效液相色譜方法的精密度較高、重現性良好，分析時間較短，具有一定的專屬性；所得指紋圖譜中各特徵峰分離效果較好，且參蘇製劑指紋圖譜和中間體指紋圖譜具有較好的相關性；(3)本發明所建立的標準指紋圖譜有12個共有峰，信息量較大，明確了5個指標成份，較完整的保留了供試液中的化學成分；(4)本發明指認了5個特徵峰，經比較採用保留時間適中，分離度較好，峰面積較大的葛根素對照品作為參照峰；(5)參蘇製劑中間體指紋圖譜的應用可增加參蘇製劑生產過程的可控 性，參蘇製劑指紋圖譜的應用則有利於保證參蘇製劑的有效成分質量穩定和臨床療效，本發明提供的方法有利地保障了從原料到終端製劑的全程質量控制。附圖說明圖1檢測波長3D圖；圖2對照品色譜圖；圖3為參蘇製劑標準指紋圖譜；圖4為10批參蘇製劑指紋圖譜；圖5為參蘇製劑中間體標準指紋圖譜；圖6為10批參蘇製劑中間體指紋圖譜；圖7為參蘇膠囊標準指紋圖譜；圖8為10批參蘇膠囊指紋圖譜；圖9為參蘇片標準指紋圖譜；圖10為10批參蘇片指紋圖譜；圖11為參蘇丸標準指紋圖譜；圖12為10批參蘇丸標準指紋圖譜；圖13為參蘇中間體及其製劑指紋圖譜各成分峰歸屬圖譜；圖14為參蘇製劑共有峰圖譜。具體實施方式本發明公開了一種參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法中所用藥物、試劑、儀器均可由市場購得。本發明藥材、藥品的來源及對照品來源如下：黨參藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505016)；紫蘇葉藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505006)；葛根藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505007)；前胡藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505008)；茯苓藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505014)；半夏(制)藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505009)；陳皮藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：ZY1406025)；枳殼(炒)藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505010)；桔梗藥材(廠家：湖南柳紅藥業有限公司、批號：YP1505006)；甘草藥材(廠家：湖南柳紅藥業有限公司、批號：ZY1401003)；木香藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505012)；生薑藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：ZY1505013)；大棗藥材(廠家：湖南天宏藥業有限公司、批號：YP1505011)；天然澄清劑A組份(廠家：天津天成科技有限公司、批號：20150428)；天然澄清劑B組份(廠家：天津天成科技有限公司、批號：20150428)；山梨酸鉀(廠家：湖南爾康製藥、批號：1054-20150201)；山梨酸鉀對照品(中國藥品生物製品檢定研究所、批號：101075-200901)；葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院、)；5-乙氧基家基糠醛對照品(中國食品藥品檢定研究院、)；橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院、)；柚皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院、)；新橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院、)；參蘇口服液(湖南康壽製藥有限公司，批號為20130406、20131101、20141205、20141011、20140101、20140709、20140606、150601、150301、150108)；參蘇丸劑(湖南時代陽光藥業股份有限公司，批號為20120111、20141214，其餘8批為實驗室自製)、參蘇片劑、膠囊劑(實驗室自製)；參蘇中間體(湖南康壽製藥有限公司，150601)。本發明自製的參蘇製劑主要由下述重量份數的原藥材製得：90份黨參、90份紫蘇葉、90份葛根、90份前胡、90份茯苓、90份半夏(制)、60份陳皮、60份枳殼(炒)、60份桔梗、60份甘草、60份木香、36份生薑、36份大棗。參蘇製劑為由下述方法製得的參蘇製劑：1、參蘇製劑為口服液時，半夏用70％乙醇滲漉提取。紫蘇葉、陳皮、枳殼、木香、生薑提取揮髮油3小時，備用；藥渣再加水煎煮0.5小時，合併所得 濾液，備用。黨參、葛根、前胡、茯苓、桔梗、甘草、大棗加水80～90℃動態提取2小時，濾液備用。將以上水煎液合併，濃縮，加入ZTC1+1天然澄清劑，加入乙醇至含醇量為30％，冷藏過夜，醇沉濾液與半夏滲漉液合併，回收乙醇，所得藥液與揮髮油，混勻，加水至1000ml即得。2、參蘇製劑為丸劑、片劑、膠囊劑時，將原藥材碎斷後，按現有常規方法製成丸劑、片劑、膠囊劑。參蘇製劑為口服液時，混勻，量取1.0～5.0ml；所述的製劑為丸劑、片劑、膠囊劑時，稱取粉末7～9g。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1參蘇製劑指紋圖譜的檢測方法參蘇製劑的檢測方法，包括如下步驟：(a)對照品溶液的製備：稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加50％～100％甲醇溶解並定容至刻度，搖勻，製成對照品溶液；(b)供試品溶液的製備：取參蘇製劑，加0％～50％甲醇或0％～50％乙醇25～125mL，採用常規方法提取，用微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液；(c)色譜條件：色譜柱為C18反相色譜柱；採用梯度洗脫，流動相為流動相A與流動相B組成的梯度洗脫液，流動相A為乙腈，流動相B為0.05～0.1％磷酸溶液；檢測波長為260～300nm，見圖1；柱溫25℃～40℃；流速0.8mL/min～1.2mL/min；分析時間60min。洗脫梯度如表1所示。表1梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.05～0.1％磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(d)測定：精密吸取對照品溶液與供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，通過相似度軟體控制共有峰，得到指紋圖譜。實施例2參蘇製劑口服液指紋圖譜的建立(1)儀器與試藥安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。(2)色譜條件色譜柱為ThermoSyncronis-C18(5μm，4.6×250mm)反相色譜柱；柱溫為25℃；檢測波長為285nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.08％磷酸溶液，總流速為1.0mL/min；分析時間60分鐘；洗脫梯度如表2所示。表2梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.05％磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(3)對照品溶液的製備稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋製成每1mL含0.08mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。見圖2。(4)供試品溶液的製備取參蘇口服液5支，混勻，精密量取5mL於50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得參蘇口服液供試品溶液。(5)分析時間在上述色譜條件下進樣考察120分鐘，結果表明，在60分鐘內，樣品中所有峰均可被完全洗脫出，故分析時間確定為60分鐘。(6)方法學考察①穩定性試驗取同一供試品溶液，在上述液相色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24小時進行檢測，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明供試品溶液24小時內較穩定。②精密度試驗取同一份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，重複進樣6次，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明儀器精密度良好。③重複性試驗取同一批樣品，按供試品製備方法製備6份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，進樣分析，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明該方法重複性好。(7)參蘇口服液標準指紋圖譜的制定精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；依據所得的10批參蘇口服液的指紋圖譜，制定標準指紋圖譜。見圖3、4。比較參蘇口服液色譜圖，確定13個峰為共有峰，其中4號峰為葛根素峰，依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》，制定參蘇口服液的標準指紋圖譜。以葛根素峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰的相對保留時間分別為：(1)0.194～0.200、(2)0.527～0.530、(3)0.816～0.818、(S)1.000、(5)1.069～1.070、(6)1.104～1.106、(7)1.318～1.325、(8)1.629～1.638、(9)1.778～1.789、(10)1.825～1.836、(11)1.904～1.915、(12)1.956～1.968、(13)2.031～2.044；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.029～0.086、(2)0.016～0.381、(3)0.187～0.373、(S)1.000、(5)0.138～0.187、(6)0.175～0.214、(7)0.225～0.316、(8)1.656～5.306、(9)0.04～0.194、(10)0.158～0.637、(11)0.141～2.707、(12)0.312～1.312、(13)0.095～1.114。(8)相似度評價。表310批參蘇口服液HPLC指紋圖譜相似度評價結果表樣品編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照圖譜S11.0000.9880.9790.9760.9780.9400.8900.8970.9350.9470.976S20.9881.0000.9940.9520.9600.9400.8700.8610.9640.9250.970S30.9790.9941.0000.9340.9440.9250.8450.8300.9630.9040.956S40.9760.9520.9341.0000.9960.9710.9470.9560.9210.9800.988S50.9780.9600.9440.9961.0000.9800.9600.9620.9420.9890.996S60.9400.9400.9250.9710.9801.0000.9660.9410.9670.9710.988S70.8900.8700.8450.9470.9600.9661.0000.9870.8990.9840.961S80.8970.8610.8300.9560.9620.9410.9871.0000.8580.9840.952S90.9350.9640.9630.9210.9420.9670.8990.8581.0000.9200.965S100.9470.9250.9040.9800.9890.9710.9840.9840.9201.0000.986對照圖譜0.9760.9700.9560.9880.9960.9880.9610.9520.9650.9861.000實施例3參蘇製劑中間體指紋圖譜的建立(1)儀器與試藥安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。(2)色譜條件色譜柱為ThermoSyncronis-C18(5μm，4.6×250mm)反相色譜柱；柱溫為30℃；檢測波長為283nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.05％磷酸溶液，總流速為1.0mL/min；分析時間60分鐘；洗脫梯度如表4所示。表4梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.05％磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(3)對照品溶液的製備稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋製成每1mL含0.08mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。(4)供試品溶液的製備精密量取參蘇製劑中間體1mL於10mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得參蘇製劑中間體供試品溶液。(5)方法學考察①穩定性試驗取同一供試品溶液，在上述液相色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24小時進行檢測，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明供試品溶液24小時內較穩定。②精密度試驗取同一份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，重複進樣6次，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明儀器精密度良好。③重複性試驗取同一批樣品，按供試品製備方法製備6份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，進樣分析，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明該方法重複性好。(6)參蘇製劑中間體標準指紋圖譜的制定。精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；依據所得的10批參蘇製劑中間體的指紋圖譜，制定標準指紋圖譜。見圖5、6。比較參蘇製劑中間體色譜圖，確定12個峰為共有峰，其中4號峰為葛根素峰，依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》，制定參蘇製劑中間體的標準指紋圖譜。以葛根素峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰的相對保留時間分別為：(1)0.192～0.195、(2)0.528～0.530、(3) 0.816～0.817、(S)1.000、(5)1.067～1.069、(6)1.103～1.100、(7)1.317～1.321、(8)1.777～1.784、(9)1.821～1.832、(10)1.901～1.914、(11)1.957～1.964、(12)2.034～2.045；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.020～0.084、(2)0.018～0.102、(3)0.185～0.247、(S)1.000、(5)0.148～0.197、(6)0.169～0.221、(7)0.204～0.306、(8)0.06～0.104、(9)0.168～0.638、(10)0.154～0.547、(11)0.642～0.804、(12)1.041～1.104。(7)相似度評價。表510批參蘇製劑中間體HPLC指紋圖譜相似度評價結果表樣品編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照圖譜S11.0000.9460.9420.9660.9280.9580.8830.8730.9280.8830.956S20.9461.0000.9890.9810.9760.9860.9150.9690.9760.9150.984S30.9420.9891.0000.9950.9970.9720.9610.9590.9970.9610.997S40.9660.9810.9951.0000.9930.9710.9640.9380.9930.9640.998S50.9280.9760.9970.9931.0000.9560.9770.9481.0000.9770.995S60.9580.9860.9720.9710.9561.0000.9050.9730.9560.9050.978S70.8830.9150.9610.9640.9770.9051.0000.9060.9771.0000.968S80.8730.9690.9590.9380.9480.9730.9061.0000.9480.9060.957S90.9280.9760.9970.9931.0000.9560.9770.9481.0000.9770.995S100.8830.9150.9610.9640.9770.9051.0000.9060.9771.0000.968對照圖譜0.9560.9840.9970.9980.9950.9780.9680.9570.9950.9681.000實施例4參蘇製劑指紋圖譜的建立(以參蘇製劑膠囊劑為例)(1)儀器與試藥安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。(2)色譜條件色譜柱為ThermoSyncronis-C18(5μm，4.6×250mm)反相色譜柱；柱溫為25℃；檢測波長為300nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸溶液，總流速為0.8mL/min；分析時間60分鐘；洗脫梯度如表6所示。表6梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.10磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(3)對照品溶液的製備稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋製成每1mL含0.08mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。(4)供試品溶液的製備取參蘇膠囊粉末7g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水100mL，密塞，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得參蘇膠囊供試品溶液。(5)方法學考察①穩定性試驗取同一供試品溶液，在上述液相色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24小時進行檢測，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明供試品溶液24小時內較穩定。②精密度試驗取同一份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，重複進樣6次，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明儀器精密度良好。③重複性試驗取同一批樣品，按供試品製備方法製備6份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，進樣分析，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明該方法重複性好。(6)參蘇製劑指紋圖譜的制定。精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；依據所得的10批參蘇製劑的指紋圖譜，制定標準指紋圖譜。見圖7、8。比較參蘇膠囊劑色譜圖，確定12個峰為共有峰，其中4號峰為葛根素峰，依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》，制定參蘇膠囊劑的標準指紋圖譜。以葛根素峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰的相對保留時間分別為：(1)0.200～0.203、(2)0.532～0.534、(3)0.819～0.821(S)1.000、(5)1.069～1.07、(6)1.103～1.104、(7)1.322～1.324、(8)1.785～1.789、(9)1.833～1.837、(10)1.913～1.918、(11)1.965～1.971、(12)2.042～2.048；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.038～0.111、(2)0.081～0.622、(3)0.254～0.295、(S)1.000、(5)0.23～0.271、(6)0.217～0.236、(7)0.152～0.195、(8)0.036～0.121、(9)0.122～0.519、(10)0.812～2.304、(11)0.567～0.974、(12)0.206～0.557。(7)相似度評價。表710批參蘇膠囊劑HPLC指紋圖譜相似度評價結果表樣品編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照圖譜S11.0000.9970.9970.9610.9720.9950.9421.0000.9720.9590.996S20.9971.0001.0000.9770.9560.9930.9280.9970.9560.9480.992S30.9971.0001.0000.9770.9560.9930.9280.9970.9560.9480.992S40.9610.9770.9771.0000.9050.9640.8830.9610.9050.9060.960S50.9720.9560.9560.9051.0000.9710.9580.9721.0000.9730.984S60.9950.9930.9930.9640.9711.0000.9660.9950.9710.9380.997S70.9420.9280.9280.8830.9580.9661.0000.9420.9580.8730.961S81.0000.9970.9970.9610.9720.9950.9421.0000.9720.9590.996S90.9720.9560.9560.9051.0000.9710.9580.9721.0000.9730.984S100.9590.9480.9480.9060.9730.9380.8730.9590.9731.0000.960對照圖譜0.9960.9920.9920.9600.9840.9970.9610.9960.9840.9601.000實施例5參蘇製劑指紋圖譜的建立(以參蘇片劑為例)(1)儀器與試藥安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技 有限公司)；SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。(2)色譜條件色譜柱為島津InertsilODS-2(5μm，4.6×250mm)反相色譜柱；柱溫為40℃；檢測波長為260nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.05％磷酸溶液，總流速為1.2mL/min；分析時間60分鐘；洗脫梯度如表8所示。表8梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.05％磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(3)對照品溶液的製備稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋製成每1mL含0.08mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。(4)供試品溶液的製備取參蘇片劑粉末9g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得參蘇片劑供試品溶液。(5)方法學考察①穩定性試驗取同一供試品溶液，在上述液相色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24小時進行檢測，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明供試品溶液24小時內較穩定。②精密度試驗取同一份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，重複進樣6次，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色 譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明儀器精密度良好。③重複性試驗取同一批樣品，按供試品製備方法製備6份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，進樣分析，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明該方法重複性好。(6)參蘇製劑顆粒指紋圖譜的制定。精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；依據所得的10批參蘇製劑的指紋圖譜，制定標準指紋圖譜。見圖9、10。比較參蘇片劑色譜圖，確定12個峰為共有峰，其中4號峰為葛根素峰，依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》，制定參蘇片劑的標準指紋圖譜。以葛根素峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰的相對保留時間分別為：(1)0.201～0.201、(2)0.532～0.533、(3)0.818～0.821(S)1.000、(5)1.062～1.068、(6)1.102～1.102、(7)1.321～1.325、(8)1.788～1.789、(9)1.832～1.834、(10)1.914～1.917、(11)1.962～1.965、(12)2.040～2.046；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.041～0.101、(2)0.080～0.617、(3)0.244～0.258、(S)1.000、(5)0.26～0.278、(6)0.221～0.238、(7)0.148～0.186、(8)0.039～0.117、(9)0.118～0.402、(10)1.020～1.987、(11)0.585～0.991、(12)0.211～0.571。(7)相似度評價。表910批參蘇片劑HPLC指紋圖譜相似度評價結果表樣品編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照圖譜S11.0000.9890.9760.9860.9760.9150.9460.9860.9811.0000.990S20.9891.0000.9970.9720.9970.9610.9420.9720.9950.9890.996S30.9760.9971.0000.9561.0000.9770.9280.9560.9930.9760.990S40.9860.9720.9561.0000.9560.9050.9581.0000.9710.9860.985S50.9760.9971.0000.9561.0000.9770.9280.9560.9930.9760.990S60.9150.9610.9770.9050.9771.0000.8830.9050.9640.9150.954S70.9460.9420.9280.9580.9280.8831.0000.9580.9660.9460.965S80.9860.9720.9561.0000.9560.9050.9581.0000.9710.9860.985S90.9810.9950.9930.9710.9930.9640.9660.9711.0000.9810.998S101.0000.9890.9760.9860.9760.9150.9460.9860.9811.0000.990對照圖譜0.9900.9960.9900.9850.9900.9540.9650.9850.9980.9901.000實施例6參蘇製劑指紋圖譜的建立(以參蘇丸劑為例)(1)儀器與試藥安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。(2)色譜條件色譜柱為UnitaryC18(5μm，4.6×250mm)反相色譜柱；柱溫為35℃；檢測波長為290nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.05％磷酸溶液，總流速為1.0mL/min；分析時間60分鐘；洗脫梯度如表10所示。表10梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.05％磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(3)對照品溶液的製備稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋製成每1mL含0.08mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。(4)供試品溶液的製備取參蘇丸，粉碎，取8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％乙醇50mL，密塞，稱定重量，回流處理2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得參蘇口服液供試品溶液。(5)方法學考察①穩定性試驗取同一供試品溶液，在上述液相色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、 24小時進行檢測，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明供試品溶液24小時內較穩定。②精密度試驗取同一份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，重複進樣6次，每次進樣10μL，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明儀器精密度良好。③重複性試驗取同一批樣品，按供試品製備方法製備6份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，進樣分析，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3％，表明該方法重複性好。(6)參蘇製劑口服液指紋圖譜的制定。精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；依據所得的10批參蘇製劑的指紋圖譜，制定標準指紋圖譜。見圖11、12。比較參蘇丸色譜圖，確定12個峰為共有峰，其中4號峰為葛根素峰，依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》，制定參蘇口服液的標準指紋圖譜。以葛根素峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰的相對保留時間分別為：(1)0.198～0.201、(2)0.530～0.534、(3)0.817～0.819(S)1.000、(5)1.064～1.069、(6)1.101～1.102、(7)1.324～1.328、(8)1.778～1.782、(9)1.842～1.844、(10)1.911～1.915、(11)1.963～1.965、(12)2.040～2.041；各峰的相對峰面積分別為：(1)0.037～0.052、(2)0.090～0.531、(3)0.260～0.301、(S)1.000、(5)0.235～0.281、(6)0.207～0.243、(7)0.159～0.197、(8)0.044～0.118、(9)0.130～0.531、(10)0.821～2.105、(11)0.580～0.982、(12)0.211～0.540。(7)相似度評價。表1110批參蘇丸HPLC指紋圖譜相似度評價結果表樣品編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照圖譜S11.0000.9770.9560.9930.9970.9480.9771.0000.9970.9930.998S20.9771.0000.9050.9640.9610.9061.0000.9770.9610.9640.976S30.9560.9051.0000.9710.9720.9730.9050.9560.9720.9710.970S40.9930.9640.9711.0000.9950.9380.9640.9930.9951.0000.995S50.9970.9610.9720.9951.0000.9590.9610.9971.0000.9950.997S60.9480.9060.9730.9380.9591.0000.9060.9480.9590.9380.958S70.9771.0000.9050.9640.9610.9061.0000.9770.9610.9640.976S81.0000.9770.9560.9930.9970.9480.9771.0000.9970.9930.998S90.9970.9610.9720.9951.0000.9590.9610.9971.0000.9950.997S100.9930.9640.9711.0000.9950.9380.9640.9930.9951.0000.995對照圖譜0.9980.9760.9700.9950.9970.9580.9760.9980.9970.9951.000實施例7成品與各原料藥材的相關性及各共有峰歸屬(1)儀器與試藥安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標準自動進樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FAZ004B分析天平(上海佑科)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。(2)色譜條件色譜柱為ThermoSyncronis-C18(5μm，4.6×250mm)反相色譜柱；柱溫為30℃；檢測波長為280nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.05％磷酸溶液，總流速為1.0mL/min；分析時間60分鐘；洗脫梯度如表12所示。表12梯度運行表時間(min)乙腈(％)0.05％磷酸溶液(％)0～51995～131～899～9213～158～1292～8815～3612～1488～8636～3814～1786～8338～6017～2683～74(3)對照品溶液的製備稱取葛根素對照品，置於容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋製成每1mL含0.08mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。(4)供試品溶液的製備取參蘇口服液5支，混勻，精密量取5mL於50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得參蘇口服液供試品溶液。藥材溶液的製備方法：分別取各單味藥材，按處方製備成溶液，按參蘇製劑中間體供試品溶液製備方法製備對應的單味藥材溶液，共13味藥材溶液。陰性藥材溶液的製備方法：分別取除其中某味藥材的其他藥材，按處方製備成溶液，按參蘇製劑中間體供試品溶液製備方法製備對應的陰性藥材溶液，共13味陰性藥材溶液。(5)成品與各原料藥材的相關性及各共有峰的歸屬。精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；依據所得的圖譜，制定各共有峰的歸屬。見表13，附圖13。表13各共有峰圖譜歸屬所述參蘇製劑的HPLC在283nm的指紋圖譜有13個共有峰(見圖14)，其中歸屬於枳殼的共有峰為：峰1、峰2、峰10、峰11、峰12、峰13；歸屬於陳皮的共有峰為：峰2、峰10、峰12；歸屬於葛根的共有峰為：峰3、峰4、峰5、 峰6、峰7；歸屬於紫蘇葉的共有峰為：峰9。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp