一種肺組織特異表達啟動子及其應用的製作方法

2023-07-31 01:40:26 2

一種肺組織特異表達啟動子及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種動物肺組織特異性啟動子及其應用。本發明所提供的啟動子是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)3′端至少含有序列表中序列1的第1601-4000位核苷酸序列，並且從序列1的第1601位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延長，得到長度為2400至4000bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b)與a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有啟動子功能的DNA片段；c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。實驗證明本發明所提供的啟動子具有良好的肺組織特異性。
【專利說明】一種肺組織特異表達啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種肺組織特異性啟動子及其應用。
【背景技術】
[0002]長期以來我國的豬群存欄與產量一直處於世界領先地位。隨著養殖業規模的擴大化、集約化，動物飼養密度不斷增加，動物疫病感染狀況日益複雜，動物疫病的發生和流行嚴重製約著我國養殖業的進一步發展和壯大。當前豬場傳染病發生日益嚴重，且發病面廣、傳染快、流行蔓延迅速、死亡率極高。據資料統計，自20世紀70年代以來新增加豬傳染病有21種，其中90年代以來新增加7種。豬的多種傳染病的發生和流行，嚴重打擊了農民養豬的積極性，阻礙了養豬業的發展。通過呼吸系統傳播的疾病佔絕大多數，包括豬氣喘病、豬副嗜血桿菌病、豬鏈球菌病、豬肺疫、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性萎縮性鼻炎、豬沙門氏菌病、豬流感、豬繁殖與呼吸症候群、豬圓環病毒病、豬附紅細胞體病、弓形蟲病等。如果能夠通過抗病育種的方法，培育抗呼吸系統傳染病的轉基因豬，減少呼吸系統傳染病的發生，將對我國的養豬業帶來巨大的經濟效益。
[0003]轉基因技術的關鍵在於使外源目的基因在轉基因動物體內穩定聞效的表達，而轉基因表達所用的啟動子起著非常重要的作用。啟動子是一段能使基因進行轉錄的DNA序列，轉錄的RNA通過進一步的翻譯和修飾形成功能蛋白質。根據啟動子作用的方式及功能不同，可以大致分為4類:組成型啟動子、誘導型啟動子、組織或發育階段特異型啟動子和合成型啟動子。外源基因在組織或發育階段特異型啟動子的調控下，能夠在某些特定的組織器官中表達。如果採用呼吸道特異表達的啟動子，利用轉基因技術將抗病基因在豬呼吸道特異表達，培育出能夠抗呼吸系統傳播疾病的轉基因豬，將在豬的遺傳改良中具有重大意義。目前已有一些組織特異性啟動子被應用於植物的遺傳改良中，獲得了顯著的成效。然而豬組織特異性啟動子的研究卻相對滯後，目前報導的豬組織特異性啟動子寥寥無幾。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種動物肺組織特異性啟動子(肺細胞特異性啟動子)及其應用。
[0005]本發明所提供的動物肺組織特異性啟動子名稱為SSD，來源於豬(Sus scrofadomastica L.),是下述a)或b)或c)的DNA片段:
[0006]a)3'端至少含有序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1601位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2400至4000bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；
[0007]b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有啟動子功能的DNA片段；
[0008]c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。[0009]上述啟動子中，所述嚴格條件是在2X SSC，0.1% SDS的溶液中，在68°C下雜交並洗膜2次。每次5min0.5XSSC,0.1% SDS的溶液中，在68°C下雜交並洗膜2次。每次15min。
[0010]上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%、95%以上的同一性。
[0011]本領域普通技術人員可以很容易地採用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的啟動子核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的啟動子核苷酸序列70%或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表達靶基因的啟動子活性,均是衍生於本發明的核苷酸序列並且等同於本發明的序列。
[0012]這裡使用的術語「同一性」指與天然核酸序列的序列相似性。「同一性」包括與本發明的啟動子核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟體進行評價。使用計算機軟體，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。
[0013]上述啟動子中,所述啟動子SSD的最後一位核苷酸是序列I的第4000位。
[0014]上述啟動子中，序列表中序列I由4000個核苷酸組成。
[0015]上述啟動子中，所述啟動子SSD還可以為下述Al)-A4)中任一種:
[0016]Al)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第14 01位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2600至4000bp的任意一個DNA片段；
[0017]A2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1201位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2800至4000bp的任意一個DNA片段；
[0018]A3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1001位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為3000至4000bp的任意一個DNA片段；
[0019]A4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第501-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第501位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為3500至4000bp的任意一個DNA片段。
[0020]上述啟動子中，所述啟動子SSD具體可為3'端至少含有序列I的第1401-4000位、按照序列I的核苷酸序列向5'端延長得到長度為2600至2800bp的任意一個DNA片段。
[0021]上述啟動子中，所述啟動子SSD具體還可為下述1)-6)中的任意一種:
[0022]I)核苷酸序列為序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸所示的DNA分子，名稱為 SSD-D2600 ；
[0023]2)核苷酸序列為序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸所示的DNA分子，名稱為 SSD-D2800 ；
[0024]3)核苷酸序列為序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸所示的DNA分子，名稱為 SSD-D3000 ；
[0025]4)核苷酸序列為序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸所示的DNA分子，名稱為 SSD-D2400 ；[0026]5)核苷酸序列為序列表中序列I的第501-4000位核苷酸所示的DNA分子，名稱為SSD-D3500 ；
[0027]6)核苷酸序列為序列表中序列I的第1-4000位核苷酸所示的DNA分子，名稱為SSD-D4000。
[0028]下述BI)至B19)中的任一種含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的遺傳材料也屬於本發明的保護範圍:
[0029]BI)含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的表達盒；
[0030]B2)含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的重組載體；
[0031]B3)含有BI)所述表達盒的重組載體；
[0032]B4)含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的重組微生物；
[0033]B5)含有BI)所述表達盒的重組微生物；
[0034]B6)含有B2)所述重組載體的重組微生物；
[0035]B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0036]B8)含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的轉基因動物細胞系；
[0037]B9)含有BI)所述表達盒的轉基因動物細胞系；
[0038]B10)含有B2)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0039]Bll)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0040]B12)含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的轉基因動物組織；
[0041]B13)含有BI)所述表達盒的轉基因動物組織；
[0042]B14)含有B2)所述重組載體的轉基因動物組織；
[0043]B15)含有B3)所述重組載體的轉基因動物組織；
[0044]B16)含有上述動物肺組織特異性啟動子SSD的轉基因動物器官；
[0045]B17)含有BI)所述表達盒的轉基因動物器官；
[0046]B18)含有B2)所述重組載體的轉基因動物器官；
[0047]B19)含有B3)所述重組載體的轉基因動物器官。
[0048]B8) -B11)所述的轉基因動物細胞系、B12) -B15)所述的轉基因動物組織、B16) -B 19)所述的轉基因動物器官不包括動物的繁殖材料。
[0049]上述遺傳材料中，所述表達盒可由所述啟動子SSD、所述啟動子SSD啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述啟動子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。在本發明的一個實施例中，所述目的基因具體為螢光素酶基因(Iuc)。
[0050]所述重組載體中，由所述啟動子SSD啟動目的基因的表達。在本發明的一個實施例中，所述重組載體具體為在pGL3-Basic載體的多克隆位點插入所述啟動子得到的重組質粒。所述多克隆位點具體為限制性內切酶識別位點Kpn I和Hind III。所述目的基因具體為螢光素酶基因(Iuc)。
[0051]上述表達盒或重組載體可以通過原核顯微注射法、胚胎幹細胞介導法、逆轉錄病毒載體法、精子介導的基因轉移、核移植轉基因法、體細胞核移植法、線粒體介導法等常規生物學方法轉化動物器官或組織或細胞，得到轉基因動物細胞或組織或器官。
[0052]所述啟動子SSD在動物中啟動目的基因表達中的應用也屬於本發明的保護範圍，該應用不包括疾病的診斷和治療方法。
[0053]該應用中，所述表達可為呼吸道細胞特異表達。所述呼吸道細胞進一步可為肺來源的細胞(肺細胞)或鼻咽來源的細胞。在本發明的一個【具體實施方式】中，所述呼吸道細胞具體可為A549細胞(人肺腺癌細胞)、LTEP-a-2細胞(人肺腺癌細胞)或CNE2細胞(人鼻咽癌細胞)。
[0054]所述啟動子SSD在培育轉基因動物(如抗呼吸系統傳染病的轉基因動物)中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0055]該應用中，所述動物可為陸生動物，如哺乳動物。
[0056]實驗證明，本發明的啟動子SSD (包括 SSD-D2400、SSD-D2600、SSD-D2800、SSD-D3000,SSD-D3500,SSD-D4000)均可啟動報告基因Iuc (螢光素酶)在A549 (人肺腺癌細胞)中表達，且還證明SSD-D2400啟動報告基因的表達Iuc (螢光素酶)具有肺組織特異性，說明本發明的啟動子SSD具有良好的肺組織特異性。本發明的啟動子SSD可用於培育轉基因動物(如抗呼吸系統傳染病的轉基因動物)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1為豬SSD-D4000啟動子的PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖。其中，泳道M為DNA分子量標準(NP5000);泳道I為PCR產物。
[0058]圖2為重組表達載體pGL3-SSD-D4000的酶切鑑定電泳圖。其中，泳道M為DNA分子量標準(NP5000);泳道 I 為 Kpn I/Hind III 雙酶切 pGL3-SSD_D2400 產物。
[0059]圖3為重組表達載體pGL3-SSD-D2400的酶切鑑定電泳圖。其中，泳道M為DNA分子量標準(NP5000);泳道 I 為 Kpn I/Hind III 雙酶切 pGL3-SSD_D2400 產物。
[0060]圖4為驗證豬SSD-D4000啟動子區不同截短體的啟動子活性(不同載體的螢光素酶相對活性的測定結果)。直方圖表示螢光素酶相對活性，誤差線用標準差標不，重複數為 4。Basic 代表 A549_pGL3_Basic ；ControI 代表 A549-pGL3_Control ；SSD-D500 代表 A549-pGL3-SSD-D500 ；SSD-D1000 代表 A549-pGL3-SSD_D1000 ；SSD-D1500代表 A549-pGL3-SSD-D1500 ；SSD-D2000 代表 A549-pGL3-SSD_D2000 ；SSD-D2200 代表 A549-pGL3-SSD-D2200 ；SSD-D2400 代表 A549-pGL3-SSD_D2400 ；SSD-D2600 代表 A549-pGL3-SSD-D2600 ；SSD-D2800 代表 A549-pGL3-SSD_D2800 ；SSD-D3000 代表 A549-pGL3-SSD-D3000 ；SSD-D3500 代表 A549-pGL3-SSD_D3500 ；SSD-D4000 代表A549-pGL3-SSD-D4000。
[0061] 圖5為驗證豬SSD-D2400啟動子在不同來源的細胞上的啟動子活性(不同細胞的螢光素酶相對活性的測定結果)。直方圖表示螢光素酶相對活性，誤差線用標準差標示，重複數為4OSSD-D2400代表向受體細胞中導入pGL3-SSD-D2400得到的重組細胞，pGL3-Basic代表向受體細胞中導入pGL3-Basic得到的重組細胞。A549代表向A549受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞；LTEP-a-2代表向LTEP-a-2受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞；Hela代表向Hela受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞；Caco-2代表向Caco_2受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞；293T代表向293Τ受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞；HepG2代表向HepG2受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞；CNE2代表向CNE2受體細胞中導入目標載體得到的重組細胞。【具體實施方式】
[0062]本發明中所述的啟動子核苷酸序列可以是其中一個或多個核苷酸發生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分離的核苷酸序列的人工突變體或「天然」突變體，它保留其啟動子功能；還可以是所述的核苷酸序列與其它啟動子序列或啟動子區保守調控序列(「motif」或「box」)的融合序列。本發明中所述的「啟動子活性」是指當以某種基因的可表達方式將其連接到啟動子的下遊，並導入到宿主中，該宿主顯示具有在宿主內或宿主外生產該基因產物的能力和功能時，該啟動子具有啟動活性。通常，是將編碼容易定性或定量檢測的蛋白質的基因(例如，報告基因)連接到該啟動子的下遊，將該基因導入宿主內，並檢測所表達的蛋白質，可確定特定啟動子的活性或是否存在該啟動子或者該啟動子的效力。本發明中所述的轉化是指現有技術中已知的、能夠將外源基因導入動物細胞或動物組織的任何一種動物轉化方法，如原核顯微注射法、胚胎幹細胞介導法、逆轉錄病毒載體法、精子介導的基因轉移、核移植轉基因法、體細胞核移植法、線粒體介導法等。
[0063]術語「具有75%或75%以上同一性的序列」是指與上述啟動子的核苷酸序列相比有75%或75%以上的核苷酸序列相同或相似的核酸序列或核苷酸序列，這些序列以基本相同的方式發揮作用並且能夠驅動其下遊基因的肺組織特異性表達，它們與上述啟動子中序列的差異可能是由於局部結構上的修飾或突變，包括人工突變和非人工突變。
[0064]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0065]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0066]引物由北京博邁德生物科技有限公司合成；2XPfu PCR MasterMix(10212-01)、NP5000 核酸 Marker (2 0211-01)、pTP-BSl 克隆載體(30222-01)、定點突變試劑盒(80111-01)均購自北京諾派生物科技有限公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(DP304-02);質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；pGL3-Control 載體(E1741)、pGL3_Basic 載體(E1751)、PRL-TK 質粒(E2241)、螢光素酶活性檢測試劑盒(E1910)均購自美國Promega公司；lipofectamine2000購自美國invitrogen公司(11668-019) ;DMEM培養基購自美國GIBICO公司(12100-046)；1640培養基購自美國GIBICO公司(31800-022) ;A549細胞(人肺腺癌細胞)、LTEP_a_2細胞(人肺腺癌細胞)、Hela細胞(人宮頸癌細胞)、Caco-2細胞(人結腸癌細胞)、293T細胞(人胚腎細胞)、HepG2細胞(人肝癌細胞)和CNE2細胞(人鼻咽癌細胞)均購自上海細胞庫；杜X長X大豬購自北京市大興區種豬場。
[0067]實施例1、豬SSD-D4000啟動子的克隆及序列測定
[0068]1、引物設計
[0069]設計的引物序列如下，引物引入Kpn I和Hind III限制性酶切位點，人工合成:
[0070]FI (引物 I): 5' -CGGGGTACCGAGCAGGGGATGTAGAGAGAGCAA-3'(下劃線處為 KpnI的識別序列)
[0071 ] Rl (引物 2): 5 ' -GCCCAAGCTTCAGAAACACTCACAGTTGCGT-3 '(下劃線處為 HindIII的識別序列)
[0072]2、豬全基因組的提取
[0073]取新鮮健康的杜X長X大豬的肝臟組織約200mg，迅速剪碎後轉移到玻璃研磨器中，採用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織全基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書。
[0074]3、PCR擴增豬SSD-D4000啟動子區
[0075]以步驟2提取的豬基因組DNA為模板，在引物Fl和引物Rl的引導下，利用2XPfuPCR MasterMix並參照試劑盒說明書進行擴增，反應條件為:首先94°C 5min ;其次94°C 30sec,60°C 30sec, 72°C 4min,共 35 個循環；最後 72°C 5min。將 PCR 產物進行瓊脂糖電泳檢測。
[0076]4、測序及序列分析
[0077]將PCR擴增的大小約4000bp左右的目的DNA亞克隆入平端載體pTP_BSl中，經篩選後挑取單克隆測序，將經測序後表明含有序列表中序列I所示DNA片段(SSD-D4000)的重組質粒命名為PTP-SSD-D4000。序列I由4000個核苷酸組成，為啟動子SSD-D4000的核
苷酸序列。
[0078]實施例2、豬SSD-D4000啟動子功能鑑定
[0079]1、重組表達載體的構建
[0080]將實施例1中獲得的重組質粒pTP-SSD-D4000用限制性內切酶Kpn I和Hind III雙酶切後，與經同樣雙酶切的pGL3_Basic載體的骨架片段相連，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，獲得陽性重組菌，將經PCR和酶切檢測(圖1，圖2)含有大小約為4000bp目的條帶的重組載體送樣測序,將測序表明含有SSD-D4000啟動子(序列I)的重組載體命名為PGL3-SSD-D4000，將含有該重組載體的重組菌命名為DH5 a -pGL3-SSD_D4000。
[0081]SSD-D40005 !端進行截短，獲得的10個DNA片段分別為SSD-D500 (序列I的第3501-4000位所示的DNA片段)、SSD-D1000 (序列I的第3001-4000位所示的DNA片段)、SSD-D1500(序列 I 的第 2501-4000 位所示的 DNA 片段)、SSD-D2000(序列 I 的第 2001-4000位所示的DNA片段)、SSD-D2200(序列I的第1801-4000位所示的DNA片段)、SSD_D2400(序列I的第1601-4000位所示的DNA片段)、SSD_D2600 (序列I的第1401-4000位所示的DNA片段)、SSD-D2800 (序列I的第1201-4000位所示的DNA片段)、SSD-D3000 (序列I的第1001-4000位所示的DNA片段)、SSD-D3500 (序列I的第501-4000位所示的DNA片段)。
[0082]利用定點突變試劑盒，對已構建的PGL3-SSD-D4000質粒中的SSD-D4000進行截短突變，具體操作參照說明書。依次從PGL3-SSD-D4000質粒中的SSD-D40005'端進行截短，獲得如下10個重組表達載體:含有SSD-D3500的重組表達載體pGL3-SSD_D3500 (將pGL3-Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第501-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D3500)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D3000的重組表達載體PGL3-SSD-D3000 (將pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第1001-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D3000)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D2800的重組表達載體pGL3-SSD-D2800 (將pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第1201-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D2800)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D2600的重組表達載體pGL3-SSD-D2600 (將pGL3-Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第1401-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D2600)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D2400的重組表達載體PGL3-SSD-D 2400 (將pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第1601-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D2400)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D2200的重組表達載體pGL3-SSD-D2200 (將pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第1801-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D2200)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D2000的重組表達載體pGL3-SSD-D2000 (將pGL3-Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第2001-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D2000)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D1500的重組表達載體PGL3-SSD-D1500 (將pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第2501-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D1500)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D1000的重組表達載體pGL3-SSD-D1000 (將pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第3001-4000位所示的DNA(名稱為SSD-D1000)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)、含有SSD-D500的重組表達載體pGL3-SSD-D500(將pGL3-Basic載體的Kpn I和Hind III位點間的片段替換為序列I的第3501-4000位所示的DNA (名稱為SSD-D500)，其它核苷酸不變，得到的重組載體)，共10個含截短DNA的重組載體。對10個重組載體均進行Kpn I和Hind III雙酶切鑑定及測序鑑定，證實其準確性。其中PGL3-SSD-D2400經Kpn I和Hind III雙酶切的鑑定結果如圖3所示。將含有這10個重組載體的重組菌，依次命名為DH5 a -pGL3-SSD-D3500、DH5 a -pGL3-SSD_D3000、DH5a -pGL3-SSD-D2800、DH5α-pGL3-SSD_D2600、DH5 α -pGL3-SSD_D2400、DH5α -pGL3-SSD-D2200、DH5α -pGL3-SSD_D2000、DH5α-pGL3-SSD_DI 500、DH5α -pGL3-SSD-D1000、DH5α -pGL3-SSD_D500。
[0083]2、質粒提取與鑑定
[0084]將上述 11 個重組菌 DH5a-pGL3-SSD_D4000、DH5a-pGL3-SSD_D3500、DH5a-pGL3-SSD-D3000、DH5a -pGL3-SSD_D2800、DH5 a -pGL3-SSD_D2600、DH5a-pGL3-SSD-D2400、 DH5a-pGL3-SSD_D2200、 DH5a-pGL3-SSD_D2000、DH5 a -pGL3-SSD-D1500、DH5 a -pGL3-SSD_D1000、DH5 a -pGL3-SSD_D500 分別接種於含氨苄青黴素的LB培養基中，在37°C條件下，200轉/分(旋轉半徑為13mm)搖床上振蕩培養至0D_值為1，採用質粒小提試劑盒抽提重組菌的質粒，即步驟I構建的11個重組表達載體，具體操作參照試劑盒說明書。
[0085]3、細胞培養
[0086]將A549 細胞、LTEP-a-2 細胞、Hela 細胞、Caco-2 細胞、293T 細胞、HepG2 細胞和CNE2細胞這7種受體細胞分別在10% (v/v)新生牛血清的含雙抗DMEM(Dulbeccc/ sModified Eagle' s Medium)培養基中，其培養條件為37°C，濃度為5%的C02。當細胞完全鋪板時，進行傳代培養。操作如下:用洗滌液快速洗滌細胞一次，加入2mL胰酶，37°C消化約為2分鐘，在顯微鏡下觀察到細胞已成球狀後立即棄去胰酶，向培養基中加入細胞生長培養基，並用吸管吹打細胞使儘量以單個細胞的形式存在。將獲得的細胞懸液一部分留在細胞培養瓶中傳代培養，另一部分等體積分裝到24孔板中，置於培養箱中培養用於轉染。
[0087]4、轉染
[0088]當24孔板中細胞達到60% -70%的匯合率時準備轉染。首先吸去培養液，加入無血清無雙抗的optiMEM換液培養。其次將步驟I構建的11個重組表達載體、作為陰性對照的pGL3-Basic載體(沒有啟動子啟動螢光素酶基因的表達)、作為陽性對照的pGL3-Control載體(SV40啟動子啟動螢光素酶基因的表達)分別用optiMEM稀釋成IOOng/μ I，將作為內參照的載體PRL-TK (Τ7啟動子啟動螢光素酶基因的表達)稀釋成50ng/l.! 1，按I μ g質粒需0.75 μ I的lipofectamine2000計算所需的轉染試劑的量。按說明書要求用optiMEM稀釋lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫下靜置5分鐘後將轉染試劑和質粒混合均勻，再室溫靜置20分鐘。取轉染液100 μ I滴加到24孔板的其中一個孔中，這樣每個重組表達載體可保證4次重複。轉染過程需在換液後2h內完成。轉染完成後放入培養箱中溫育，6小時後棄24孔板裡液體，PBS清洗一次後加入10% (v/v)新生牛血的無雙抗D M E M培養基繼續培養，24-48小時後收集細胞，得到含有不同載體的重組細胞。將向A549細胞中導入pGL3-SSD-D4000得到的含有pGL3-SSD_D4000的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD-D4000 ;將向 A549 細胞中導入pGL3-SSD_D3500 得到的含有pGL3-SSD_D3500的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD-D3500 ;將向A549細胞中導入pGL3-SSD_D3000得到的含有pGL3-SSD-D3000的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD_D3000 ；將向A549細胞中導入PGL3-SSD-D2800 得到的含有 pGL3-SSD_D2800 的重組細胞命名為 A549-pGL3-SSD_D2800 ；將向A549細胞中導入pGL3-SSD-D2600得到的含有pGL3-SSD_D2600的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD-D2600 ;將向 A549 細胞中導入pGL3-SSD_D2400 得到的含有 pGL3-SSD_D2400的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD-D2400 ;將向A549細胞中導入pGL3-SSD_D2200得到的含有pGL3-SSD-D2200的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD_D2200 ;將向A549細胞中導入PGL3-SSD-D2000 得到的含有 pGL3-SSD_D2000 的重組細胞命名為 A549-pGL3-SSD_D2000 ；將向A549細胞中導入pGL3-SSD-D 1500得到的含有pGL3_SSD_D 1500的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD-D1500 ;將向 A549 細胞中導入pGL3-SSD_D1000 得到的含有 pGL3-SSD_D1000的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD-D1000 ；將向A549細胞中導入pGL3-SSD_D500得到的含有PGL3-SSD-D500的重組細胞命名為A549-pGL3-SSD_D500 ;將向A549細胞中導入pGL3-Basic得到的含有pGL3_Basic的重組細胞命名為A549-pGL3_Basic ;將向A549細胞中導入pGL3-Control 得到的含有pGL3_Control的重組細胞命名為A549-pGL3_Control ；向LTEP-a-2細胞中導入pGL3-SSD-D2400得到的含有pGL3-SSD_D2400的重組細胞命名為LTEP-a-2-pGL3-SSD-D2400 ；向 LTEP-a-2 細胞中導入 pGL3_Basic 得到的含有 pGL3_Basic的重組細胞命名為LTEP-a-2-pGL3-Basic ;向Hela細胞中導入pGL3-SSD_D2400得到的含有PGL3-SSD-D2400的重組細胞命名為Hela-pGL3-SSD_D2400 ；向Hela細胞中導入pGL3_Basic得到的含有pGL3_Basic的重組細胞命名為Hela-pGL3_Basic ；向Caco-2細胞中導入pGL3-SSD-D2400得到的含有pGL3-SSD_D2400的重組細胞命名為Caco-2-pGL3-SSD-D2400 ；向 Caco-2 細胞中導入 pGL3_Basic 得到的含有 pGL3_Basic的重組細胞命名為Caco-2-pGL3-Basic ；向293T細胞中導入pGL3-SSD_D2400得到的含有PGL3-SSD-D2400的重組細胞命名為293T-pGL3-SSD_D2400 ；向293T細胞中導入pGL3-Basic得到的含有pGL3_Basic的重組細胞命名為293T-pGL3_Basic ；向HepG2細胞中導入pGL3-SSD-D2400得到的含有pGL3-SSD_D2400的重組細胞命名為HepG2-pGL3-SSD-D2400 ；向 H印G2 細胞中導入 pGL3_Basic 得到的含有 pGL3_Basic 的重組細胞命名為IfepG2-pGL3-Basic ；向CNE2細胞中導入pGL3-SSD_D2400得到的含有pGL3-SSD-D2400的重組細胞命名為CNE2-pGL3-SSD_D2400 ；向CNE2細胞中導入pGL3-Basic得到的含有pGL3_Basic的重組細胞命名為CNE2-pGL3_Basic。[0089]5、螢光素酶相對活性測定與分析
[0090]使用螢光素酶活性檢測試劑盒對步驟4轉染後的細胞進行活性測定。測定前，準備以下試劑:(1)1X磷酸裂解緩衝液(PLB)，用購自美國Promega公司試劑盒提供的5XPLB與滅菌水按體積比1:4比例混合，每次使用前配置；(2)LARII (LuciferaseAssayReangentII突光分析劑)，將美國Promega公司試劑盒提供的凍幹突光分析底物重懸於IOml的LARII中，混勻，分裝後做上標記置於_70°C保存備用；(3) Stop Glo Reagent，每次使用前配置，將50 X Stop & Glo Substrate (終止劑)與Stop Glo Buffer (終止緩衝劑)按體積比1:50混合。試劑配置完畢後進行螢光素酶活性測定，操作步驟如下:
[0091]I)將上述24孔板中轉染有目的DNA的貼壁細胞用I XPBS洗滌一次，棄去殘液，加入100 μ I新鮮配製的1XPLB，室溫下，置於冰上15分鐘，然後_80°C凍融一次；
[0092]2)用移液器吹吸兩次後將裂解液收集到1.5ml離心管做好標記，待用；
[0093]3)取若干個1.5ml離心管，均加入50 μ I的LLARII溶液(_70°C取出，室溫下融化)，備用；
[0094]打開Luminometer20/20照度計(購自美國Promega公司)電源開關,進入「HOME」主菜單，按下「Protocol」設定工作模式中各種參數，包括:Display顯示，3S !integratetime (整合時間)IOS ；repeat (重複);靈敏度選用默認值；設定好後返回「HOME」 ；
[0095]4)在「HOME」狀態下，在含50 μ I LARII溶液的1.5mL離心管中加入上述步驟2)製備好的樣品?ομL，用吸頭混合後，放入樣品檢測池中，按「Measure」，儀器自動處理，計算出螢火蟲螢光酶素(11個重組表達載體、陰性對照pGL3-Basic載體以及陽性對照pGL3-Control載體中的突光素酶基因表達)活力，顯示加入Stop & GloSubstrate頁面,此時取出1.5mL離心管，再加入50 μ I新鮮配置的Stop Glo Reagent，混勻後，放回樣品檢測池中，按「0K」儀器便會現計算出海腎螢光素酶活力(內參照載體PRL-TK中的螢光素酶基因所表達)，並計算出兩種螢光素酶活力比值，即螢光素酶相對活力，記錄結果，然後，繪製直方圖。
[0096]螢光素酶活性的檢測結果如圖4所示。A549-pGL3-SSD-D4000、A549-pGL3-SSD-D3500、A549-pGL3-SSD_D3000、A549-pGL3-SSD_D2800、A549-pGL3-SSD-D2600和A549-pGL3-SSD_D2400這6個重組細胞的螢光素酶活性與陰性對照(A549-pGL3-Basic)相比均達到顯著差異(P < 0.05)，表明SSD-D4000、SSD-D3500、SSD-D3000、SSD-D2800、SSD-D2600 和 SSD-D2400 均具有啟動子活性；與陽性對照(A549-pGL3-Control)相比，A549-pGL3-SSD_D4000、A549-pGL3-SSD_D3500、A549-pGL3-SSD-D3000、A549-pGL3-SSD_D2800、A549-pGL3-SSD_D2600 和A549-pGL3-SSD-D2400這6個重組細胞的螢光素酶活性高很多或者至少齊平，表明SD-D4000、SSD-D3500、SSD-D3000、SSD-D2800、SSD-D2600 和 SSD-D2400 的啟動子活性很高。其中，A549-pGL3-SSD-D2200、A549-pGL3-SSD-D2000、A549-pGL3-SSD-D1500、A549-pGL3-SSD-D1000和A549-pGL3-SSD_D500的均沒有螢光素酶活性。上述實驗結果表明SSD-D啟動子的核心區在SSD-D2400(序列I的第1601-4000位)區域。
[0097]向A549 細胞、LTEP-a-2 細胞、Hela 細胞、Caco-2 細胞、293T 細胞、HepG2 細胞和CNE2細胞這7種受體細胞導入pGL3-SSD-D2400得到的重組細胞的螢光素酶活性檢測結果表明，與相應的陰性對照相比，只有向A549細胞、LTEP-a-2細胞和CNE2細胞導入PGL3-SSD-D2400得到的三種重組細胞均具有螢光素酶活性，向A549細胞導入PGL3-SSD-D2400得到的重組細胞(名稱為A549-pGL3-SSD_D2400)的螢光素酶活性是向A549細胞導入pGL3-Basic得到的重組細胞(名稱為A549-pGL3_Basic)的螢光素酶活性的190倍，向LTEP-a-2細胞導入pGL3-SSD_D2400得到的重組細胞(名稱為LTEP-a-2-pGL3-SSD-D2400)的螢光素酶活性是向LTEP-a-2細胞導入pGL3_Basic得到的重組細胞(名稱為LTEP-a-2-pGL3-Basic)的螢光素酶活性的200倍，向CNE2細胞導入PGL3-SSD-D2400得到的重組細胞(名稱為CNE2-pGL3-SSD_D2400)的螢光素酶活性是向CNE2細胞導入pGL3-Basic得到的重組細胞(名稱為CNE2-pGL3-Basic)的螢光素酶活性的5倍。證明了 SSD-D2400隻在肺(A549細胞和LTEP-a-2細胞)來源的細胞中具有啟動子活性， 表明了該啟動子是肺組織特異啟動子，結果如圖5所示。
【權利要求】
1.DNA分子，是下述a)或b)或C)的DNA片段: a)3'端至少含有序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1601位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2400至4000bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能； b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有啟動子功能的DNA片段； c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於:所述DNA分子的最後一位核苷酸是序列I的第4000位。
3.根據權利要求1或2所述的DNA分子，其特徵在於:所述DNA分子是下述Al)-A4)中的任一種DNA片段: Al)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1401位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2600至4000bp的任意一個DNA片段； A2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1201位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2800至4000bp的任意一個DNA片段； A3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第1001位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為3000至4000bp的任意一個DNA片段； A4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第501-4000位核苷酸序列，並且從序列I的第501位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為3500至4000bp的任意一個DNA片段。
4.根據權利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特徵在於:3'端至少含有序列I的第1401-4000位、按照序列I的核苷酸序列向5'端延長得到長度為2600至2800bp的任意一個DNA片段。
5.根據權利要求1-4中任一所述的DNA分子，其特徵在於:所述DNA分子為下述I)-6)中任意一種: 1)核苷酸序列為序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸所示的DNA分子； 2)核苷酸序列為序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸所示的DNA分子； 3)核苷酸序列為序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸所示的DNA分子； 4)核苷酸序列為序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸所示的DNA分子； 5)核苷酸序列為序列表中序列I的第501-4000位核苷酸所示的DNA分子； 6)核苷酸序列為序列表中序列I的第1-4000位核苷酸所示的DNA分子。
6.含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的遺傳材料為下述BI)至B19)中的任一種: BI)含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的表達盒； B2)含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的重組載體； B3)含有BI)所述表達盒的重組載體； B4)含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的重組微生物；B5)含有BI)所述表達盒的重組微生物；B6)含有B2)所述重組載體的重組微生物；B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；B8)含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的轉基因動物細胞系；B9)含有BI)所述表達盒的轉基因動物細胞系；BlO)含有B2)所述重組載體的轉基因動物細胞系；Bll)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；B12)含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的轉基因動物組織；B13)含有BI)所述表達盒的轉基因動物組織；B14)含有B2)所述重組載體的轉基因動物組織；B15)含有B3)所述重組載體的轉基因動物組織； B16)含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的轉基因動物器官；B17)含有BI)所述表達盒的轉基因動物器官；B18)含有B2)所述重組載體的轉基因動物器官；B19)含有B3)所述重組載體的轉基因動物器官。
7.權利要求1-5中任一所述DNA分子作為啟動子的應用。
8.權利要求1-5中任一所述DNA分子在動物中啟動目的基因表達中的應用。
9.根據權利要求8所述的DNA分子，其特徵在於:所述表達為呼吸道細胞特異表達。
10.權利要求1-5中任一所述DNA分子在培育轉基因動物中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK103952411SQ201410183466
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】劉文軍, 楊利敏, 李晶, 李芸, 梁希 申請人:中國科學院微生物研究所