用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療、預防和診斷的方法和組合物的製作方法

2023-07-27 14:29:46 1

專利名稱：用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療、預防和診斷的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及以RPN2基因為靶標的用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療、預防和診斷的方法和組合物。
背景技術：
證據的積累已經暗示腫瘤並不是由一樣細胞型構成的，經常是由不均一的細胞型構成，其中的細胞亞群承擔著腫瘤的抑制、抗藥性(drug resistance)和轉移。這樣的細胞被稱為癌幹細胞(或腫瘤起始細胞)。如果以該癌幹細胞為靶標，則可以期待能夠對癌的發生、轉移、復發進行治療和預防。但是，癌幹細胞表型的分子基礎的大部分是不明確的，因此用來確定癌幹細胞的標誌物尚不明確，此外，尚未建立以癌幹細胞為靶標的治療或預防的方法。本發明人等此前已經證實，作為寡糖轉移酶(OST)複合物的構成成分的核糖體結合糖蛋白II (RPN2)調節乳癌細胞的抗藥性，並且，RPN2的沉默(silencing)是有望戰勝抗藥性(drug resistance)腫瘤的途徑(專利文獻I)。但是，通過抑制RPN2表達而抑制癌細胞的增殖等的機理尚不明確。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:國際特開第2007/144985號

發明內容
發明要解決的問題本發明的目的在於提供用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療、預防和診斷的方法和組合物。
_9] 用於解決問題的方案本申請中，本發明人等公開了 RPN2在乳癌細胞的癌幹細胞級分中高表達，並且RPN2的敲低在體外抑制癌幹細胞的集落形成和浸潤能力。進一步的分析顯示RPN2的敲低使體內腫瘤形成下降、並且抑制轉移能力。利用綜合性蛋白質組學分析(Comprehensiveproteome analysis),明確了 RPN2敲低改變了已知調節TGF — β /Smad通路的14 一 3 —3ζ的表達。因此，本發明人等提供RPN2對於癌幹細胞表型的維持重要、並且RPN2可以成為適合於癌幹細胞治療的有希望的靶標的遺傳學和生物學證據。本發明涉及

[I] 一種用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療或預防的藥物組合物，其包含RPN2抑制劑；[2]根據[I]的藥物組合物，其中，癌幹細胞具有突變型ρ53基因；[3]根據[I]或[2]的藥物組合物，RPN2抑制劑為針對RPN2基因的siRNA ；
[4] 一種癌幹細胞的檢測方法，其包括確定RPN2有無表達或表達水平的步驟；[5]根據[4]的方法，其還包括檢測突變型p53基因的步驟。發明的效果根據本發明，提供一種以RPN2基因為靶標的用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療、預防和診斷的方法和組合物。


圖1 : (A)是表示⑶44 + 0)24—癌幹細胞的不等分裂(unequal division)的圖。(B)是表示利用RT - PCR進行的RPN2的表達解析的圖。圖2是表示RPN2敲低對⑶44 +⑶24 一癌幹細胞數的效果的圖。圖3 (A)是表不RPN2敲低對集落形成能力的效果的圖。(B)是表不RPN2敲低對形成集落數的效果的圖。圖4是表示RPN2敲低對腫瘤形成能力的效果的圖。圖5是表示RPN2敲低對腫瘤轉移的效果的圖。圖6是表示RPN2敲低對 致死性的效果的圖。圖7 (A)是表示RPN2敲低對突變型p53的表達的效果的圖。(B)是表示RPN2敲低對E —鈣黏著蛋白的表達的效果的圖。圖8是表示RPN2敲低對14 一 3 — 3 ζ的表達的效果的圖。圖9是表示在動物中移植ΜΜ231 — LN細胞而形成的腫瘤的免疫組織染色的結果圖。圖10是表示人乳癌患者的乳癌組織中的RPN2和突變型ρ53的表達的圖。圖11是表示利用TUNEL分析評價而得的腫瘤凋亡(apoptosis)圖。通過投與3天後的RPN2 - siRNA/A6K的腫瘤內送達證明了高度誘導了乳癌的腫瘤凋亡。圖12是表示狗乳癌中的RPN2的敲低分析的圖。與RPN2mRNA的對照(生理鹽水)相比，RPN2 — siRNA/A6K 可見約 50%的抑制(η = 3，ρ < O. 001)。
具體實施例方式本發明提供一種用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療或預防的藥物組合物，其包含RPN2抑制劑。此外，本發明提供一種用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療或預防的方法，其包括對對象投與本發明的藥物組合物的步驟。本說明書中使用的術語「癌幹細胞」是指具有多潛能性和自我複製能力(本說明書中也將這些稱為自我複製分化能力)的癌細胞。癌細胞包括乳癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、造血細胞癌細胞等任意的癌。癌幹細胞除了自我複製分化能力外，還可能具有對抗癌劑的耐受性(抗藥性)、向周邊組織浸潤和/或向體內的遠端部位轉移的能力(浸潤轉移能力)。認為若以癌幹細胞為靶標，則能夠治療和預防癌的發生、轉移、復發。本發明在以這樣的癌幹細胞為靶標的癌的治療和預防中有用。I個實施方式中，癌幹細胞的核糖體結合糖蛋白II (RPN2)的表達水平增大。「RPN2」為存在於粗糙內質網、具有向新合成的多肽鏈添加N結合型糖鏈的功能的寡糖轉移酶(OST)複合物的構成成分(亞基)之一。人RPN2是包含631個胺基酸的鹼性膜蛋白。對RPN2的來源沒有限制，例如為動物、優選哺乳動物、更優選靈長類、進而優選人。「RPN2基因」是編碼RPN2的基因。序列號I中示出人RPN2基因的鹼基序列。
本發明人等發現，在⑶44 + /⑶24_的乳癌的癌幹細胞級分中通過短髮夾RNA(shRNA)敲低RPN2的表達時，在體外癌幹細胞的集落形成和浸潤能力得到抑制，並且免疫缺陷動物中的(即體內的)腫瘤形成能力和浸潤轉移能力消失。如上所述，癌幹細胞由於可能具有自我複製分化能力、抗藥性、浸潤轉移能力，因此，認為與上述全部均相關的RPN2為癌幹細胞的標誌物，此外，若以RPN2為靶標，能夠治療和預防含有癌幹細胞的或由其起源的癌。其它實施方式中，癌幹細胞具有突變型p53基因。「p53」為抗癌基因產物，已在多種人癌中發現p53基因中的突變(Adorno, M.et al. ,Cell, 137:87-98(2009)；Wang, S. P. et al. , Nat. Cell Biol. , 11:69 4-704(2009) ；Muller,P.A. etal. , Cell, 139: 1327-1341 (2009) ;Morton, J. P. et al. , Proc. Nat1. Acad. Sc1.USA, 107:246-251 (2010))。對p53基因中的突變沒有限制，突變優選為不發生移碼(frameshift)的置換型點突變(錯義突變)或缺失突變(密碼子缺失突變)。本發明人等發現，當在具有突變型P53的細胞株中敲低RPN2的表達時，突變型p53蛋白質水平降低、抑制了 E —鈣黏著蛋白的表達降低。進而，本發明人等發現，在高表達RPN2的癌細胞中，14 一 3 — 3 4的表達降低，而通過RPN2的敲低，其表達增加。已知14 一3 — 3 4在mdm2介導下發揮將突變型p53分解的作用。癌細胞已知呈現一種稱為上皮間質轉化(EMT)的現象。EMT時，與細胞粘附相關的E 一鈣黏著蛋白的表達降低，認為其結果是癌細胞進行浸潤或轉移。上述結果表明，癌細胞中RPN2使14 一 3 — 3 (的表達降低，其結果是突變型p53穩定化、引起EMT，也帶來了癌細胞的浸潤或轉移。 已經闡明突變型p53與癌細胞的自我複製分化能力和浸潤轉移能力相關，存在眾多與P53相關的研究。但是，截至目前還沒有過以p53為靶標的癌的治療或預防的成功例子被報導。RPN2除了與自我複製分化能力和浸潤轉移能力相關，還顯示與抗藥性相關，因此認為如果能夠抑制RPN2，則不僅能夠使癌細胞的抗藥性消失，還能夠在其上遊抑制突變型P53的作用，抑制癌細胞的自我複製分化能力和浸潤轉移能力。如果在檢測RPN2的表達的基礎上檢測突變型p53的存在，則能夠更準確地鑑定具有抑制RPN2有效的突變型p53的癌細胞。此外，通過抑制RPN2，則能夠比以突變型p53為靶標更有效地治療和預防與突變型p53相關的癌。本說明書中使用的術語「RPN2抑制劑」是指具有抑制RPN2基因的表達、抑制RPN2基因產物的作用的任意物質。RPN2已知在胎盤以外的正常組織中是幾乎不表達的。因此，RPN2抑制劑基本不會作用於孕婦以外的對象中的癌細胞以外的細胞，作為無副作用的特異性癌治療藥是有用的。對對象沒有限定，例如為動物、優選哺乳動物、更優選靈長類、進一步優選人。作為RPN2抑制劑，可以使用例如抑制RPN2基因轉錄的物質、與RPN2轉錄產物結合或分解其的物質、與RPN2蛋白質結合的物質等。作為與RPN2蛋白質結合的物質的例子，可以列舉抗RPN2抗體或其片段(Fab、F (ab』)2等)、寡糖轉移酶(OST)複合物中與RPN2結合的其它構成成分等。作為與RPN2轉錄產物結合或分解其的物質的例子，可以列舉出針對RPN2基因的反義RNA、核糖酶、低分子幹擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)等。優選使用針對RPN2基因引發RNA幹擾(RNAi)的siRNA、miRNA等作為RPN2抑制劑。RNA幹擾是指利用雙鏈(ds) RNA分子序列特異性地抑制基因表達的現象。例如，siRNA引起的靶標mRNA的切斷，siRNA引起的靶標DNA區域的異染色質化所介導的基因沉默(silencing) ,miRNA引起的翻譯抑制、轉錄抑制、mRNA分解等從而引發RNA幹擾。siRNA可以基於作為對象基因的RPN2基因的序列進行序列設計並人工合成，因此在本發明中優選使用。可以通過本技術領域中公知的任意方法獲得這樣的siRNA。例如，可以利用也用於DNA化學合成中的亞磷醯胺法從3』末端起向著5』末端一個鹼基一個鹼基地依次進行縮合反應從而化學合成。在合成過程中，為了防止RNase所致的分解，優選對各核糖核苷酸的2』末端的羥基進行保護。作為這樣的保護基，可以列舉出2』-0—叔丁基二甲基矽基(2』一tBDMS)、2』 - 0 —三異丙基矽氧基甲基(2』 - T0M)、5』_矽基一2』-乙醯氧基乙氧基(2』 一ACE)等。針對RPN2基因的siRNA具有與RPN2基因的規定序列對應的序列、即與作為靶標的mRNA的一部分序列對應的序列。例如，對於序列號I所示的RPN2基因序列中的第1194位 第1212位的序列，可以使用包含作為正義鏈的序列號2的RNA和作為反義鏈的序列號3的RNA的dsRNA (序列A)作為siRNA。該dsRNA中，各鏈的3』末端存在2個鹼基的突出(overhang),因此雙鏈部分為19鹼基長。序列號4 25中不出專利文獻I公開的針對RPN2基因的siRNA (序列B L)的正義鏈和反義鏈的序列。可以將這些對(dsRNA)作為本發明中RPN2抑制劑來使用。此外，miRNA為不編碼蛋白質的低分子RNA，已知在基因組中存在數百種。miRNA以數百 數千鹼基的核苷酸形式轉錄後，接受加工，最終成為19 24個鹼基的2聚核苷酸，通過具有與該miRNA互補的鹼基序列 的mRNA的翻譯抑制、mRNA的分解、轉錄的控制等來抑制基因表達。由於已知RPN2也可以被多個miRNA控制表達，因此通過人工合成這樣的miRNA，作為本發明中RPN2抑制劑使用，從而能夠抑制RPN2基因表達。有可能抑制RPN2基因的表達的已知miRNA的序列可以由公開資料庫(TargetScan Release3.1等)檢索而得。本發明的藥物組合物的投與可以是全身投與、局部投與中的任一種。投與途徑可以是靜脈內、皮下、腹腔內、肌肉內、鼻腔內等任意途徑。本發明的藥物組合物還可以含有製劑領域中使用的賦形劑、稀釋劑、穩定化劑等任意成分。例如，RPN2抑制劑為抗體等蛋白質的情況下，藥物組合物還可以含有蛋白質製劑領域中通常使用的成分。此外，例如，RPN2抑制劑為siRNA等核酸的情況下，可以含有用於導入核酸的任意物質(例如脂質體)。國際公開第2010/024262號中記載的含有肽表面活性劑的轉染劑顯示出低毒性、高的送達患部效率和靶標基因的抑制效率，能夠全身投與，因此可以優選用於本發明。本發明的藥物組合物中包含的RPN2抑制劑的使用量可根據投與方法、腫瘤的種類、大小、患者的狀態、並用的藥物等而改變，本領域技術人員可以適當確定。例如，使用siRNA作為RPN2抑制劑時,在局部投與的情況下,期望為lnmol/kg以上且10nmol/kg以下，全身投與的情況下期望為2nmol/kg以上且50nmol/kg以下。本發明提供一種癌幹細胞的檢測方法，其包括確定RPN2有無表達或表達水平的步驟。RPN2存在於細胞質內，因此，在檢測時，從由對象獲得的細胞或組織中製備包含RNA、蛋白質等的提取物，並檢測其中的轉錄產物(RPN2mRNA)、翻譯產物(RPN2蛋白質)。RPN2mRNA的檢測中，可以使用RNA印跡法、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT — PCR)等本技術領域中公知的任意方法。RPN2蛋白質的檢測中，可以使用本技術領域中公知的任意方法，例如使用了抗RPN2抗體的免疫學方法(蛋白質印跡法、ELISA等)。由於已知RPN2在胎盤以外的正常組織中幾乎不表達，因此存在RPN2的表達或高水平表達則成為與RPN2的癌相關的指標。這樣的癌的治療和預防中，使用包含RPN2抑制劑的本發明的藥物組合物進行處置是有效的。I個實施方式中，本發明的檢測方法還包括檢測突變型p53基因的步驟。突變型P53基因的檢測可以使用本技術領域中公知的利用了雜交、電泳、核酸擴增、測序等的任意核酸檢測 分析方法來進行。如上所述，當表達RPN2的癌細胞中存在突變型p53時，通過抑制RPN2可以有效治療和預防與突變型p53相關的癌。因此，本發明的檢測方法作為用於確定有效的治療和預防方法的診斷方法是有用的。以下通過實施例更詳細地說明本發明，但本發明不受這些實施例限定。實施例實施例1
將人乳癌細胞MCF7 - ADR分成2種細胞級分⑶44 +⑶24 —和⑶44 +⑶24 +，培養7天。僅⑶44 +⑶24_的級分具有作為癌幹細胞性質的不等分裂(圖1A)。利用RT — PCR解析核糖體結合糖蛋白II (RPN2)的表達。其結果是，⑶44 +⑶24_ (癌幹細胞)中的表達比⑶44 +⑶24 + (非癌幹細胞)中的表達亢進約20倍以上(圖1B)。實施例2使用shRPN2載體，製作RPN2的表達被恆常敲低的人乳癌細胞。使用的細胞為MCF7、MCF7 — ADR、MDA — MB — 231LN(MM231 — LN)這三種人乳癌細胞株。MCF7 為 MCF7 —ADR (抗藥性株)的母株，為非惡性乳癌細胞，為激素受體(hormone receptor)陽性,對藥物具有敏感性。MM231 - LN為激素受體陰性、高轉移性的惡性度高的細胞株。對獲得的各細胞，在IOnM多西紫杉醇(docetaxel)存在下孵育96小時後，測定⑶44 +⑶24—癌幹細胞數目。其結果是，導入了 8111 ^2載體的10^7 — 401 細胞和麗231 —LN細胞與導入了對照載體(shNC)的細胞相比，⑶44 +⑶24—癌幹細胞數量顯著減少(圖2)。實施例3作為癌幹細胞的特徵之一，具有在平面培養(培養皿)中形成集落的能力。如圖3A上圖(MM231 -LN- shNC)所示，MM231 — LN細胞形成多個集落，在導入shRPN2載體時，集落形成能力顯著受到抑制(圖3A下圖，麗231 -LN- shRPN2)。圖3B示出所形成的集落數。實施例4癌幹細胞的另一特徵是即使在動物中移植較少的細胞數，也會形成明顯的腫瘤。在此，對2種人乳癌細胞(MCF7 - ADR和麗231 — LN),比較了敲低RPN2的情況(shRPN2)和未敲低的情況(shNC)。將導入了 shRPN2載體的細胞移植到小鼠(NOD — Scid小鼠、雌性、6周齡)背部的右側，將導入了 shNC載體的細胞移植到左側。就移植後的細胞數而言，在MCF7 — ADR的情況下為I X IO4個/部位，在麗231 — LN的情況下為I X IO2個/部位。其結果是，如小鼠的影像圖(圖4中間圖(MCF7 — ADR — Iuc)和右圖(MM231 —LN — Iuc))所示，導入了 shRPN2載體的細胞均喪失了腫瘤形成能力。表I中總結了上述結
果o表I
權利要求
1.一種用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療或預防的藥物組合物，其包含RPN2抑制劑。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，癌幹細胞具有突變型P53基因。
3.根據權利要求1或2所述的藥物組合物，其中，RPN2抑制劑是針對RPN2基因的SiRNA0
4.一種癌幹細胞的檢測方法，其包括確定RPN2有無表達或表達水平的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其還包括檢測突變型p53基因的步驟。
全文摘要
提供用於含有癌幹細胞的或由其起源的癌的治療、預防和診斷的方法和組合物。
文檔編號A61P35/00GK103068403SQ201180039869
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月24日 優先權日2010年8月20日
發明者落谷孝廣 申請人:日本國立癌症研究中心, 三維肽膠株式會社