一種B型流感病毒廣譜中和抗體、其製備方法及應用與流程

2023-07-27 21:24:16 2

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種流感病毒抗體、其製備方法及應用，尤其涉及一種b型流感病毒廣譜中和抗體、其製備方法及應用。

背景技術：

流感病毒(influenzavirus)是引起流行性感冒的人畜共患傳染病病原，屬於正粘病毒科(orthomyxoviridae)，流感病毒屬。按照流感病毒核蛋白和基質蛋白抗原性的不同，流感病毒可分為a、b、c三型，近年來發現的牛流感病毒歸為了d型。

a型流感病毒可引起人、禽、哺乳動物和蝙蝠等感染和發病，危害最為嚴重。根據病毒顆粒表面血凝素蛋白(hemagglutinin，ha)和神經氨酸酶(neuraminidase，na)的不同，a型流感病毒可分為多個亞型，目前已發現的ha有18個亞型(h1-h18)，na有11個亞型。a型流感病毒容易發生抗原變異和漂移，曾四次引起世界性大流感，也是季節性流感的主要元兇。b型流感種系較少。自1940年首次分離後，b型流感病毒逐漸進化成以b/victoria/2/1987為代表的b-victorialineage(bv)和以b/yamagata/16/1988(by)的兩個種系。截止目前為止，b型流感病毒僅為3個種系：現在流行的bv系、by系，以及在bv和by出現以前的b型流感毒株種系。

b型流感病毒的自然宿主主要是人，曾經在海豹中檢測到。b型流感病毒的變異頻率和宿主範圍比a型流感病毒要低，要小，也從未造成過流感大流行。人們認為b型流感病毒的危害遠遠低於a型流感病毒，這致使b型流感的研究也相應較少。然而，近些年來有研究發現，b型流感病毒在特定的情況下 所導致的疾病負擔甚至超過了a型流感病毒。原因在於b型流感多發於兒童和老年人。幼兒園或學校等人群密集環境因素使得b型流感在兒童間呈集體性暴發，兒童感染後常見的臨床症狀為高燒、肌肉酸痛、咳嗽和頭痛等，如治療不及時，可在短時間內引發肺炎、腦膜炎和心肌炎等症狀。由於老年人抵抗力較低，感染b型流感後出現併發症較多，致使病情嚴重，無疑增加了死亡率。在2013-2014年流感流行季節，在北美地區特別是美國爆發了大範圍的b型流感疫情，使得美國疾病預防控制中心提出了b型流感病毒的致病性不可低估的指導性意見。

疫苗接種是目前預防和控制流感的首選策略。臨床上經常使用流感疫苗包括a型流感病毒中的h1n1亞型流感病毒、h3n2亞型流感病毒和一個種系b型流感病毒三種流感組份，為三價流感疫苗。近些年來，季節性流感疫苗又增加了一個種系的b型流感病毒組分，稱之為四價疫苗。流感疫苗候選毒株會隨著流行毒株的變化而更新，然而仍然趕不上季節性流感病毒變異的速度，更無法預防跨種傳播而來的禽流感和豬流感。簡而言之，流感病毒的不可預測性及高度的變異性致使流感防控成為研究的重點與難點。這些無疑使得能預防多個亞型a型流感病毒或多個種系b型流感病毒的廣譜流感疫苗顯得尤為重要。研究學者嘗試了多種方法來開發廣譜流感疫苗，如表達高度保守的ha莖部區作為亞單位疫苗、或以形成納米顆粒的蛋白為骨架，遞呈ha莖部區的病毒樣顆粒疫苗等。此外，在廣譜流感疫苗的概念和基礎上，廣譜流感病毒中和抗體也逐漸成為流感預防和治療藥物的研究焦點和重點。

ha是流感病毒的主要表面抗原，結合在ha受體結合部位或莖部區的抗體能有效抑制ha蛋白的受體結合和膜融合活性。目前，已有多個靶向ha頭部區的人源或鼠源單克隆抗體，其中11個抗體的抗原抗體複合物結構已解析。這類 抗體主要通過抑制病毒與受體結合來發揮作用。大多數為型特異性，也有一些廣譜型單克隆抗體，如可中和多個a型流感病毒亞型的廣譜中和抗體c05、f045-092、s139/1，以及中和多個b型流感病毒種系的cr8033和cr8071人源單克隆抗體。ha頭部的抗原變異較為頻繁，容易發生免疫逃逸現象，ha莖部區相對於頭部區更為保守，靶向ha莖部區的廣譜型抗體的研發更受青睞。近些年研發出較多靶向ha莖部區的單克隆抗體：如cr6261，f10，cr8020，fi6v3和6f12等。cr6261和f10可中和group1的a型流感病毒，cr8020可中和group2的a型流感病毒，而fi6v3甚至可中和所有亞型的ha，而cr9114抗體則是可中和a型流感病毒和b型流感病毒超級廣譜中和抗體。

常用的人源流感病毒中和抗體的篩選方法有噬菌體抗體庫展示篩選、單個b細胞測序技術、b細胞永生化和人源化小鼠雜交瘤細胞篩選等等，目前，已利用這些方法獲得了多種人源廣譜中和抗體，如c05、f045-092、cr6261、cr9114、cr8033、cr8071、f10和fi6v3等。而我們則利用高通量測序的方法獲得了一株a型流感病毒的廣譜中和抗體af4h1k1。這種方法利用患者或疫苗免疫個體的pbmc來構建抗體文庫，採用二代高通量測序的方式獲得bcr文庫，通過分析感染或疫苗不同免疫時期的抗體重鏈和輕鏈可變區的頻率變化來挑選，簡化了抗體的篩選流程，為抗體藥物的研發提供了一個捷徑。

技術實現要素：

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提供了一種流感病毒抗體、其製備方法及應用，特別是一種b型流感病毒廣譜中和抗體、其製備方法及應用。本發明提供的b型流感病毒廣譜中和抗體為流感的預防和治療提供了新的治療方法，為b型流感病毒感染診斷以及b型流感病毒表面抗原ha的檢測提供了新的選擇，具有重要的經濟和社會意義。

為達此目的，本發明採用以下技術方案：

在本發明的第一方面，本發明提供了一種b型流感病毒廣譜中和抗體，所述抗體為人源單克隆抗體。根據本發明的實施例，該抗體的輕鏈高變區cdr1、cdr2和cdr3的胺基酸序列分別如seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7所示；其重鏈高變區cdr1、cdr2和cdr3的胺基酸序列分別如seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示。

根據本發明的實施例，所述抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列如seqidno.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或多個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列；其重鏈可變區的胺基酸序列如seqidno.2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或多個胺基酸形成的具有同等功能的胺基酸序列。

根據本發明的實施例，序列可以包含某些生物學功能等同的胺基酸或「保守性替代」，其它序列可以包含功能非等同的胺基酸或「非保守性替代」，其經基因工程改造以改進cdr或含cdr抗體的特性。

根據本發明的實施例，前面所述的胺基酸序列如下：

seqidno.1：

diqltqspsflstsvgdrvtitcrashdiysylawyqqkpgkapklliyaastlqtgvpsrfsgsgfgteftltisslqpedfgtyycqqlrsypytfgqgtkleik。

seqidno.2：

qvqlvqsgselrrpgasvkisckasgytftdyamnwvrqvpgqglewvgwintdngnptyaeafagrfvfsldtsvstaylqisslkaddtavyfcaanwggyyydssvnsgggyfdnwgqgtlvtvfs。

seqidno.5：hdiysy。

seqidno.6：aas。

seqidno.7：qqlrsypyt。

seqidno.8：gytftdya。

seqidno.9：intdngnp。

seqidno.10：aanwggyyydssvnsgggyfdn。

根據本發明的實施例，所述抗體的輕鏈框架區fr1、fr2和fr3的胺基酸序列如seqidno.11、seqidno.12或seqidno.13所示；其重鏈框架區fr1、fr2和fr3的胺基酸序列如seqidno.14、seqidno.15或seqidno.16所示。

根據本發明的實施例，前面所述的胺基酸序列如下：

seqidno.11：diqltqspsflstsvgdrvtitcras。

seqidno.12：lawyqqkpgkapklliy。

seqidno.13：tlqtgvpsrfsgsgfgteftltisslqpedfgtyyc。

seqidno.14：qvqlvqsgselrrpgasvkisckas。

seqidno.15：mnwvrqvpgqglewvgw。

seqidno.16：tyaeafagrfvfsldtsvstaylqisslkaddtavyfc。

根據本發明的實施例，所述抗體為人源單克隆抗體。

根據本發明的實施例，所述抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體或其衍生物。

發明人發現，根據本發明實施例的抗體或其抗原結合片段，能夠很好的中和yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，該抗體能抑制b型流感病毒凝集雞紅細胞的能力，是血凝抑制抗體；且所述抗體能抑制b型流感病毒在小鼠體內的複製，抑制b型流感病毒感染小鼠引起的體重 下降，保護小鼠在b型流感病毒感染後仍有100％存活率，從而可以有效預防和治療由b型流感病毒引起的疾病。

在本發明的第二方面，本發明提供了一種dna片段。根據本發明的實施例，該dna片段編碼如第一方面所述的抗體。

根據本發明的實施例，前面所描述的dna片段，包含重鏈可變區編碼序列和輕鏈可變區編碼序列；其編碼輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列分別如seqidno.3和seqidno.4所示。

根據本發明的實施例，前面所述的核苷酸序列如下：

seqidno.3：

gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctacatctgtaggggacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacgacatttacagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaactggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatttgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttggaacttattactgtcaacaacttaggagttacccgtacacttttggccaggggaccaaactggagatcaaa。

seqidno.4：

caggtgcagctggttcaatctgggtctgagttgaggaggcctggggcctcagtgaaaatttcgtgcaaggcttccggatacaccttcaccgactatgctatgaattgggtccgccaggtccctggacaaggtttggagtgggtgggatggatcaacaccgacaatgggaacccaacgtatgccgaggccttcgccggacggtttgtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtatacttttgtgcggccaattgg ggaggctattattatgatagttctgttaattccggcgggggctactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtcttctca。

發明人發現，通過採用根據本發明的多核苷酸，能夠有效地合成根據本發明實施例的b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結合片段。關於b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結合片段，前面所描述的特徵和優點同樣適用該多核苷酸，在此不再贅述。

在本發明的第三方面，本發明提供了一種表達載體，所述表達載體包含至少一個拷貝的如第二方面所述的dna片段。

在本發明的第四方面，本發明提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含如第三方面所述的表達載體。

發明人發現，通過採用根據本發明的方法，能夠利用前面所述的多核苷酸有效地合成根據本發明實施例的b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結合片段。關於b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結合片段，前面所描述的特徵和優點同樣適用該多核苷酸，在此不再贅述。

在本發明的第五方面，本發明提供了一種如第一方面所述b型流感病毒廣譜中和抗體的製備方法，包括如下步驟：

(1)分離季節性流感疫苗免疫者外周血中的單個核細胞(pbmc)，提取rna，反轉錄cdna；

(2)擴增重鏈和輕鏈的高度可變區序列，根據cdr豐度進行挑選併合成；

(3)將合成的抗體片段構建到表達載體中。

根據本發明的實施例，所述抗體的製備方法可以採用本領域技術人員熟知的技術進行，在此不做特殊限制。

根據本發明的實施例，步驟(3)所述的載體為哺乳動物表達載體，優選為 pcaggs哺乳動物表達載體。

考慮到密碼子的簡併性，例如可在其編碼區，在不改變胺基酸序列的條件下，對編碼上述抗體的基因序列進行改造，獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領域技術人員可以根據表達抗體宿主的密碼子偏愛性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達效率。

進一步地，本發明將前面所述抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區進行重組，可獲得分子量更小的單鏈抗體(scfv)，該抗體同樣能夠特異性識別b型流感病毒表面抗原ha。單鏈抗體穿透力強，易於進入局部組織發揮作用。可將上述編碼抗體的基因、scfv基因克隆到表達載體中，進而轉化或轉染宿主細胞，獲得所述抗體以及單鏈抗體。

此外，可將前面所述抗體的輕鏈可變區編碼基因和重鏈可變區編碼基因克隆到全抗表達載體中，並導入宿主細胞中，獲得表達抗b型流感病毒的全抗免疫球蛋白。

利用血凝抑制試驗，以及中和試驗等方法對獲得的b型流感病毒抗體進行功能鑑定，結果表明所述抗體針對b型流感病毒均有特異性結合，利用中和試驗對所述抗體進行功能鑑定，結果表明該抗體對yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒均具有較好的中和活性。

在本發明的第六方面，本發明提供了如第一方面所述的b型流感病毒廣譜中和抗體，或如第二方面所述b型流感病毒廣譜中和抗體的dna片段，或如第三方面所述的表達載體，或如第四方面所述的宿主細胞在製備預防或治療由b型流感病毒引起的疾病的藥物中的應用。

本發明還提供了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，該藥物組合物包含前面所述的抗體或其抗原結合片段或前面所述的dna片段。

在本發明的第七方面，本發明提供了如第一方面所述的b型流感病毒廣譜中和抗體在製備對多種系b型流感病毒的ha抗原具有親和力和中和活性的試劑中的應用。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明所述抗體能夠很好的中和yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，該抗體能抑制病毒凝集雞紅細胞的能力，是血凝抑制類抗體，其hi效價在0.24μg/ml-4.7μg/ml之間，其中和效價ic50在0.02μg/ml-1.21μg/ml之間；

(2)本發明所述抗體能夠抑制b型流感病毒在小鼠體內的複製，抑制b型流感病毒感染後小鼠的體重下降，保護小鼠在b型流感病毒感染後仍有100％的存活率；

(3)本發明所述抗體的獲得為b型流感的預防和治療提供了新的候選，具有重要的經濟和社會意義。

附圖說明

圖1是本發明製備的0809抗體的igg和fab經superdextm20010/300gl分子篩層析純化結果；

圖2為本發明製備的抗體0809在balb/c體內預防效力評估，其中，圖2(a)為小鼠感染病毒後的體重變化；圖2(b)為小鼠感染病毒後的存活率；

圖3為本發明製備的抗體0809在balb/c體內抑制病毒複製的評估，其中，圖3(a)為攻毒後3天的肺部病毒滴度；圖3(b)為攻毒後5天的肺部病毒滴度。

下面對本發明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，並不代表或限制本發明的權利保護範圍，本發明的保護範圍以權利要求書為 準。

具體實施方式

下面詳細描述本發明的實施例，需要說明的是下面描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。另外，如果沒有明確說明，在下面的實施例中所採用的所有試劑均為市場上可以購得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，對於沒有列出的反應條件，也均為本領域技術人員容易獲得的。

實施例1抗體的製備

b型流感病毒廣譜中和抗體的製備方法，包括如下步驟：

(1)在志願者接種季節性流感疫苗後的0天和7天採集外周血中的pbmc，提取rna，反轉錄cdna；

(2)擴增出重鏈和輕鏈的高度可變區序列，將擴增的目的片段利用miseq2x300bp進行測序，並對測序結果進行分析；

(3)以cdr豐度為主要參數挑選免疫者免疫7天後的高頻可變區序列，並通過重鏈輕鏈配對算法計算自然配對的機率，接著挑選出cdr1、cdr2和cdr3的高頻出現的vh和vl序列加上各自的恆定區進行合成；

所述輕鏈可變區(vl)的核苷酸序列為：

gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctacatctgtaggggacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacgacatttacagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaactggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatttgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttggaacttattactgtcaacaacttaggagttacccgtacacttttggccaggg gaccaaactggagatcaaa；

所述重鏈可變區(vh)的核苷酸序列為：

caggtgcagctggttcaatctgggtctgagttgaggaggcctggggcctcagtgaaaatttcgtgcaaggcttccggatacaccttcaccgactatgctatgaattgggtccgccaggtccctggacaaggtttggagtgggtgggatggatcaacaccgacaatgggaacccaacgtatgccgaggccttcgccggacggtttgtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtatacttttgtgcggccaattggggaggctattattatgatagttctgttaattccggcgggggctactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtcttctca。

(4)以igg和fab形式，在n端加入對應的重鏈和輕鏈的分泌信號肽後，將抗體片段構建到pcaggs哺乳動物表達載體；

(5)將插入重鏈和輕鏈序列的pcaggs表達載體，通過pei轉染試劑共轉染293t細胞進行大量表達，並進行純化；

(6)在質粒轉染後96h後收穫293t上清，而後，經過離心、0.22μm的濾膜過濾，親和層析純化和分子篩層析純化獲得純度較高的fab或者igg。純化後的抗體，經elisa檢測，獲得具有b型流感病毒結合活性的一株單克隆抗體，命名為0809。0809經superdextm75hiload20/16075pg分子篩層析純化的結果如圖1所示。由圖1可見，通過純化後都能得到單一所要抗體的igg或fab的形式。

實施例2抗原抗體親和力測試

利用表面等離子共振技術，將0809的fab(10μg/ml)形式通過氨基偶聯的作用固定到cm5晶片上，固定值達到500ru，流動相抗原蛋白b型流感病毒 ha按2倍比稀釋(濃度範圍1μm-100μm)。選取kinject模式進行動力學參數測定，機器流速30μl/min，進樣時間1-2min，解離時間2-6min。而後，利用biaevaluation軟體計算親和力，表1示出了0809fab與各種系b型流感病毒ha的親和力測定結果。由表1可以看出，0809與b型流感病毒yamagata和victoria種系的ha結合解離模式幾乎都是快結合快解離，親和力大小分別為4.11nm和7.63nm。

表1.0809fab與各種系b型流感病毒ha的親和力測定

實施例3抗體的血凝抑制(hi)試驗與中和試驗

血凝抑制試驗：採用固定病毒稀釋抗體的方法，將0809igg抗體稀釋液同4個血凝單位的b型流感病毒在室溫下作用30min，而後加入同病毒液同等體積的1％雞紅細胞，表2示出了0809igg與各種系b型流感病毒的血凝抑制活性。結果發現0809igg是血凝抑制性抗體，對不同種系的b型流感病毒均有較高的血凝抑制活性，hi效價在0.24μg/ml-4.7μg/ml之間。

中和試驗：採用固定病毒稀釋抗體的方法，將0809igg抗體稀釋液同等體積的200tcid50不同b型流感病毒毒株混合在一起，室溫放置1h。而後將病毒抗體混合液接種96孔板的細胞，100μl/孔。放置37℃作用1h後，將上清去掉，用dmem洗滌三次，而後加入含有0.5μg/ml胰酶的dmem維持液。放在37℃ 培養72h。每天觀察並記錄細胞病變(cpe)，並在最後一天，利用血凝的方法檢測每孔細胞上清的血凝活性，以此來判斷有無病毒複製，以及抗體的中和效果，表2示出了0809igg與各種系b型流感病毒的中和活性。結果表明0809igg對不同種系的b型流感病毒均有較高的中和活性，ic50在0.02μg/ml-1.21μg/ml之間。

表2.0809igg與各種系b型流感病毒血凝抑制活性和中和活性測定

實施例4體內抗體預防效果

(1)預防實驗

小鼠尾靜脈注射0809igg抗體，劑量分別為15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg和1mg/kg。同時設定無關抗體igg為對照組，劑量為10mg/kg。抗體注射24h後乾冰麻醉小鼠，滴鼻感染小鼠適應毒b/lee/1940。每組15隻，其中5隻用來 檢測感染後3天肺中病毒滴度，5隻用來檢測感染後5天肺中的病毒滴度，剩下5隻用來觀察感染後14天內小鼠的體重變化及生存率。結果發現，0809給藥劑量為1mg/kg時，同高劑量一樣(15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)，能抑制病毒感染引起的體重降低，如圖2(a)，並能提供100％的保護，見圖2(b)。0809抗體四個劑量組(15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg)均能100％保護小鼠，因此在圖2(b)中顯示代表這四組的小鼠存活曲線完全重疊在一起。

(2)肺中病毒滴度的測定

感染後3天和5天的小鼠肺組織勻漿機磨成勻漿後，2000rpm，4℃，10min離心，取離心後的上清，按10倍倍比稀釋後加入pbs洗兩次的96孔板培養的mdck細胞，每孔100μl，每個梯度3個復孔。37℃，5％co2培養箱培養72h，每天觀察細胞病變，並與第3天測定血凝試驗結果，用reed-muench方法計算肺的tcid50。結果表明，在感染後3天(圖3(a))，0809igg能夠中和小鼠體的b/lee/1940病毒，抑制病毒在小鼠肺內的複製，15mg/kg、10mg/kg和5mg/kg組同陰性抗體對照組(10mg/kg劑量)相比，差異極其顯著(***p<0.001)，而1mg/kg劑量，差異也顯著(*p<0.05)。在感染後5天(圖3(b))，15mg/kg、10mg/kg和5mg/kg的0809igg處理組小鼠的肺部病毒已經完全清除，而1mg/kg組還有些許病毒，但是同陰性抗體組相比，病毒滴度還是有所降低，差異顯著(*p<0.05)。

通過上述實施例可以看出，本發明所述抗體能夠很好的中和yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，該抗體能抑制b型流感病毒凝集雞紅細胞的能力，是血凝抑制抗體；且所述抗體能抑制b型流感病毒在小鼠體內的複製，抑制b型流感病毒感染小鼠引起的體重下降，保護小鼠在b型流感病毒感染後仍有100％存活率，具有重要的經濟和社會意義。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細結構特徵，但本發明並不局限於上述詳細結構特徵，即不意味著本發明必須依賴上述詳細結構特徵才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。