Cre重組酶重組基因及Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體的製作方法

2023-08-13 05:39:56

專利名稱：Cre重組酶重組基因及Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種Cre重組酶重組基因及植物表達載體。
背景技術：
轉基因植物(transgenic plants)是指利用生物轉基因技術，將從動物、微生物、 人類、遠緣植物中提取的或人工合成的目的基因導入植物細胞或組織，並使其表達而產生 理想性狀的植物。隨著轉基因技術的發展，轉基因植物無論是在品種數量上還是在種植面 積上都發展得非常迅猛，其遍布範圍幾乎波及了整個地球。隨著轉基因植物進入人們生活 的方方面面，隨之而來的是人們對轉基因植物的安全性的質疑，其主要原因是由於轉基因 植物中標記基因的存在。標記基因是一種用來篩選和鑑定轉化的細胞、組織和轉基因植株 的DNA片段。它們主要來源於動植物，有些甚至來自細菌、病毒和其他生物體。標記基因用於幫助在植物遺傳轉化中篩選和鑑定轉化的細胞、組織和再生植株。 在選擇壓力下不含標記基因及其產物的非轉化細胞和組織死亡，轉化細胞由於有抗性，可 繼續成活、分裂並分化成植株。因此，標記基因的存在方便了植物的遺傳轉化；但獲得轉化 植株後，特別是在轉基因產品的產業化過程中，標記基因的存在是多餘的，甚至是有害的， 並具有一定的潛在危險，例如①轉基因植物本身可能變為雜草或通過雜交等方式使野生 近緣種變為雜草；②標記基因傳播到其他生物體中會引發生態失衡，如產生超級害蟲等； ③轉基因植物的標記基因及其產物可能對人或動物的健康有害；④篩選劑影響轉化細胞的 增殖及分化；⑤相同的標記基因向植物疊加外源標記基因可能被轉移到人或動物腸道寄生 菌中而產生耐藥性，降低或喪失某種抗生素的治療作用。所以，目前本領域技術人員採用共 轉化法、位點特異性重組系統、轉座子法、同源重組作用等手段去除轉基因植物中的標記基 因。現有去除轉基因植物中標記基因的方法中應用最早、最廣泛、也最深入的是位點特異性 重組系統中的Cre/loxP位點特異性重組系統，由於目前尚未在真核生物中發現類似的DNA 重組酶，所以將原核生物的重組酶及其相應的識別位點導入到真核生物中可實現真核生物 基因組中相應的DNA片段的定位、刪除和倒位等，但由於Cre/loxP位點特異性重組系統具 有可逆性，導致其刪除效率降低。Wierz誘變分析研究發現，對酶分子活性區域的胺基酸進 行突變，結果Cre酶活性喪失或降低。Schaikh等研究得到3個Cre重組酶的突變體，將 Ala36突變為Val、Thr41突變為Phe、Gly314突變為Arg，結果發現這3個突變體均不能進 行DNA鏈的切割。

發明內容
本發明的目的是為了解決現有Cre/loxP位點特異性重組系統去除轉基因植物中 標記基因的方法中因Cre/loxP位點特異性重組系統具有可逆性，導致其刪除效率降低的 問題，而提供的一種Cre重組酶重組基因及Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體本發明Cre重組酶重組基因命名為crein基因，crein基因的DNA序列如SEQ IDNO 1所示。本發明Cre重組酶重組基因crein基因的長度為1222bp，本發明crein基因 將內含子intron (AF354045. 1)引入ere基因內部，基因的頭部位置為ere基因的前3個鹼 基、之後為TC+內含子intron(AF354045. 1)序列、再後為ere基因的後1027個鹼基。 本發明Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體包含標記基因bar、crein基 因、熱激啟動子hsp和組成型啟動子CaMV35S，標記基因bar和crein基因共同位於2個同 向的IoxP位點內，其中crein基因由熱激啟動子hsp驅動，標記基因bar由組成型啟動子 CaMV35S 驅動。本發明crein基因可用於Cre/loxP位點特異性重組系統，本發明應用crein基因 進行植物的遺傳轉化，通過半定量RT-PCR方法檢測，Cre的表達效率提高了 10 % 20 %，此 夕卜，由於crein基因在ere內部引入了 190bp的內含子序列，因此避免了其在原核生物(如 大腸桿菌和農桿菌)中的滲漏表達，從而為其與IoxP位點共同存在於一個系統中的操作提 供了便利。本發明Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體的特點是在正常的生長發育 溫度下熱激啟動子hsp不具啟動子活性，表現為對除草劑的抗性；而多克隆位點的存在允 許了外源目的基因的組裝，允許選擇抗性基因和目的基因協同進入到宿主細胞當中。因 此，當本發明Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體轉化完成以後，可以用熱激處理 (42 °C)的方法，去除選擇標記基因。Cre作為一種重組酶，為了防止其在植物當中再次發生 整合反應，在去除標記基因的同時，它也一併從植物基因組中自身刪除。利用本發明構建的Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體可以在轉基因當 代利用除草劑進行轉基因植株的篩選，而且當轉化完成後即可通過1 3h的42°C熱處理去 除標記基因，而不必通過雜交、共轉化等方式，從而達到獲得轉基因安全性植株的目的。利用本發明構建的Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體獲得的轉基因植 物在保證了轉基因82. 6%以上成功表達的同時，通過熱激處理可將70%以上的標記基因 刪除，沒有可逆性，避免了安全隱患。


圖1是具體實施方式
三步驟c中將crein基因連接到PGEM-T Easy載體上的載體 構建示意圖。圖2是具體實施方式
三步驟c中重組質粒pT-Crein與載體phsp-Cre構建載 體phsp-Crein的示意圖。圖3是具體實施方式
三步驟c中啟動子_除草劑抗性基因_終 止序列連接到PGEM-T Easy載體上的載體構建示意圖。圖4是具體實施方式
三步驟c中 構建質粒PG1-GUS』的示意圖。圖5是具體實施方式
三步驟c中用質粒pGl-GUS』與重組 質粒pT-35Sbar構建載體pGl-bar的示意圖。圖6是具體實施方式
三步驟c中構建載體 pGl-bar-Crein的示意圖。圖7是具體實施方式
三步驟c中用載體pGl-bar-Crein構建載體 pGl-bar-Crein，的示意圖。圖8是具體實施方式
三步驟c中構建載體p3300-gl-bar-Crein， 的示意圖。圖9是具體實施方式
三擬南芥的遺傳轉化及再生實驗中轉基因擬南芥在含有除 草劑的MS培養基上的篩選情況圖。圖10是具體實施方式
三擬南芥的遺傳轉化及再生試驗 中轉基因擬南芥植株PCR檢測結果圖，圖10中「M」泳道標樣為Marker，「l」至「11」泳道標 樣為轉基因擬南芥植株，「 12」泳道標樣為陽性對照，「 13」泳道標樣為負對照，「 14」泳道標 樣為陰性對照。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式Cre重組酶重組基因命名為crein基因，crein基因 的DNA序列如SEQ ID NO :1所示。本發明Cre重組酶重組基因crein基因的長度為1222bp， 基因的頭部位置為ere基因的前3個鹼基、之後為TC(將原第4和第5位鹼基替換為TC) + 內含子intrOn(AF354045. 1)序列、再後為ere基因的後1027個鹼基。 為克隆本實施方式Cre重組酶重組基因——crein基因，本實施方式設計引物 08creinl :5，-GCTCTAGAATGAGGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTC-3，引物 crein2 :5，-TTGGTGTAC GGTCAGTAAATTGCTGTAACTATCATCATCATCAT-3，；和引物 cre3 5 』 -GAGCATGCCTAATCGCCATCTTCC AGCA-3，。引物OScreinl中下劃線部分為XbaI識別位點，引物cre3中下劃線部分為SphI 識別位點。步驟a 擴增內含子intron序列以植物表達載體 pCAMBIA1305. 1 (含 intron，AF354045. 1)為模板、引物 08creinl 和引物crein2為引物進行PCR擴增反應，PCR擴增體系為20 μ L 由2. 0 μ L 10XPCR buffer、2. 0μ L 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、0. 2 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、l μ L 濃度為 10mmol/L 的引物08creinl、ly L濃度為 10mmol/L 的引物 crein2、0. 2 μ L濃度為 lOOng/μ L 的植物表達載體PCAMBIA1305. 1、0· 2 μ L濃度為2. 5U/ μ L的Pfu酶和餘量的ddH20組成； PCR擴增條件為94°C預變性7min ； (94°C變性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s) 30個循環； 72°C延伸7min ；所得PCR產物命名為pfu 1305. 1。步驟b、以質粒ρ匪23為模板、pful305. 1為引物對ere基因進行單引物擴增，PCR 擴增體系為 20μ L 由 2. 0μ L 10XPCR buffer、2. 0 μ L 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、0. 2 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、0. 5 μ L 濃度為 20ng/ μ L 的 pful305. 1、0· 2 μ L 濃度為 20ng/ μ L 的質粒ρ匪23、0. 2 μ L濃度為2. 5U/ μ L的Pfu酶和餘量的ddH20組成；PCR擴增條件為94°C 預變性7min ;(94°C變性30s、52°C退火40s、72°C延伸2. 5min) 5個循環；即獲得了 crein基 因。步驟a、b擴增產物用質量濃度為的瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳檢測，電泳緩衝 液為1XTAE，保持100V恆壓(4 5V/cm)，電泳時間為30min。步驟c、取IyL步驟b擴增產物(crein基因)為模板、引物08creinl和引物cre3 為引物進行全長crein基因的雙引物擴增PCR擴增體系為 20μ L 由 2. 0μ L 10XPCR buffer、2. 0 μ L 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、0. 2μ L濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、ly L濃度為 10mmol/L 的引物 08creinl、1 μ L濃度 為 10mmol/L 的引物 cre3、0. 2μ L crein 基因(濃度約為 20ng/μ L)、0. 2 μ L 濃度為 2. 5U/ μ L的pfu酶和餘量的ddH20組成；PCR擴增條件為94°C變性7min，94°C變性20s、56°C退火 30s、72°C延伸lmin，30個循環，72°C延伸7min ；即得到Cre重組酶重組基因——crein基 因。步驟c擴增產物用質量濃度為1 %的瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳檢測，電泳緩衝液為1XTAE，保持IOOV UB (4 5V/cm)，電泳時間為30min。本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態細胞和質粒等均容易購得，若無特殊 要求則濃度為產品標註濃度。本實施方式中的操作步驟參見試劑盒使用操作手冊。
本實施方式步驟a所得產物pful305. 1是具有cre5』的內含子序列，步驟b以步 驟a PCR反應產物為弓I物進行全長crein基因的擴增，此步驟以含有ere基因的質粒ρ匪23 為模板，以pful305. 1為引物，但由於是單引物擴增，PCR產物量少，加之對此步驟進行優化 非常困難，所以本實施方式少數幾個循環獲得一定的模板即crein基因後終止反應，進入 到步驟c，進行crein基因的雙引物即指數擴增。基因製備過程很完整，沒有問題。
具體實施方式
二 本實施方式Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體包含 標記基因bar、crein基因、熱激啟動子hsp和組成型啟動子CaMV35S，標記基因bar和crein 基因共同位於2個同向的IoxP位點內，其中ere in基因由熱激啟動子hsp驅動，標記基因 bar由組成型啟動子CaMV35S驅動。本實施方式crein基因可用於Cre/loxP位點特異性重組系統，本實施方式應用 crein基因進行植物的遺傳轉化，通過半定量RT-PCR方法檢測，ere的表達效率提高了 10% 20%。此外，由於crein基因在ere內部引入了 190bp的內含子序列，因此避免了其 在原核生物(如大腸桿菌和農桿菌)中的滲漏表達，從而為其與IoxP位點共同存在於一個 系統中的操作提供了便利。本實施方式Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體的特點是在正常的生長 發育溫度下熱激啟動子hsp不具啟動子活性，表現為對除草劑的抗性；而多克隆位點的存 在允許了外源目的基因的組裝，允許選擇抗性基因和目的基因協同進入到宿主細胞當中。 因此，當本實施方式Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體轉化完成以後，可以用熱 激處理(42°C)的方法，去除選擇標記基因。Cre作為一種重組酶，為了防止其在植物當中 再次發生整合反應，在去除標記基因的同時，它也一併從植物基因組中自身刪除。利用本實施方式構建的Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體可以在轉基 因當代利用除草劑進行轉基因植株的篩選，而且當轉化完成後即可通過1 3h的42°C熱 處理去除標記基因，而不必通過雜交、共轉化等方式，從而達到獲得轉基因安全性植株的目 的。
具體實施方式
三本實施方式Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體的按 以下步驟構建步驟a、熱激啟動子Gmhsp 17. 5 (hsp)的獲得①設計PCR反應引物引物 hspl :5，-CATAAGCTTTTTCCACTTCAATTCCTCCTCT-3『；引物 hsp2 :5，-GTTCTAGATGAGATCGCAAACAGGTAACTT-3『；引物hspl中下劃線部分為HindIII識別位點，引物hsp2中下劃線部分為XbaI識 別位點。②PCR擴增反應PCR擴增體系為 20μ L 由 2. 0μ L 10XPCR buffer、2. 0 μ L 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、0. 2 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、l μ L 濃度為 10mmol/L 的引物 hspl、1 μ L 濃度為 10mmol/L的引物hsp2、0. 2μ L大豆基因組DNA(濃度約為IOOng/μ L)、0· 2 μ L濃度為2. 5U/μ L的Pfu酶和餘量的ddH20組成；PCR擴增條件為94°C變性lOmin，94°C變性lmin、46°C退 火 lmin、72°C延伸 Imin, 30 個循環，72°C延伸 IOmin0步驟b、獲得啟動子-除草劑抗性基因_終止序列(CaMV35S-bar-TnOS)①設計PCR反應引物引物 SMbar3 :5，-CGAAGCTTTATTGGCTAGAGCAGCTT-3』 ；引物 SMbar4 :5，GACCCGGGGTACTGAATTAACGCCGA-3』 ； 引物SMbar3中下劃線部分為EcoR I識別位點，引物SMbar4中下劃線部分為Sma I識別位點。②PCR擴增反應PCR擴增體系為 20μ L 由 2. Ομ L IOXPCR buffer、2. O μ L 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、0. 2 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、l μ L 濃度為 10mmol/L 的引物 SMbar3、l μ L 濃度 為 10mmol/L 的引物 SMbar4、0. 2μ L 質粒 pCAMBIA3301 (含 CaMV35s-bar-Tnos，AF354045. 1) (濃度約為20ng/ μ L)、0. 2 μ L濃度為2. 5U/ μ L的tag酶和餘量的ddH20組成；PCR擴增條件 為 94°C變性 7min，94°C變性 30s、52°C退火 30s、72°C延伸 3min，30 個循環，72°C延伸 7min。步驟C、構建轉基因安全性植物表達載體①構建載體pGl-bar採用Pst I酶對質粒pGl-GUS (質粒pGl-GUS由北京大學生命科學學院林忠平教授 饋贈)進行酶切，回收酶切片段Gl-GUS後用T4-DNA聚合酶補平，再利用T4-DNA連接酶進行 自連(如圖4所示)，轉化大腸桿菌DH5ci，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶切鑑定後得 到所需的重組質粒，該質粒中PstI酶切位點消失，被命名為質粒pGl-GUS』 ；(質粒pGl-GUS 有一個Pst I酶切位點，該Pst I酶切位點不是多功能酶切位點)；將步驟b獲得的啟動子_除草劑抗性基因_終止序列(CaMV35S-bar-TnOS)連接 到pGEM-T Easy載體上(如圖3所示)，然後轉化到大腸桿菌DH5 α中，挑取轉化克隆培養 並提取質粒，經酶切、PCR鑑定後得到所需的重組質粒，被命名為pT-35Sbar ；用Sma I酶與EcoR I酶分別對質粒pGl_GUS』與重組質粒pT_35Sbar進行雙酶切 (在質粒pGl-GUS，的GUS基因片段兩端與重組質粒pT-35Sbar的CaMV35s-bar_Tnos基因 片段兩端均有一個Sma I酶切位點和一個EcoR I酶切位點)，酶切後回收質粒pGl-GUS』中 較大的片段(作為此步構建的連接載體)和CaMV35S-bar-Tn0S片段(作為此步構建的目的 片段)，然後利用T4-DNA連接酶進行連接(如圖5所示)，轉化大腸桿菌DH5 α，挑取轉化克 隆培養並提取質粒，經酶切鑑定和PCR鑑定後得到所需的重組質粒，即得到載體pGl-bar。②構建載體phsp-cre本實施方式步驟a中所得的PCR產物熱激啟動子hsp與質粒ρ匪23用酶Xba I與 酶HindIII分別進行雙酶切(質粒ρΜΜ23的CaMV35S啟動子和hsp片段兩端分別具有一個 Xba I酶切位點和HindIII酶切位點)，然後回收質粒pMM23酶切大片段(作為此步構建的 載體)，與酶切後的hsp (作為此步構建的目的片段)用T4-DNA連接酶進行連接，轉化大腸 桿菌DH5 α，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶切鑑定後得到所需的重組質粒，即為載體 phsp-Creο③構建載體phsp-Crein將crein基因連接到pGEM_T Easy載體上(如圖1所示)並轉化到大腸桿菌DH5a中，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶切鑑定後得到所需的重組質粒，被命名為 pT-Crein.；用Xba I和Sph I分別對重組質粒pT-Crein與載體phsp-Cre進行雙酶切(重組 質粒pT-Crein的crein基因片段的兩端與載體phsp-Cre的ere基因片段的兩端均具有Xba I和SphI酶切位點)，然後回收重組質粒pT-Crein酶切的crein基因片段(作為此步構建 的目的片段)和酶切載體phsp-Cre中較長片段(作為此步構建的連接載體)，再用T4-DNA 連接酶進行連接(如圖2所示)，轉化大腸桿菌DH5a，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶 切、PCR鑑定後得到所需的重組質粒，即為載體phsp-Crein。④構建載體pGl-bar-Crein (如圖6所示)用EcoR I酶對步驟c①中構建的載體pGl-bar (載體PGI-bar中具有一個 EcoR I酶切位點和一個Hindlll酶切位點)進行單酶切，回收酶切產物純化後用Klenow Fragment進行補平，再用Hindlll進行酶切，回收EcoR I酶切位點消失的大片段(作為此 步構建的連接載體)；
用Sac I 酶對質粒 phsp-Crein (載體 phsp-Crein 中 hsp-Crein-Tnos 片段兩端具 有Sac I與Hindlll酶切位點)進行單酶切並回收酶切產物，經純化後用T4-DNA聚合酶補 平，再用Hindlll進行酶切，回收Sac I酶切位點消失的hsp-Crein-Tnos片段(作為此步 構建的目的片段)；將本步驟回收的連接載體和目的片段用T4-DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌 DH5 a，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶切、PCR鑑定後得到所需的重組質粒，即為載體 pGl-bar-Crein。⑤構建載體p3300-gl-bar-Crein，(如圖 8 所示)用Hindlll酶對載體pGl-bar-Crein進行酶切，純化後用Klenow Fragement進行 補平(因此Hindlll酶切位點在該載體中消失)，再用T4-DNA連接酶進行連接(如圖7所 示)，轉化大腸桿菌DH5 a，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶切、PCR鑑定後得到所需的 重組質粒，即得到載體pGl-bar-Crein，；本實施方式中以pCAMBIA3300為轉基因安全性植物表達載體的基本骨架，用Xho I酶對pCAMBIA3300進行酶切，純化後用Klenow Fragement補平，再利用Sac I酶進行酶 切，回收酶切大片段作為構建安全性植物表達載體的連接載體；對含有目片段的載體pGl-bar-Crein，用Spe I酶切、純化後用KlenowFragement 補平再利用Sac I酶進行酶切，得到連接目的片段；將本步驟回收的連接載體和連接目的片段用T4-DNA連接酶進行連接，轉化大腸 桿菌DH5 a，挑取轉化克隆培養並提取質粒，經酶切、PCR鑑定後得到所需的重組質粒，即為 Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體p3300-gl-bar-Crein，。本實施方式步驟a中以大豆基因組DNA為模板、引物hspl和引物hsp2為引物擴 增大豆Gmhsp 17. 5熱激啟動子，得到長度為520bp的熱激啟動子片段，被命名為hsp。本實施方式步驟b 中以質粒 pCAMBIA3301 (含 CaMV35s-bar-Tnos，AF354045. 1)為 模板，PCR 擴增得到 CaMV35s-bar-Tnos。用本實施方式獲得的Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體 p3300-gl-bar-Crein』轉化根癌農桿菌，步驟如下所示
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—、氯化鈣法製備根癌農桿菌感受態細胞a.從LB平板(含50 μ g/mL利福平)上挑取新鮮的根癌農桿菌EHA105的單菌落， 接種於IOmL利福平濃度為50 μ g/mL的LB液體培養基中，在200r/min、28°C條件下振蕩培 養 48h ； b.取根癌農桿菌對數生長期菌液，按1 20的體積比接種於50mL利福平濃度為 50 μ g/mL的LB液體培養基中，在200r/min、28°C條件下振蕩培養至OD6tltl = 0. 5(約培養 4h)；c.菌液冰浴30min，分裝至離心管(容積為1. 5mL)中以4000r/min離心6分鐘，棄 去離心上清液，用600 μ L滅菌的濃度為0. lmol/L的CaCl2溶液重懸細胞沉澱，冰浴30min ；d.在4000r/min條件下離心10分鐘，棄去離心上清液，用100 μ L滅菌的濃度為 0. lmol/L的CaCl2 (加入體積佔15%的滅菌甘油)溶液重懸菌體；即得到根癌農桿菌感受 態細胞。二、根癌農桿菌轉化a.將IyL本實施方式構建的Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體 p3300-gl-bar-Crein』加入到100 μ L的根癌農桿菌感受態細胞中，輕輕混勻，冰上放置 30min，再置於液氮速凍6分鐘，然後37°C溫浴30min ；b.加入體積為800 μ L的無抗生素的LB液體培養基中，在200r/min、28°C條件下 輕搖4h，消除感受態；C.取100 μ L步驟b製備的菌液，均勻的塗布在利福平濃度為50 μ g/mL和卡那黴 素濃度為50 μ g/mL的固體LB培養基的平板上，封口膜後於28°C的恆溫箱中倒置培養36 48h，經PCR鑑定及酶切鑑定，得到pGl-bar-Crein，-gus轉化的根癌農桿菌。轉基因試驗擬南芥的遺傳轉化及再生(1)擬南芥的種植a.將種子置於冰箱4°C的環境內放置2 3天進行春化處理；b.在溫度24 28°C，空氣溼度為70% 90%的溫室中光照16h/天，光照強度為 4000LUX ；將草炭和矽石按1 1的體積比裝入營養缽中並澆透水，將擬南芥的種子與細沙 混勻後均勻的播種於澆透水的營養缽中，不覆土 ；用無紡布覆蓋營養缽約一周左右，即可出 苗，揭去無紡布，每隔2 3天澆一次透水即可；c.當植株長至莖高約3cm，去除其頂生花序，以刺激腋生花序的生長，從而增加花 的數量，注意避免傷及腋生花序；待腋生花序長出，其下部的花已有授粉現象出現時進行轉 化，轉化前，將已授粉的花以及果莢除掉。(2)製備轉化用的農桿菌菌液挑取p3300-gl-bar-Crein』轉化的根癌農桿菌的單菌落接種於IOmL利福平濃度 為50 μ g/mL和卡那黴素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養基中，在200r/min、28°C條件下振 蕩培養48h，使菌體生長至對數生長後期(0D_ = 1. 5 2. 0)；培養液按1 100稀釋，再 接種到50mL利福平濃度為50 μ g/mL和卡那黴素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養基中，於 200r/min、28°C條件下振蕩培養至菌體生長至對數後期(OD6tltl = 1. 5 2. 0，時間約為24h)； 終止培養後以4000r/min離心IOmin收集菌體，用MS液體培養基懸浮菌體(OD6tltl = 0. 7左右)；即得到農桿菌花序浸染液(應立即進行花序浸泡轉基因實驗)。(3)農桿菌花序侵染法轉化 在上午10點到下午1點開花盛期，除去花序上未開放的花蕾和以前已開放的花 朵，留下正在開放的花朵和即將開花的擬南芥植株倒置，使花蕾朝下並浸入農桿菌花序浸 染液中，浸泡約15min ；轉化後將植株平放，並覆上保鮮膜，在黑暗條件下放置24小時，然後 置於正常光照條件下生長，一周後選植株開花旺盛的時候可再轉化一次(方法同上)，以提 高轉化效率，直至收穫種子。(4)轉基因植株的分析a.收穫經農桿菌轉化的擬南芥種子，乾燥後於4°C的冰箱內放置2 4天，進行春 化作用；b.種子處理種子用體積濃度為70%酒精消毒30s，再用質量濃度為10%的NaClO消毒15min， 期間不斷搖晃，然後用滅菌水衝洗3 4遍；再將種子均勻播種到1/2MS培養基上(篩選 培養基的PPt濃度為3. Omg/L)，放到培養室培養(光照16h/天，溫度為25°C、溼度50% 70%) ；7天後可用於檢測判斷轉基因植株。本實施方式擬南芥的遺傳轉化及再生獲得的轉基因擬南芥在含有除草劑的MS培 養基上的篩選情況(如圖9所示，黃色枯萎的為未轉化植株，綠色生根的為轉基因植株，箭 頭標出了轉基因植株)。對本實施方式轉基因擬南芥植株進行PCR檢測，檢測結果如圖10所示。轉化Cre/ IoxP介導的轉基因安全性植物表達載體p3300-gl-bar-Crein』的擬南芥轉基因植株中 90. 9%擴增出大小為1032bp (去除內含子)的條帶，說明90. 9%轉基因成功。將轉基因成功的轉基因擬南芥進行選擇標記基因去除試驗轉基因當代擬南芥植株熱激處理選擇6個單拷貝轉基因植株繫於42°C熱激處理 2h，共處理三次，每次處理間隙在25°C條件下恢復培養12h。熱激處理後在25°C、光照16h/ 天的條件下任其生長開花結實。取其種子在含有除草劑的MS培養基上進行生根試驗，觀察 標記基因的刪除情況(並以該6個轉基因植株系未熱激處理作為對照)如表1所示。表 1 注HS為熱激誘導，NHS為未誘導。轉基因子代擬南芥植株熱激處理選擇3個單拷貝轉基因植株系25°C、光照16h/ 天的條件下任其生長開花結實。分別取各株系的種子在28°C萌動24h，然後在42°C熱激處 理2h，再在28°C條件下恢復培養24h，如此熱激處理和恢復培養循環往復至萌發。然後在含 有除草劑的MS培養基上進行生根試驗，觀察標記基因的刪除情況(並以該3個轉基因植株 系未熱激處理作為對照)如表2所示。表2 注HS為熱激誘導，NHS為未誘導。表1和表2的試驗數據說明對轉基因當代以及轉基因後代(子代)擬南芥植株進 行熱激處理，標記基因即發生了自刪除，如此轉基因後代只含有目的基因而不含有標記性 狀，可認為利用本實施方式Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體進行轉基因是安 全的。
權利要求
Cre重組酶重組基因，其特徵在於Cre重組酶重組基因命名為crein基因，crein基因的DNA序列如下所示ATGTCGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAGCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATGGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAGTTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATTAG。
2.Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體，其特徵在於Cre/loxP介導的轉基 因安全性植物表達載體包含標記基因bar、crein基因、熱激啟動子hsp和組成型啟動子 CaMV35S，標記基因bar和crein基因共同位於2個同向的IoxP位點內，其中crein基因由 熱激啟動子hsp驅動，標記基因bar由組成型啟動子CaMV35S驅動。
全文摘要
Cre重組酶重組基因及Cre/loxP介導的轉基因安全性植物表達載體，它涉及一種Cre重組酶重組基因及植物表達載體。它解決了現有Cre/loxP位點特異性重組系統去除轉基因植物中標記基因的方法中因Cre/loxP位點特異性重組系統具有可逆性，導致其刪除效率降低的問題。crein基因序列如SEQ ID NO1所示。本發明載體包含標記基因bar、crein基因、熱激啟動子hsp和組成型啟動子CaMV35S。本發明可提高轉基因植物的安全性。
文檔編號C12N15/52GK101845445SQ20101010577
公開日2010年9月29日 申請日期2010年2月4日 優先權日2010年2月4日
發明者徐亞英, 王勇, 陳典 申請人:東北農業大學