一株酵母菌及其在脫色中的應用的製作方法

2023-08-02 03:31:56

專利名稱：一株酵母菌及其在脫色中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株酵母菌及其在脫色中的應用，特別是涉及一株熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis)及其在脫除生產、汙水等體系中的偶氮染料中的應用。
背景技術：
隨著染料合成、印染等工業廢水的不斷排放，進入環境的染料數量和種類不斷增 加，造成的環境汙染日益嚴重。其中，偶氮染料佔世界每年染料總產量的70%左右，是工業 染料中用量最大的一類。染料廢水具有色度大、有機物濃度高、組分複雜、難降解物質多以 及含有大量無機鹽等特點，屬於難處理的工業廢水。我國作為一個紡織和印染大國，染料廢 水的處理問題一直沒有得到很好地解決。處理染料廢水的常用的方法有物化法和生物法。由於化學法和物理法處理染料廢 水的過程中存在著諸如二次汙染、處理費用過高、技術要求高、操作不方便等缺點，近年來 發展起來的生化處理即採用微生物法降解染料分子和有機物受到廣泛的關注。酵母菌既具有細菌單細胞、生長快、能形成很好的絮體、適應於各種不同的反應 器等特點，又具有真菌細胞大、代謝旺盛，能抵禦不良環境等特性，因而可應用於多種難處 理有機廢水，例如用於處理啤酒廢水、味精廢水、食品加工廢水、含油廢水等。近年來，酵母 菌在染料廢水脫色方面的作用也開始得到人們的關注。例如D0nmez報導了一株熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis)對3種活性染料(活性蘭、活性黑和活性紅)有一定的吸附 脫色作用，吸附容量達到 100mg/g(Enyme and MicrobialTechonolgy, 2002, 30 :363_366)， 中國發明專利ZL 02160202報導了一株產錳依賴過氧化酶的酵母菌Debaryomyces polymorphus，對活性黑5能有效脫色，脫色率達到99%，對其他多種染料也有70-80%的脫 色率。中國發明專利ZL 200510053675報導了一株酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 在好氧條件下能對染料有效脫色；而Arora卻報導了一株在厭氧條件能對染料脫色的酵母 菌Candida tropicalis，在120內的脫色率為90-92%，該菌的耐受的染料濃度僅為50mg/ L(Colorat ion Technology，2005，121 :298_303)。儘管如此，酵母菌目前在偶氮染料廢水處理方面的應用仍非常有限，原因是存在 以下幾個主要的缺點1、脫色作用大都是通過菌體對染料的吸附作用實現的，不能將染料進一步降解和 徹底礦化。2、缺乏高效的的降解菌株。大多數單株菌落的廣譜性較差，只能作用少數結構簡 單的染料分子；並且脫色速率不能滿足實際廢水的處理要求。3、對環境的適應性不強。大多數菌株的耐鹽性或耐鹼性不強，在高鹽濃度下菌體 的生長能力和脫色降解能力迅速降低。

發明內容
本發明的目的是提供一株能在高鹽極端環境下吸附、降解偶氮染料的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)及其應用。該酵母菌除了對染料有吸附作用外，還可以還原偶氮 鍵，進一步將染料降解。本發明所提供的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)菌株，是熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis) YL3-1，該菌株已於2009年11月09日保藏於中國普通微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3432。在固體培養基裡，該菌菌落呈乳白色，表面皺褶、稍乾燥，菌落大而厚，易挑起，呈 現典型的酵母菌菌落。該菌株的18s rDNA序列如序列表中序列1所示；其26s rDNA序列 如序列表中序列2所示。本發明所提供的應用是所述的脫色酵母菌在對含偶氮染料的體系進行脫色中的 應用；即在脫除生產、汙水等體系偶氮染料中的應用，如紡織廢水、印染廢水及其與染料生 產和使用相關的工業廢水的脫色。上述偶氮染料為酸性大紅GR和/或酸性黑ATT和/或直接耐曬黑SA和/或直接 紫N和/或活性黑KN-B和/或鹼性橙和/或鹼性棕和/或直接大紅C和/或直接橙S和 /或酸性橙74和/或活性藍和/或UNISOL SCARLET 3GS (尤納素猩紅3GS)和/或UNISOL RED6GN (尤納素紅6GN)。上述含偶氮染料的體系所述偶氮染料濃度一般可為50-1000mg/L。上述應用中，所述脫色的方法是利用該菌株對染料進行同步培養脫色，即酵母菌 的好氧培養與其對染料的脫色同步進行，即將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)CGMCC No. 3432接種於含偶氮染料的體系中，在溫度條件為25-40°C，好氧條件下進行培養。所述 溫度條件優選為30°C。上述含偶氮染料的體系中還含有NaH2PO4 0. 5_1. 5g/L，K2HPO4 l_3g/L，(NH4)2SO4 0. 5-2g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 05-0. 5g/L，葡萄糖 2_15g/L，NaCl l_30g/L ；優選含有 NaH2PO4 lg/ L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L。上述熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CGMCC No. 34322 的培養時間為 12_48h， 既可達到脫色的效果，也可以有一個較大脫色速率。本發明提供的熱帶假絲酵母菌株Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432用於 紡織廢水、印染廢水及其與染料生產和使用相關的工業廢水的脫色，可利用該菌株對染料 進行同步培養脫色，即酵母菌的好氧培養與其對染料的脫色同步進行。本發明提供的熱帶假絲酵母菌株Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432，可 在酸性，鹼性，高鹽等極端的環境下生長並降解偶氮染料，可以在NaCl濃度為10-15% (質 量百分比)的高鹽度染料廢水中發揮有效的脫色作用，內發揮有效的脫色作用，對酸性，鹼 性染料均可降解，在好氧條件下能對多種偶氮染料脫色，特別是對酸性偶氮染料大、直接偶 氮染料、活性偶氮染料的脫色尤其有效。實驗證明在12h 內，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 對酸性偶氮染料 如酸性大紅GR、酸性黑ATT的脫色率可以達到98% ；對直接偶氮染料如直接耐曬黑SA、直 接紫N的脫色率高於96 %，對於活性偶氮染料如活性黑KN-B的脫色率能達到97 %以上；在 24h內，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432對鹼性偶氮染料如鹼性橙、鹼性棕的脫 色率分別達到97 %和85 %，對於直接大紅C和直接橙S的脫色率達到96 %，對酸性橙74和 活性藍的脫色率分別達到87%和85%。對於結構未發表的進口偶氮染料UNISOL SCARLET
43GS, Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 在 4h 內脫色率高達 97% 以上，6h 內完全 脫色。本發明的酵母菌株可以對含NaCl濃度為(質量百分比)的高 鹽度染料廢水發揮有效的脫色作用。實驗證明12h，在10%的NaCl濃度下，Candida tropicalisYL3-lCGMCC No. 3432對酸性大紅GR的脫色率達到93% ；在15%的NaCl濃度 下，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 對酸性大紅 GR 的脫色率達到 86%。總之，本發明提供的Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432酵母菌株，具有廣 譜的偶氮染料脫色降解能力，能夠作用於多種不同結構的偶氮染料，脫色能力強。該菌株 培養方法簡單，生長速度快，對環境的適應性強，可以對高鹽度的偶氮染料廢水進行有效脫 色。該菌株用於印染廢水以及與染料使用相關的工業廢水的脫色，可解決已有技術中存在 的問題，具有工業化應用前景。


圖 1 為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 34322 的篩選過程圖 2 為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 34322 在好氧條件下 對不同濃度的酸性大紅GR的脫色圖 3 為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 在好氧條件下 對不同染料的脫色圖 4 為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 對酸性大紅 GR 脫色後中間代謝物的GC/MS色譜分析
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 34322 的分離、純
化及鑑定。本發明提供的熱帶假絲酵母菌的篩選過程為從印染廢水處理廠取得活性汙泥樣 品，按照圖1所述的流程進行篩選，其具體篩選步驟如下從浙江某印染廠廢水池中提取汙泥，稱量Ig用玻璃珠打散後以100ml無菌水攪 勻，取3-4ml的液體接入滅過菌的富集培養基中，30°C、170轉培養12h，將富集樣品製成 IO-1UO-2UO-^ 10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7共7稀釋度，每個稀釋度吸取0. 2ml塗布於染料培養基平 板上在30°C靜置培養24h，挑取有脫色圈的菌落並在染料培養基平板上純化三次，純化後 獲得單菌株。將挑取的脫色菌株接種於含50mg/L酸性大紅GR的液體培養基中在30°C，170 轉培養，每隔2h取樣測定脫色率，挑取在液體培養基中能完全脫色並且菌體不吸附染料的 菌株並對其進行鑑定。上述的富集培養基成分為酵母粉5g/L，蛋白腖10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 0-7. 0。上述染料培養基成分為=NaH2PO4lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 0-7. 0，酸性大紅 GR 50mg/L。所述染料固體培養基為染料培養基的成分中加入瓊脂。
結果獲得一株菌株，將其命名為YL3-1，在固體培養基裡，該菌菌落呈乳白色，表面 皺褶、稍乾燥，菌落大而厚，易挑起，呈現典型的酵母菌菌落。通過擴增該菌的26srDNA和 18srDNA序列並且在Genbank資料庫中比對，結果表明該菌的26srDNA和18srDNA序列與 熱帶假絲酵母菌的同源性為99%，因此可以認定為該菌為熱帶假絲酵母。熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis) YL3-1的18s DNA如序列表中序列1所示，其26s DNA如序列表中序 列2所示。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)YL3-1已於2009年11月9日保藏於中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中 國科學院微生物研究所)，保藏登記號為=CGMCC No. 3432。實施例2、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 對酸性大紅 GR的脫色效果驗證將熱帶假絲酵母(Candidatropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 接種至裝有 YPD 培 養基的三角瓶中，在溫度設置為30°C，轉速為170rpm的搖床上培養12-16h，按5% (ν/ν)的 接種量分別轉接到不同酸性大紅濃度的GR染料培養基(具體濃度如圖2所示)裡，在溫度 設置為30°C，轉速為170rpm的搖床中以好氧方式(好氧方式是在搖瓶裡震蕩培養)培養 12h。培養結束後，取一定量的培養液加入離心管中，13000rpm離心lOmin，取上清液在 分光光度計上測定在染料最大吸收波長510nm處的OD值，並以不接酵母菌的染料培養基為 對照，計算脫色率。取少量的上清液用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，用旋轉蒸發蒸乾溶劑 後得到黃色晶體，用Iml甲醇溶解後用於色相色譜-質譜分析(GC/MS)。脫色率(%) = (A1-A2)/A1X100Al-脫色前染料培養基的OD值，A2-脫色後染料培養基的OD值上述YPD培養基組成為酵母粉10g/L，蛋白腖20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然。上述酸性大紅染料培養基組成為NaH2PO4lg/L, K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，酸性大紅 GR 50_500mg/L (50mg/L、100mg/L、 150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L 或 500mg/L)。溶劑為水。 未對培養基進行PH值調節。上述培養基均在121°C、0. IMpa下滅菌20min。酸性大紅GR的結構式如(式I)所示。
HO 結果如圖2所示，實驗結果表明，對於酸性大紅濃度低於300mg/L的培養液，24h的 脫色率均達到96%以上。GC/MS分析表明結果如圖2所示。
實施例3、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis) YL3-1 CGMCC No. 3432對直接耐曬 黑SA和鹼性橙的脫色將熱帶假絲酵母(Candidatropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 接種至裝有 YPD 培 養基的三角瓶中，在溫度設置為30°C，轉速為170rpm的搖床上培養12-16h，按5% (ν/ν)的 接種量分別接種至直接耐曬黑SA染料培養基和鹼性橙染料培養基中，在30°C，170rpm條件 下好氧方式培養24h，培養液離心後按照實施例2所述的方法分別在染料的最大吸收波長 處測定OD值並計算相應的脫色率。實驗結果表明，該菌株對50mg/L的直接耐曬黑SA的脫色率為97 %，對50mg/L的 鹼性橙的脫色率為96%。直接耐曬黑SA 染料培養基組成NaH2PO4 lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，直接耐曬黑SA 50mg/L。溶劑為水。培養基 最終PH值為6.8。鹼性橙染料培養基組成=NaH2PO4lg/L, K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，鹼性橙50mg/L。溶劑為水。培養基最終pH 值為7.0。直接耐曬黑SA的結構式如(式II)所示，鹼性橙的結構式如(式III)所示。 實施例4、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 在高鹽環境 下對染料的脫色按照實施例2的方法，將酵母菌株Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432至 裝有YPD培養基的三角瓶中，在溫度設置為30°C，轉速為170rpm的搖床上培養12_16h，按 5% (ν/ν)的接種量分別接種至含NaCl濃度為5%，10%，15% (質量百分比)的高鹽酸性 大紅GR染料培養基中培養24h，培養液離心後分別測定510nm處的OD值，計算脫色率。高鹽酸性大紅染料培養基組成NaH2PO4lg/L, K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，酸性大紅 GR50mg/L，NaCl 濃度為 5%，10%或 15% (質 量百分比)。培養基最終PH值為6. 5。實驗結果表明，在含5 %，10 %，15 %的染料培養基中，該菌對酸性大紅GR的脫色 率分別達到93%，92%和86%。實施例5、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)CGMCC No. 3432對各種染料的脫色
將熱帶假絲酵母(Candida tropical is) YL3-1CGMCC No. 3432在包括以下成分的 培養基進行脫色NaH2PO4 lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L，MgSO4. 7H200. 2g/L，葡萄糖 lOg/L, NaCl 5g/L，染料(染料如圖3所示)濃度50mg/L, pH自然，溶劑為水。按照實施例2的方法，將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) YL3-ICGMCC No. 3432至裝有YPD培養基的三角瓶中，在溫度設置為30°C，轉速為170rpm的搖床上培養 12-16h，按5% (ν/ν)的接種量接種於上述培養基中培養溫度為30°C，培養時間為24h，培養 方式為好氧培養。培養液離心後按照實施例2所述的方法分別在染料的最大吸收波長處測 定OD值並計算相應的脫色率。結果如圖3 所示，實驗證明在 12h 內，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 對酸性偶氮染料如酸性大紅GR、酸性黑ATT的脫色率可以達到98% ；對直接偶氮染料如直 接耐曬黑SA、直接紫N的脫色率高於96%，對於活性偶氮染料如活性黑KN-B的脫色率能 達到97%以上；在24h內，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432對鹼性偶氮染料如 鹼性橙、鹼性棕的脫色率分別達到97%和85%，對於直接大紅C和直接橙S的脫色率達到 96%，對酸性橙74和活性藍的脫色率分別達到87%和85%。對於結構未發表的進口偶氮 染料 UNISOL SCARLET 3GS, Candida tropicalisYL3-l CGMCC No. 3432 在 4h 內脫色率高達 97%以上，6h內完全脫色。實施例6、熱帶假絲酵母Candida tropicalis YL3-1對染料的脫色的確是通過生 物降解作用實現的驗證試驗按照實施例2的方法，取15ml酸性大紅GR脫色24h後的上清液用3倍體積的乙酸 乙酯萃取3次，用旋轉蒸發蒸乾溶劑後得到黃色晶體，用Iml甲醇溶解後用於氣相色譜-質 譜分析(GC/MS)，總離子流譜圖與相關化合物的質譜圖如圖4所示。通過標準質譜圖的對照發現，脫色後在4. 6min處出現了明顯的化合物苯胺的離 子峰。對應染料結構圖，苯胺為酸性大紅偶氮鍵被還原的主要中間代謝物。GC/MS的結果表 明了，酸性大紅GR確實被Candida tropicalis YL3-1所降解，並且證實了代謝產物之一苯 胺的存在。因此，本發明所述的熱帶假絲酵母Candida tropicaliSYL3-l對染料的脫色的 確是通過生物降解作用實現的。GC/MS分析條件色譜柱HP-5ms，30mX0. 25mmX0. Iym載氣He，流速lml/min進樣口溫度300°C，離子源溫度200°C，柱溫60°C保持3min，5°C /min升溫至 80°C，300C /min 升溫至 300°C，保持 3min。進樣量lyL，分流比1 10離子化方式EI(70eV)。序列表21389DNA 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)
1
tactgatttgcttaattgcaccacatgtgttttttattgaacaaatttctttggtggcgg60
gagcaatcctaccgccagaggttataactaaaccaaactttttatttacagtcaaacttg120
atttatttacaatagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaag180
aacgcagcgaaatgcgatacgtaatatgaattgcagatattcgtgaatcatcgaatcttt240
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caaacccccgggtttggtgttgagcaatacgctaggtttgtttgaaagaatttaacgtgg360
aaacttattttaagcgactagtttatcca389
2
570
DNA
熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)
2
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cgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggtctggctcttgtctatgtttcttggaaca120
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gaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagcttgagatcagacttggt360
attttgtatgttacttcttcgggggtggcctctacagtttatcgggccagcatcagtttg420
ggcggtaggagaattgcgttggaatgtggcacggcttcggttgtgtgtaagccttcgtcg480
atactgccagcctagactgaggactgcggtttatacctaggatgttggcataatgatctt540
aagtcgcccgtcttgaaccacggaacccaa570
9
權利要求
一株熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)菌株，其在中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.3432。
2.權利要求1所述的熱帶假絲酵母在對含偶氮染料的體系進行脫色中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述偶氮染料為酸性大紅GR和/或酸性 黑ATT和/或直接耐曬黑SA和/或直接紫N和/或活性黑KN-B和/或鹼性橙和/或鹼性 棕和/或直接大紅C和/或直接橙S和/或酸性橙74和/或活性藍和/或UNISOLSCARLET 3GS 和 / 或 UNISOL RED 6GN。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於所述含偶氮染料的體系中所述偶 氮染料濃度為1000mg/L以下，優選為50-1000mg/L，最優選為50-500mg/L，特別優選為 50-300mg/Lo
5.根據權利要求2-4中任意一項所述的應用，其特徵在於所述脫色的方法是將權利 要求1所述的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) CGMCC No. 3432接種於含偶氮染料的體 系中，在溫度條件為25-40°C，好氧條件下進行培養。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述溫度條件為30°C。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特徵在於所述含偶氮染料的體系中還含有 NaH2PO4 0. 5-1. 5g/L, K2HPO4 l_3g/L，(NH4)2SO4 0. 5_2g/L，MgSO4 · 7Η200· 05-0. 5g/L,葡萄糖 2-15g/L, NaCl l_30g/L。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述含偶氮染料的體系中優選含有 NaH2PO4 lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/ L0
9.根據權利要求5-8中任意一項所述的應用，其特徵在於所述熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis)CGMCC No. 3432 的培養時間為 12_48h。
全文摘要
本發明公開了一株酵母菌及其在脫色中的應用。該菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)YL3-1 CGMCC No.3432菌株具有廣譜的偶氮染料脫色降解能力，能夠作用於多種不同結構的偶氮染料，脫色能力強。該菌株培養方法簡單，生長速度快，對環境的適應性強，可以對高鹽度的偶氮染料廢水進行有效脫色。該菌株用於印染廢水以及與染料使用相關的工業廢水的脫色，可解決已有技術中存在的問題，具有工業化應用前景。
文檔編號C02F3/34GK101906388SQ20101010366
公開日2010年12月8日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者張勝琴, 曹竹安, 楊光, 柳皋雋, 陳必強 申請人:清華大學