Udp-葡萄糖醛酸轉移酶及編碼該酶的多核苷酸的製作方法

2023-08-02 08:45:56 4

專利名稱：：Udp-葡萄糖醛酸轉移酶及編碼該酶的多核苷酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及UDP—葡萄糖醛酸轉移酶、編碼該酶的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、轉化體等。
背景技術：
：以食用經驗豐富的類黃酮、木脂素為代表的多酚類植物的次生代謝產物，由於具有以抗氧化性為代表的功能性，從而從很早以前就作為功能性材料受到注目，且已作為保健食品進行銷售。例如，槲皮素(類黃酮)、OTPP(類黃酮)、芝麻素(木脂素)等均是保健食品的代表性材料。對植物細胞中類黃酮的生物合成途徑的研究從很早以前就已開始，且對分離催化代謝途徑的生物合成酶及編碼該酶的基因以及對其分子結構的理解也在深入。另一方面，對植物次生代謝產物被攝入體內(invivo)後，以何種形態代謝、是否體現功能這方面的認識還很缺乏。已知一般植物的次生代謝產物的糖苷化不管糖的種類(葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖等)，均由屬於被稱作UDP—糖轉移酶(UGT:UDP-glycosyltransferase)的超家族的酶催化。且在芝麻素的研究例中顯示出，次生代謝產物在體內經過兒茶酚而作為葡萄糖醛酸結合物而存在，所以，認為此葡萄糖醛酸結合物擔負植物次生代謝產物在體內功能表達的一部分。已證實作為哺乳類中的槲皮素代謝物，存在有4種單葡萄糖醛酸(monoglucuronide)(Q畫3陽GlcA、Q誦7畫GlcA、Q陽3'陽GlcA、Q畫4'陽GlcA)(非專利文獻1:Day,AJetal.FreeRadic.Res.35,941-952,2001;非專利文獻2:Moon,JH.etal.FreeRadicalBiology&Medicine30,1274-1285,2001;非專利文獻3:O'Leary，KA.etal.BiochemicalPharmacology65,479-491,2003;非專利文獻4:vanderWoude,H.etal.ChemResToxicol.17,1520-1530,2004)，但要了解它們在生物體內的功能，則需要獲得充分量的化合物以測定其活性。但是，至今為止底物特異性廣泛的適合的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶還不為人所知，且化學合成結合位置特異的反應生成物在現實中還不可能。已知唇形科黃苳(&"&//^/"6m'c^/e似/"的根被稱為黃芩，蓄積了抗氧化性高的黃酮的7位葡萄糖醛酸結合物，在食品藥品劃分上被分類為醫藥品(非專利文獻5:Gao,Z.etal.BiochemicaetBiophysicaActa1472,643—650.1999)。到目前為止，從唇形科黃芩中，作為黃酮的7位葡萄糖醛酸轉移酶的Sb7GAT已被純化，但本酶只對黃酮7位羥基的鄰位上具有羥基等取代基的黃酮(黃芩黃素、高黃芩素等)具有活性，而對於作為主要的黃酮的芹菜素、毛地黃黃酮、還有作為黃酮醇的槲皮素不具有活性(非專利文獻6:NagashimaS.etal.,Phytochemistry53，533—538,2000.)。此外，對應此Sb7GAT的基因雖已在美國基因資料庫(GenBank)中註冊(註冊號No.AB042277)，但其功能還未得到證實。另外，己知在具有食用經驗的唇形科紫蘇(/^n7/a/wte^em—種紅葉品種)中，蓄積了與黃芩相比更多種的黃酮7位葡萄糖醛酸結合物(非專利文獻7:Yamazaki,M.etal.Phytochemistry62,987—998.2003)。非專利文獻1:Day,AJetal.FreeRadic.Res.35,941-952,2001非專利文獻2:Moon,JH.etal.FreeRadicalBiology&Medicine30,1274-1285,2001非專利文獻3:O'Leary,KA.etal.BiochemicalPharmacology65,479-491,2003非專利文獻4:vanderWoude,H.etal.ChemResToxicol.17,1520-1530,2004非專利文獻5:Gao,Z.etal.BiochemicaetBiophysicaActa1472,643—650，1999非專利文獻6:NagashimaS.etal.，Phytochemistry53，533—538,2000.非專利文獻7:Yamazaki,M.etal.Phytochemistry62，987—998,200
發明內容此種狀況下，希望鑑定出底物特異性廣泛的新型UDP—葡萄糖醛酸轉移酶及編碼該酶的基因。本發明鑑於上述狀況，提供如下述所示的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶、編碼該酶的多核苷酸、以及含有該多核苷酸的載體及轉化體等。(1)多核苷酸，其是以下(a)(f)中任一項所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有，選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列以及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列所組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質具有選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列；(c)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質由選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列中115個胺基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列所組成並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性；(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質具有與選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列有80%以上同源性的胺基酸序列，並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性；(e)多核苷酸，其含有，與選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列的互補鹼基序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交並且編碼具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或(f)多核苷酸，其含有，與由編碼選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸鹹基序列的互補鹼基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交並且編碼具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其是以下(g)(j)中的任一項(g)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質由選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列中10個以下(010個)的胺基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列所組成，並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性；(h)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質具有與選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列有90%以上同源性的胺基酸序列，並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性；(i)多核苷酸，其含有，與選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列、及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列的互補鹼基序列所組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交並且編碼具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或(j)多核苷酸，其含有，與由編碼選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸鹼基序列的互補鹼基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交並且編碼具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列所組成的多核苷酸。(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號IO所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列所組成的多核苷酸。(5)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號:12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的多核苷酸。(6)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的多核苷酸。(7)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號5的胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸。(8)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號11的胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸。(9)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號13的胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸。(10)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號23的胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸。(11)上述(1)(10)中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。(12)蛋白質，其由上述(1)(11)中任一項所述的多核苷酸編碼。(13)載體，其含有上述(1)(11)中任一項所述的多核苷酸。(14)轉化體，其中，導入了上述(1)(11)中任一項所述的多核苷酸。(15)轉化體，其中，導入了上述(13)中所述的載體。(16)上述(12)中的蛋白質的制方法，其中，使用上述(14)或(15)中所述的轉化體。(17)葡萄糖醛酸結合物的製造方法，其中，以上述(12)中所述的蛋白質為催化劑，由UDP—葡萄糖醛酸和類黃酮生成葡萄糖醛酸結合物。本發明的多核苷酸，例如，通過導入轉化體而有助於新型UDP—葡萄糖醛酸轉移酶的製造。本發明優選方式的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶，底物特異性廣泛，具有葡萄糖醛酸化多種糖受體底物的活性。圖1表示來自金魚草的AmUGTcglO、來自屋久島光紫黃芩(&z^//an'a/aefeWo/ac^ya^^/wera&)的S1UGT、及來自紫蘇的PfUGT50以及來自黃苳(5"cwte〃an'a6a/ca/era^的Sb7GAT的胺基酸序列的比對。圖2是表示分析PfUGT50的糖受體底物的底物特異性的結果的圖。圖3是表示分析S1UGT的糖受體底物的底物特異性的結果的圖。圖4是表示分析AmUGTcglO的糖受體底物的底物特異性的結果的圖。圖5是表示分析SiUGT23的糖受體底物的底物特異性的結果的圖。圖6是表示對S1UGT與SC1的反應液中生成物的LC-MS分析結果的圖。圖中的箭頭表示生成物。圖7是表示SC1與S1UGT1的反應生成物的MS分析結果的圖。圖8是表示槲皮素與S1UGT1的反應生成物的LC分析結果的圖。具體實施例方式以下詳細說明本發明的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶、編碼該酶的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、轉化體等。1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供，(a)多核苷酸，其含有選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號IO所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列以及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列所組成的多核苷酸(具體地說為DNA，以下，也將這些單稱為"DNA");及(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質具有選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列。本發明中作為對象的DNA，不限於編碼上述的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶的DNA，還包含編碼與此蛋白質功能相同的蛋白質的其他DNA。功能相同的蛋白質，例如，可例舉為(c)蛋白質，其由選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的l個胺基酸序列中115個胺基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列所組成並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性。此種蛋白質，可例舉為蛋白質，其由選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列中例如，115個、114個、l13個、112個、111個、110個、19個、18個、17個、16個(1數個)、15個、14個、13個、12個、l個的胺基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列所組成並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性。上述胺基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的數量，一般越小越優選。並且此種蛋白質，可例舉為蛋白質，其具有與選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列有約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同源性的胺基酸序列，並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性。上述同源性的數値一般越大越好。在此處，"UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性"，是指催化下述反應的活性，即，葡萄糖醛酸化類黃酮、芪及木脂素等的羥基(例如將黃酮的7位的羥基葡萄糖醛酸化)生成葡萄糖醛酸結合物的反應。UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性，例如，可通過使UDP—葡萄糖醛酸與糖受體底物(例如，黃酮)在作為評價對象的酶的存在下反應，用HPLC等分析得到的反應物來進行測定(更具體地，參照後述實施例中的記載)。此外，本發明還包含，(e)多核苷酸，其含有，與選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列的互補鹼基序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交並且編碼具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有，與由編碼選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸鹼基序列的互補鹼基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交並且編碼具有UDP一葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。本說明書中，"多核苷酸"是指DNA或RNA。本說明書中，"在嚴謹條件下雜交的多核苷酸"是指，例如，以選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列的互補鹼基序列所組成的多核苷酸、或編碼選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列的多核苷酸鹼基序列的互補鹼基序列所組成的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等所得到的多核苷酸。雜交的方法，例如可使用"Sambrook&Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3，ColdSpringHarbor,LaboratoryPress2001"、"Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1987-1997"等中所記載的方法。本說明書中所述的"嚴謹條件"，可為低嚴謹條件、中嚴謹條件及高嚴謹條件中的任一種。"低嚴謹條件"，例如，為5xSSC、5xDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、32。C的條件。"中嚴謹條件"，例如，為5"SC、5xDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42。C的條件。"高嚴謹條件"，例如，為5xSSC、5xDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50。C的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的DNA。但影響雜交嚴謹性的因素還可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域技術人員通過適當選擇這些因素，可實現同樣的嚴謹條件。並且雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用AlkphosDirectLabellingReagents(AmershamPharmacia公司制)。此時，根據試劑盒中附帶的說明方案，與標記後的探針保溫過夜後，將膜在55"C的條件下用含有0.1M(w/v)SDS的1次洗滌緩衝液洗滌，之後可檢測雜交後的DNA。除上述以外，可雜交的多核苷酸，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟體，使用默認參數計算時，可例舉為，與選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列以及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列、或與編碼選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列的DNA有約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81°/。以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上同源性的DNAo並且胺基酸序列、鹼基序列的同源性，可使用根據Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,872264-2268,1990;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873,1993)決定。開發了基於BLAST算法的被稱為BLASTN、BLASTX的程序(AltschulSF,etal:J.Mol.Biol.215:403,19卯)。使用BLASTN分析鹼基序列時，參數例如為score=100、wordlength二12。並且使用BLASTX分析胺基酸序列時，參數例如為score=50、wordlength=3。使用BLAST和GappedBLAST程序時，使用各程序的默認參數。上述本發明的多核苷酸，可通過公知的基因工程的方法或公知的合成方法獲得。2.本發明的蛋白質本發明還在其他的實施方式中，提供由上述多核苷酸(a)(f)中任一個編碼的蛋白質。本發明的優選蛋白質，是蛋白質，其由選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列中115個的胺基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列所組成並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性。此種蛋白質，可例舉為，由選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列中的如上述數量的胺基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列所組成並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性。並且此種蛋白質，可例舉為蛋白質，其具有與選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列有如上所述的同源性的胺基酸序列並且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性。此種蛋白質，可使用"Sambrook&Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3，ColdSpringHarbor,LaboratoryPress2001"、"Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1987—1997"、"Nuc.Acids.Res"10,6487(1982)"、"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)，，、"Gene,34,315(1985)"、"Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)，，、"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82，488(1985)"等中所述的定點誘變法獲得。本發明的蛋白質胺基酸序列中1個以上的胺基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、並且1個或多個胺基酸序列的位置上有1個或多個胺基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2種以上也可同時發生。以下，舉例表示可相互取代的胺基酸殘基。同一組中包含的胺基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2—氨基丁酸、蛋氨酸、o—甲基絲氨酸(o—methylserine)、叔丁基甘氨酸(t一butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t—butylalanine)、環己基丙氨酸(cyclohexylalanine);B組天冬氨酸、穀氨酸、異天冬氨酸、異穀氨酸(isoglutamicacid)、2—氨基己二酸、2—氨基辛二酸(2—aminosubericacid);C組天冬醯胺、穀氨醯胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4一二氨基丁酸、2，3—二氨基丙酸；E組脯氨酸、3—羥基脯氨酸、4一羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。本發明的蛋白質可通過Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化學合成法製造。也可利用AdvancedChemTech公司制、珀金埃爾渠犬(PerkinElmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnologyInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、島津製作所制等的肽合成儀進行化學合成。在此，本發明的蛋白質是UDP—葡萄糖醛酸轉移酶。"UDP—葡萄糖醛酸轉移酶"，催化下述反應，即，以UDP—葡萄糖醛酸作為糖供體將葡萄糖醛酸殘基轉移到糖受體底物生成葡萄糖醛酸結合物和UDP的反應。本發明中，糖受體底物例如為類黃酮、芪、及木脂素。類黃酮中，包含黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、異黃酮、黃酮C糖苷、噢稱、及兒茶素等。其中，黃酮，例如可例舉為黃芩黃素、高黃芩素、芹菜素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素及金聖草黃素。黃酮醇，例如可例舉為槲皮素、楊梅黃素及山奈黃素。二氫黃酮，例如可例舉為柑桔素。異黃酮，例如可例舉為染料木素、大豆黃素及刺芒柄花素。黃酮C糖苷，例如可例舉為牡荊葡基黃酮、異牡荊葡基黃酮及葒草素。噢噴，例如可例舉為金魚草素。兒茶素，例如可例舉為兒茶素及表沒食子兒茶素沒食子酸酯。芪中包含白藜蘆醇(Resveratrol)及其糖苷雲杉新苷(piceid)等。木脂素中包含(+)-松脂醇((+)-Pinoresino1)、(+)-胡椒醇((+)-Piperitol)、(+)-芝麻素酚((+)-Sesamino1)、(+)-開環異落葉松樹脂酚((+)-Secoisolariciresinol)、(+)-芝麻素兒茶酚1((+)-Sesamimcatecoll)(SC1)、(+)-芝麻素兒茶酚2((+)-Sesamimcateco12)(SC2)、(+)-表芝麻素兒茶酚2((+)-Episesamimcateco12)(EC2)及羅漢松脂酚(matairesinol)等。並且，例如，具有序列號5的胺基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶(PfUGT50)，當糖受體底物為黃芩黃素、芹菜素、高黃芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素、金聖草黃素、槲皮素、楊梅黃素、山奈黃素、柑桔素及金魚草素等的類黃酮時、為白藜蘆醇等的芪時以及為SC1等的木脂素時具有活性，特別是為黃苳黃素、斧菜素、高黃苳素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素、金聖草黃素、槲皮素及金魚草素時，與其他糖受體底物相比具有強活性。具有序列號11的胺基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶(S1UGT)，當糖受體底物為黃芩黃素、芹菜素、高黃芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素、金聖草黃素、槲皮素、山奈黃素、柑桔素、染料木素、大豆黃素、刺芒柄花素、及楊梅黃素等的類黃酮時、為七葉亭等的香豆素時、為白藜蘆醇等的芪時、以及為SC1、SC2及EC2等的木脂素時具有活性，特別是為黃芩黃素及芹菜素時，與其他糖受體底物相比具有強活性。具有序列號13的胺基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶(AmUGTcglO)，當糖受體底物為黃芩黃素、芹菜素、高黃芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素、金聖草黃素、槲皮素、山奈黃素、柑桔素及金魚草素等的類黃酮時、以及為白藜戸醇等的芪時具有活性，特別是為黃芩黃素、芹菜素、高黃芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素、金聖草黃素、山奈黃素及柑桔素等的類黃酮時，與其他的糖受體底物相比具有強活性。具有序列號23的胺基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶(SiUGT23)，當糖受體底物為黃芩黃素、芹菜素、高黃芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素、金聖草黃素、異牡荊葡基黃酮、槲皮素、山奈黃素、柑桔素、金魚草素、刺芒柄花素等的類黃酮時、為七葉亭等的香豆素時、為白藜蘆醇等的芪時、以及為SC1等的木脂素時具有活性，特別是為黃苓黃素、高黃芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、山奈黃素及金魚草素等的類黃酮時，與其他的糖受體底物相比具有強活性。3.載體及導入該載體的轉化體本發明還在其他的實施方式中，提供含有本發明的多核苷酸的表達載體。本發明的表達載體含有上述(a)(f)中的任一個多核苷酸。優選本發明的表達載體含有(g)(j)的任一個多核苷酸。進一步優選本發明的表達載體含有如下多核苷酸，其含有，選自由序列號4所表示的鹼基序列的第1位第1359位的鹼基序列組成的多核苷酸、序列號IO所表示的鹼基序列的第1位第1365位的鹼基序列組成的多核苷酸、序列號12所表示的鹼基序列的第1位第1371位的鹼基序列組成的多核苷酸以及序列號22所表示的鹼基序列的第1位第371位的鹼基序列組成的多核苷酸所組成的組中的1個多核苷酸，或選自由編碼序列號5的胺基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸、編碼序列號11的胺基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸、編碼序列號13的胺基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸23的胺基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸所組成的組中的1個多核苷酸。本發明的載體，通常如下構成，其含有(i)在宿主細胞內可轉錄的啟動子；(ii)與該啟動子結合的、上述(a)(j)中任一項所述的多核苷酸；及(iii)與RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化有關的在宿主細胞內起作用的信號作為構成因子的表達盒。如此構建的載體被導入宿主細胞。表達載體的製備方法，可例舉為使用質粒、噬菌體或粘粒等的方法，但無特別限定。載體的具體種類無特別限定，可適當選擇在宿主細胞中可表達的載體。即對應宿主細胞的種類，為確實地使本發明的多核苷酸表達，可選擇適合的啟動子序列，將其與本發明的多核苷酸整合進各種質粒等中的載體作為表達載體使用。本發明的表達載體，依賴於應導入的宿主的種類，含^"表達調控區(例如，啟動子、終止子及/或複製起點等)。作為細菌用表達載體的啟動子，使用常用的啟動子(例如，trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子等)，酵母用啟動子，例如可例舉為3—磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、PH05啟動子等，絲狀菌用啟動子例如可例舉為澱粉酶、trpC等。並且動物細胞宿主用啟動子可例舉為病毒性啟動子(例如，SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子等)。表達載體優選含有至少1個選擇標記。此種標記可使用營養缺陷型標記(ura5、niaD)、抗藥性標記(hygromycine、Zeocin)、氨基糖苷類抗生素抗性基因(-二木f、〉)耐性遺伝子)(G418r)、銅抗性基因(CUPl)(Marinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81,3371984)、淺藍菌素抗性基因(fas2m,PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學，64，660,1992;Hussainetal.,gene，101,149,1991)(豬腰淳嗣b,生化學，64,660,1992;Hussainetal"gene,101，149，1991)等。並且本發明提供導入了上述(a)(j)中任一項所述的多核苷酸的轉化體。轉化體的製備方法(生產方法)無特別限定，例如，可為將上述重組載體導入宿主轉化的方法。在此使用的宿主細胞無特別限定，可優選使用以往公知的各種細胞。具體地說，例如，可例舉為大腸桿菌(&C/2w/C/^CO//)等的細菌、酵母(釀酒酵母fecc/^raw^CMcereWw'ae、裂殖酵母(iSc/2/msacc/7ara附3;cespo附6e)、線蟲(Caew0r/2ae/eg^ms)、非洲l爪蟾(Xwopw/mWs)的卵母細胞等。用於上述宿主細胞的適合的培養基及條件為本領域所公知。並且作為轉化對象的生物也無特別限定，可為上述宿主細胞中例舉的各種微生物、植物或動物。宿主細胞的轉化方法可利用一般使用的公知的方法。例如，可用電穿孔法(MackenxieD.A.etal.Appl.Environ.Microbiol.,66,4655-4661,2000)、粒子轟擊法(particledelivery)(日本特開2005_287403《脂質生產菌的育種方法》中記載的方法)、原生質球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)]、醋酸鋰法[J.Bacteriology，153,pl63(1983)]、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1989(1978)、Methodsinyeastgenetics,2000Edition:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual等中記載的方法實施，但不限於此。4.本發明的蛋白質的製造方法
技術領域：
：本發明還在其他的實施方式中，提供使用上述轉化體的本發明的蛋白質的製造方法。具體地說，可通過從上述轉化體的培養物中分離純化本發明的蛋白質，來獲得本發明的蛋白質。在此，培養物是指培養液、培養菌體或培養細胞、或者培養菌體或培養細胞的破碎物的任一種。本發明的蛋白質的分離，純化，可根據通常的方法進行。具體地說，本發明的蛋白質在培養菌體內或培養細胞內積累時，可在培養後，用通常的方法(例如，超音波、溶菌酶、冷凍溶解等)破碎菌體或細胞後，通過通常的方法(例如，離心分離、過濾等)得到本發明的蛋白質的粗提液。本發明的蛋白質在培養液中積累時，可在培養終止後，通過通常的方法(例如，離心分離、過濾等)將菌體或細胞與培養上清分離，來獲得含有本發明的蛋白質的培養上清。如此得到的提取液或培養上清中所含有的本發明的蛋白質的純化，可根據通常的分離純化方法進行。分離純化方法，例如，可單獨或適當組合使用硫酸銨沉澱、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、反相高效液相色譜法、透析法、超濾法等。5.葡萄糖醛酸結合物的製造方法
技術領域：
：本發明還進一步提供使用本發明的蛋白質製造葡萄糖醛酸結合物的方法。本發明的蛋白質因催化將葡萄糖醛酸從UDP—葡萄糖醛酸轉移到糖受體底物(例如，類黃酮、芪或木脂素)的反應，所以，通過使用本發明的蛋白質，以糖受體底物及UDP—葡萄糖醛酸為原料，可製造葡萄糖醛酸結合物。糖受體底物優選類黃酮。例如，配製含有lmM的糖受體底物、2mM的UDP—葡萄糖醛酸、50mM的磷酸鈣緩衝液(pH7.5)及20pM的本發明的蛋白質的溶液，通過在30°C下反應30分鐘，可製造葡萄糖醛酸結合物。葡萄糖醛酸結合物可通過公知的方法從此溶液中分離純化。具體地說，例如，可單獨或適當組合使用硫酸銨沉澱、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、反相高效液相色譜法、透析法、超濾法等。如此得到的葡萄糖醛酸結合物，作為用於測定在生物體內的功能的試劑、抗氧化劑等行之有效(Gao,Z.，Huang,K.,Yang,X.，andXu，H.(1999)BiochimicaetBiophysicaActa1472,643—650.)。通過以下的實施例進一步詳細說明本發明，但本發明不限於實施例。實施例l1.實施例l的概要本實施例進行了如下嘗試，從唇形科屋久島光紫黃芩中通過PCR克隆Sb7GAT同源基因(S1UGT)，以此基因為探針，從來自積累了類黃酮的7位葡萄糖醛酸結合物的唇形科紫蘇葉的cDNA文庫中分離類黃酮的7位葡萄糖醛酸轉移酶。篩選的結果，鑑定了來自紫蘇的糖苷化酶(PfUGT)中對於黃酮的7位羥基具有轉移葡萄糖醛酸的活性的PfUGT50。此PfUGT50不僅對於黃芩黃素、高黃芩素、芹菜素、毛地黃黃酮等的黃酮類，對作為黃酮醇的槲皮素也具有葡萄糖醛酸轉移活性。因此，可通過使用PfUGT50,將含有黃酮的多種類黃酮的7位在試管內(invitro)進行葡萄糖醛酸化。並且作為篩選探針分離的來自屋久島光紫黃芩的S1UGT，對多種類黃酮也具有葡萄糖醛酸轉移活性。此外，對於玄參科金魚草，還探討了與PfUGT50及S1UGT同源性高的UGT(UDP—葡萄糖醛酸轉移酶)，鑑定了作為來自金魚草的UGT的AmUGTcglO。大腸桿菌表達的AmUGTcglO蛋白質對於芹菜素、槲皮素、柑桔素具有葡萄糖醛酸轉移活性。因此，可表明結構類似的上述紫蘇PfUGT50、光紫黃芩S1UGT及金魚草AmUGTcglO是具有類黃酮的7位葡萄糖醛酸轉移活性的酶。2.紫蘇cDNA文庫中的糖苷化酶基因的分離(1)探針的製備本實施例中使用的分子生物學的方法，只要無其他詳細敘述，均按照MolecularCloning(Sambrook等、ColdSpringHarbourLaboratoryPress,2001)中記載的方法。使用RNeasyPlant迷你試劑盒(QIAGEN)，從屋久島光紫黃苳的根中提取總RNA後，將用於RT-PCR的第一鏈合成系統[SuperScriptTMFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen公司)]按照製造商推薦的條件使用，由l嗎總RNA合成cDNA。根據黃芩的Sb7GAT的序列(GenBank註冊號No.AB042277)設計引物一Fw(序列號1)和引物一Rv(序列號2)，使用該引物以屋久島光紫黃芩cDNA為模板進行PCR。序列號1:SlUGT—Fw:5，一AAACATATGGCGGTGCTGGCGAAGTTC_3，(下線為NdeI位點)序列號2:S1UGT—Rv:5，一TTTTGATCATTAATCCCGAGTGGCGTGAAG—3，(下線為BclI位點)具體地說，PCR反應液(50^1)的組成為屋久島光紫黃芩(&wfe〃fln'a/a他vzWaceav.y"A:,'膨/M&)cDNAljxl、lxTaq緩衝液(buffer)(TaKaRa)、0.2mMdNTPs、引物(序列號1及2)各0.4pmol/|il、rTaq聚合酶(polymerase)2.5U。PCR反應為94。C、反應3分鐘後，進行30個循環的94。C1分鐘、53°Cl分鐘、72°C2分鐘的反應來進行擴增。將擴增的片段插入到pCR—TOPOII載體(Invitrogen)的多克隆位點，使用插入片段的鹼基序列DNAS叫uencermodel31OO(AppliedBiosystems)，使用合成寡核苷酸引物通過引物步查法確定鹼基序列。用所得到的鹼基序列的CLUSTAL—W程序(MACVECTOR7.2.2軟體、Accerly公司)分析的結果，可證實得到了與黃芩有高同源性的屋久島光紫黃芩UGT的部分序列(序列號3)。將此來自屋久島光紫黃芩的UGT作為S1UGT部分序列用作篩選探針的模板。將非放射性同位素DIG—核酸檢測系統(Roche公司)按照製造者推薦的PCR條件使用，在通過RT—PCR得到的片段(fragment)中導入DIG標記。具體地說，PCR反應液(50pl)的組成為各cDNAlpl、lxTaq緩衝液(buffer)(TaKaRa)、0.2mMdNTPs、引物(序列號1及2)各0.4pmol/pl、rTaq聚合酶(polymerase)2.5U。PCR反應在94"C、反應5分鐘後，進行30個循環的94"Cl分鐘、53°Cl分鐘、78°C2分鐘的反應的擴增。通過瓊脂糖電泳證明S1UGT片段已被標記，將此DIG標記化片段(fragment)作為雜交用探針用於以下的實驗。(2)雜交將非放射性同位素DIG—核酸檢測系統(Roche公司)按照製造者推薦的條件使用，將來自紫蘇(品種赤縮緬紫蘇)的葉的cDNA文庫(Yonekum—Sakakibara，K.etal.,PlantCellPhysiol.41,495—502.2000)使用前述S1UGT探針進行篩選。使用雜交緩衝液[5xSSC、30%甲醯胺、50mM磷酸鈉緩衝液(PH7.0)、1%SDS、2%封閉試劑(Roche)、0.1%十二烷基肌氨酸、80g/ml鮭魚精子DNA)，4(TC下進行1小時預雜交後，添加變性探針，保溫過夜。將膜在含有1%SDS的4xSSC洗滌液中58"下洗滌30分鐘。篩選約lxl06pfU的噬菌斑，得到約300個陽性克隆。(3)基因鑑定將陽性克隆通過二次篩選形成單噬斑，使用M13RV及M13M4(—20)的引物對，擴增插入物片段，確定插入部分的DNA序列。使用基於所得到的DNA序列而得到的推測胺基酸序列通過Blastx的資料庫檢索，其結果，得到與S1UGT及Sb7GAT有高同源性的紫蘇UGT(PfUGT50)(序列號4、5)。將所得到的全長PfUGT50與S1UGT及Sb7GAT用CLUSTAL-W程序(MACVECTOR7.2.2軟體、Accerly公司)分析的結果，有力地證明了S1UGT及Sb7GAT均是5'端區域欠缺的不完整ORF(OpenReadingFrame)。因此，將GeneRacerkit(Invitrogen公司)用製造商推薦的方法進行cDNA末端快速擴增(RapidAmplificationofcDNAEnd)(以下稱RACE)，擴增了S1UGT的5，及3'端區域。RACE中，使用如下所示的各S1UGT基因的特異性引物對(序列號69)。序列號6:GR—S1UGT—Rv:5'—TGGGAGGCAAACCAGGGATCTCGACAA序列號7:S1UGT—nest—Rv:5'—AATCATCCAAATCTTTAAGGT序列號8:GR—S1UGT—Fw:5'—AGAAGGGGTGTGTTCTCCGCTGAGCAA序列號9:S1UGT—nest—Fw:5'_GAACAGCGGTCACAGATTTCT對於各擴增產物，使用合成寡核苷酸引物通過引物步查法確定鹼基序列，得到包含全長ORF的SIUGT基因及胺基酸序列(序列號10、11)。文獻報導了不僅在紫蘇及屋久島光紫黃芩中，在玄參科金魚草(^2fzVr/2/"wwmq/w》中也有作為黃酮的一種的芹菜素7位葡萄糖醛酸結合物(Harborne，J.B.Phytochemistry2，327—334.1963)。因以前分離的用序列號12及13表示的功能未知的金魚草糖苷化酶AmUGTcglO與本實施例中分離的PfUGT50及SlUGT有高的同源性，所以，AmUGTcglO也作為酶分析用的候補基因(Ono,E.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103,11075—11080.2006)。上述得到的來自金魚草的AmUGTcg10、來自屋久島光紫黃芩的S1UGT及來自紫蘇的PfUGT50的比對如圖1所示。並且圖1中一同記入了來自黃芩的Sb7GAT。3.紫蘇葉中類黃酮的提取和純化(1)高黃芩素7-葡萄糖醛酸(Scutdlarein7—glucuronide)的純化將200片、144.4g青紫蘇的葉(愛知產豐橋溫室聯合)在液氮中粉碎，在1.5L的50。/。CH3CN、0.1%HCOOH中浸漬過夜，硅藻土過濾。減壓濃縮濾液，將濃縮液裝入600ml的CHP—20P中，用水、10,20，30,40,50%CH3CN/H2O各300mlx2進行階段梯度洗脫，將確認了多酚類的洗脫的10%—250%—1的各組分進行濃縮、冷凍千燥，用HPLC分析。收量為10%_2(12.1mg)、20%—1(52.5mg)、20%—2(122.4mg)、30%—1(227.5mg)、30%—2(262.8mg)、40%—1(632.4mg)、40%—2(192.0mg)、50%—1(113.2mg)，40%—1高純度含有迷迭香酸(rosmarinicacid)，其它均是含有黃酮的組分。將30%—2組分用下述製備型HPLC純化，得到16mg高黃苳素7-葡萄糖醛酸。製備型HPLC條件色譜柱DevelosilC—30—UG5，20mmx250mm,流動相A—0.1%TFA,B—0.05%TFA/90%CH3CN，流速6ml/min.梯度B20—B60%(lOOmin)，B60%iso(20min)檢測A280nm(2)高黃芩素7-葡萄糖醛酸的水解和苷元的純化將上述(1)中得到的高黃芩素7-葡萄糖醛酸中的3mg溶解於10(VL的DMSO中，用15ml的離心管(Falcontube)分為兩份。在各試管中加入10ml的壓0和2.5ml的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH5.0)及0.8mip—莆萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(卩一Glucronidase/Aiylsulfatase)(EC3.2丄31/EC3丄6.1、RocheDiagnosticsGmbH制)溶液，37'C下保溫2小時。將反應終止液裝入Sep—Pak—C18(20cc)中，在水、20ml之後，用20ml10%EtOH除去鹽類、蛋白類，用40ml80%CH3CN+0.05%TFA洗脫、濃縮、冷凍乾燥生成的苷元。將此組分用下述製備型HPLC純化，得到0.4mg的高黃芩素(苷元)。製備型HPLC條件色譜柱DevelosilC—30—UG5，20mmx250mm,流動相A—0.1%TFA,B—0.05%TFA/90%CH3CN,流速6ml/min.梯度B15—B70%(60min),B70%iso(lOmin)檢測A330nm4.重組紫蘇糖苷化酶的表達和活性測定(1)表達載體構建將上述相互間同源性高的、含有來自絮蘇的PfUGT50、來自屋久島光紫黃芩的SIUGT及來自金魚草的AmUGTcglO的3種糖苷化酶的全長ORF的cDNA分別通過基因特異性引物對(PfUGT50，序列號14—15;S1UGT，序列號16—17;AmUGTcglO，序列號18—19)擴增。模板分別使用由紫蘇葉、屋久島光紫黃芩根、金魚草花瓣中提取的總RNA合成的cDNA。序列號14:PfUGT50—fw:5'一AAACATATGGAAGGCGTCATACTTC一3'(下線為NdeI位點)序列號15:PfUGT50—rv:5，—丁TTTGATCATTAATCACGAGTTACGGAATC—3，(下線為Bcll位點)序列號16:SlUGT—fw:5'—AAACATATGGAGGACACGATTGTTATC一3，(下線為NdeI位點)序列號17:S1UGT—rv:5'—TTCATATGTCAATCCCTCGTGGCCAGAAG—3'(下線為Ndel位點)序列號18:AmUGTcglO—fW:5，—AAACATATGGAGGACACTATCGTTCTC一3，(下線為Ndel位點)序列號19:AmUGTcglO—rv:5，一TTGGATCCTTAAGAAACCACCATATCAAC—3，(下線為BamHI位點)PCR反應(KOD—Plus—,TOYOBO)用94°C,2min;[94°C,15sec;50。C，30sec;68。C,1.5min]x35循環(cycles)進行。將經擴增的DNA片段亞克隆到pCR—BluntII—TOPO載體(ZeroBluntTOPOPCRCloningKit,invitrogen)，通過ABI3100Avant(AppliedBiosystems)進行鹼基序列的確認。對於PfUGT50，通過轉化所得到的phis株得到非甲基化質粒。所得到的質粒，PfUGT50用Ndel和Bcll、SIUGT用Ndel、AmUGTcglO用Ndel禾口BamHI分別酶切，將產生的約1.5kb的DNA片段與PfUGT50和AmUGTcglO用Ndel和BamHI酶切、SIUGT用Ndel酶切的pET—15連接。(2)重組大腸桿菌的培養和蛋白質的純化使用上述4一(1)中得到的各個質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得到的轉化體在4ml含有50pg/ml的氨苄青黴素的LB培養基(10g/1胰蛋白腖，5g/l酵母膏，lg/lNaCl)中37。C下振蕩培養過夜。將達到靜止期的4ml培養液接種到同樣組成的80ml培養基中，37X:下振蕩培養。菌體濁度(OD6Q)約達到0.5時，添加使最終濃度為0.4mM的IPTG(異丙基-(3-D硫代半乳糖苷)，22X下振蕩培養20小時。以下的所有操作均在4t:下進行。將培養後的轉化體用離心分離(7,000xg，15min)集菌，添加緩衝液S(BufferS)[20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)，20mM咪唑(imidazole)，0.5MNaCl，14mMp—巰基乙醇]2ml/gce11，懸浮。然後進行超音波破碎(15secx8次)，離心分離(15,000xg，10min)。在所得到的上清中添加使最終濃度為0.12%(w/v)的聚乙烯亞胺、懸浮，靜置30min。進行離心分離(15，000xg，10min)，將上清作為粗酶液回收。將粗酶液用在由緩衝液S(BufferS)平衡的HisSpinTrap(GEHealthcare)中，進行離心(70xg，30sec)。用緩衝液S(BufferS)600pl洗滌後，用含有IOO、200、500mM咪唑(imidazole)的緩衝液S(Buffers)各60(Hi1，將與色譜柱結合的蛋白質進行階段梯度洗脫。將各洗脫組分使用離心超濾管(Microcon)YM_30(Amicon)置換為含有14mM|3—巰基乙醇的20mM磷酸鉀緩衝液(pH7.5)。SDS—PAGE分析的結果，因在100mM及200mM咪唑(imidazole)洗脫組分中確認有目的大小的蛋白質，所以，將上述組分混合用於分析。這些組分中不單是目的蛋白質。(3)酶反應和HPLC分析條件標準的反應條件如下所示。配製50jal反應液[2mMUDP—葡萄糖醛酸，100pM糖受體底物，50mM磷酸鉀緩衝液(pH7.5)，酶溶液]，通過添加酶溶液開始反應，3(TC下反應30分鐘。通過添加50^1含有0.5%TFA的CH3CN終止反應，用HPLC分析。HPLC條件如下所示。色譜柱，DevelosilC30—UG—5(4.6xl50mm);洗脫液A，0.1%TFA/H2O;洗脫液B，0.08%TFA/90%CH3CN;洗脫條件A(除噢噴、兒茶素、香豆素、苯丙素以外)，0min/5%B—18min/100。/。B液—18.1min/5%B—25min/5。/。B;洗脫條件B(噢稱、兒茶素、香豆素、苯丙素)，0min/5°/。B—20min/50%B液—20.5min/5%B—25min/5°/。B;流速，1ml/min;檢測波長280,350nm。以下表示各種鑑定的方法及結果。糖受體底物特異性分析根據上述方法，分析針對各種糖受體底物的特異性(圖24)。圖2表示PfUGT50糖受體底物的底物特異性的分析結果。圖2表示對於高黃芩素(Scutellarein)的活性為100%時對各底物的相對活性。分析的結果，PfUGT50對高黃苳素具有最大活性，與糖苷以外的黃酮充分反應[黃苳黃素(Baicaldn)(對高黃芩素的相對活性，73%)、芹菜素(Apigenin)(44%)、毛地黃黃酮(Luteolin)(41%)、五羥黃酮(Tricetin)(87.9%)、洋芫荽黃素(Diosmetin)(62%)、金聖草黃素(Chrysoeriol)(18%)]。並且對黃酮醇[槲皮素(Quercetin)(26%)、楊梅黃素(Myricetin)(9%)、山奈黃素(Kaempferol)(3%)]，二氫黃酮[柑桔素(Naringenin)(3%)]及噢噴[金魚草素(Aureusidin)(40%)]也具有活性。但對黃酮C糖苷[牡荊葡基黃酮(Vitexin)、異牡荊葡基黃酮(Isovitexin)、葒草素(Orientin)]、異黃酮[染料木黃酮(Genistein)、大豆素(Daidzein)、刺芒柄花素(Formononetin)]、兒茶素[兒茶素(Catechin)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechingallate)]、香豆素[(七葉亭(Esculetin)]及苯丙素[松柏醇(Coniferylalcohol)]無活性。此外，在HPLC中，高黃芩素、黃芩黃素、芹菜素、槲皮素與其反應生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留時間一致。圖3表示分析S1UGT糖受體底物的底物特異性的結果。圖3表示對高黃苳素的活性為100%時對各底物的相對活性。分析的結果，S1UGT對高黃芩素具有最大的活性，對除黃芩黃素(對高黃芩素的相對活性，63%)以外的黃酮的反應性低[芹菜素(3%)、毛地黃黃酮(0.6%)、五羥黃酮(1.1%)、洋芫荽黃素(0.3%)、金聖草黃素(0.02%)]。並且對黃酮醇[槲皮素(1%)、山奈黃素(14%)]、二氫黃酮[柑桔素(Naringenin)(6%)]、異黃酮[染料木黃酮(1%)、大豆素(0.3%)、剌芒柄花素(0.08%)]、香豆素[(七葉亭(Esculetin)(0.3%)]的活性也低，對黃酮C糖苷(牡荊葡基黃酮、異牡荊葡基黃酮、葒草素)、噢嘵(金魚草素)、兒茶素(兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯)及苯丙素[松柏醇(Coniferylalcohol)]無活性。也就是說，說明S1UGT的活性中類黃酮7位的鄰位修飾很重要。並且在HPLC中，高黃苳素、黃苳黃素、齊菜素與其反應生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留時間一致。另一方面，檢測出槲皮素中多個反應生成物，其中之一與7位葡萄糖醛酸化物的保留時間一致。圖4表示分析AmUGTcglO糖受體底物的底物特異性的結果。圖4表示對高黃芩素的活性為100。/。時對各底物的相對活性。分析的結果，AmUGTcg10對高黃芩素具有最大活性，與除糖苷以外的黃酮也反應[黃芩黃素(對高黃芩素的相對活性，22%)、芹菜素(40%)、毛地黃黃酮(34%)、五羥黃酮(23.8%)、洋芫荽黃素(26%)、金聖草黃素(18%)]。並且對黃酮醇[槲皮素(4%)、山奈黃素(28%)]，二氫黃酮[柑桔素(15%)]及噢稱[金魚草素(2%)]也具有活性。但是，對黃酮C糖苷(牡荊葡基黃酮、異牡荊葡基黃酮、葒草素)、異黃酮(染料木黃酮、大豆素、刺芒柄花素)、兒茶素(兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、香豆素[(七葉亭(Esculetin)]及苯丙素[松柏醇(Coniferylalcohol)]無活性。並且在HPLC中，高黃芩素、黃芩黃素、芹菜素、槲皮素與其反應生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留時間一致。以上結果表明，PfUGT50和AmUGTcglO對黃酮等的類黃酮具有低特異性，S1UGT具有高特異性。並且來自紫蘇的的PfUGT50具有特別低的特異性，即是底物特異性廣泛的酶。糖供體底物特異性分析將芹菜素作為糖受體底物使用，對各種UDP活性化糖供體分析特異性。其結果，PfUGT50，S1UGT及AmUGTcglO只對UDP—葡萄糖醛酸具有活性，而對UDP—葡萄糖，UDP—半乳糖無活性。以上結果表明，上述酶是對黃酮特異性高的7位葡萄糖醛酸轉移酶(黃酮7—0—葡萄糖醛酸轉移酶)。PH及溫度特性分析溫度穩定性如下分析。酶溶液在1555。C、処理1小時後，4。C下冷卻。使用冷卻後的樣品，在標準的反應條件下計算殘存活性。pH穩定性如下分析。在酶溶液中添加緩衝液(pH4,4.5，5，醋酸鹽一NaOH;pH5.5,6,6.5,7,7.5，NaH2P04—NaOH;pH8，8.5,9，Tris—HC1)到最終濃度為167mM，4。C下處理1小時後，添加磷酸鉀緩衝液(pH7.5)到最終濃度為500mM。使用処理後的樣品，計算在標準反應條件下的殘存活性。反應溫度依賴性，在反應溫度設定在1055'C的標準反應條件下進行反應、分析。反應pH依賴性，在代替磷酸鉀緩衝液(pH7.5)使用緩衝液(pH4,4.5,5，醋酸鹽—NaOH;pH5.5,6,6.5，7,7.5，NaH2P04_NaOH;pH8,8.5，9,Tris—HCl)的標準反應條件下進行反應、分析。以上的分析結果表明，PfUGT50在pH79的範圍內穩定，其催化活性在pH78的範圍內最大，在酸性區域內基本不具有活性。並且在3(TC以下穩定(l小時，pH7.5)，30分鐘內的活性測定中反應最適溫度為3(TC。SlUGT在pH4.58的範圍內穩定，其催化活性在pH78的範圍內最大，在酸性區域內基本不具有活性。此外，本酶在40。C以下穩定(1小時，pH7.5)，30分鐘內的活性測定中反應最適溫度為35°C。AmUGTcglO在pH7.59.5範圍內穩定，其催化劑活性在pH8.59.5的範圍內為最大，在酸性區域內基本不具有活性。另夕卜，本酶在30。C以下穩定(1小時，pH7.5)，30分鐘內的活性測定中反應最適溫度為45'C。這些性質與已知的植物次生代謝相關的GT類似。5.結果如上所述，鑑定了結構上類似的來自唇形科紫蘇的PfUGT50、來自唇形科屋久島光紫黃芩的S1UGT及來自玄參科金魚草的AmUGTcglO。PfUGT50及AmUGTcglO糖苷化酶與黃芩Sb7GAT相比，糖受體底物特異性廣泛，具有黃酮、黃酮醇、噢稱等多種類黃酮的7位葡萄糖醛酸轉移活性。另一方面，SlUGT具有與Sb7GAT類似的底物特異性。通過使用上述糖苷化酶，可廉價地使類黃酮的7位進行葡萄糖醛酸結合反應。因此，可使槲皮素7—葡萄糖醛酸甙(glucronide)等生物體內存在的葡萄糖醛酸結合物在體外(invitro)大量生成，並評價生理活性。實施例21.實施例2的概要本實施例中，鑑定了唇形目胡麻科芝麻(Sesamumindicum)中與光紫黃芩S1UGT及金魚草AmUGTcg12同源性高的SiUGT23，證實了其大腸桿菌表達蛋白對高黃芩素及毛地黃黃酮具有葡萄糖醛酸轉移活性。2.SiUGT23基因的鑑定著眼於光紫黃芩及金魚草的類黃酮7位葡萄糖醛酸轉移酶基因(UGT基因)的序列保守性，測定與這些基因同源性高的基因，其結果，在唇形目胡麻科芝麻中，也發現了具有與上述UGT基因有高同源性的芝麻UGT基因SiUGT23。因從芝麻cDNA文庫內中分離的SiUGT23不具有全長序列，所以，使用下述序列號20及21的引物，通過前述實施例1的2(3)中所述RACE法確定了SiUGT23的全長序列(序列號22及23)。序列號20:GR—SiUGT23—Rv5'—GGCCAAACGCGCCGGAGCTGATGTAGA—3'序列號21:SiUGT23-nest畫Rv5'-AGTGGGTATATTCAAGCCTGT-3'3.來自芝麻的SiUGT23的表達和活性測定將包含來自芝麻的SiUGT23的全長ORF的cDNA通過基因特異性引物對(序列號24及25)擴增。模板使用由從芝麻種子中提取的總RNA合成的cDNA。與前述實施例1的紫蘇、光紫黃芩及金魚草的UGT同樣整合到大腸桿菌表達載體，通過同樣的方法使重組SRJGT23蛋白質表達，測定酶活性。序列號24:SiUGT23—fw:5'一CACCATATGGAAGACACCGTTGTCCTCTA—3'(下線為NdeI位點)序列號25:SiUGT23—rv:5'—GGATCCTAACATCACTCAAACCCGAGTCA—3'(下線為BamHI位點)圖5表示分析SiUGT23的糖受體底物的底物特異性的結果。圖5表示對高黃芩素的活性為100%時對各底物的相對活性。分析的結果，SiUGT23對高黃芩素具有最大的活性，與以下的黃酮也發生反應[黃芩黃素(對高黃芩素的相對活性(以下同樣)24%)、芹菜素(7%)、毛地黃黃酮(29%)、五羥黃酮(14.0%)、洋芫荽黃素(4%)、金聖草黃素(6%)、異牡荊葡基黃酮(0.3%))。並且對黃酮醇[槲皮素(4%)、山奈黃素(18%)]、二氫黃酮附桔素(2%)]、噢嘵[金魚草素(13%)]、香豆素[七葉亭(0.03%)]及以下的異黃酮[剌芒柄花素(0.03%)]也具有活性。但對異牡荊葡基黃酮以外的黃酮C糖苷(牡荊葡基黃酮、葒草素)、剌芒柄花素以外的異黃酮(染料木黃酮、大豆素)、兒茶素(兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯)及苯丙素[咖啡酸(Caffeicacid)]無活性。此夕卜，HPLC中，高黃芩素、黃芩黃素、芹菜素、槲皮素與其反應生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留時間一致。由以上結果可知，芝麻SiUGT23與紫蘇PfGT50及金魚草AmUGTcglO同樣，是對黃酮等類黃酮具有低特異性的類黃酮7位葡萄糖醛酸轉移酶。實施例3使用紫蘇PfUGT50、屋久島光紫黃芩S1UGT、金魚草AmUGTcglO重組蛋白質及芝麻的SiUGT23重組蛋白質，探討對於植物性多酚的芪及木脂素的葡萄糖醛酸轉移活性。芪的底物使用白藜蘆醇(Resveratrol)，木脂素的底物使用(+)-松脂醇(Pi匿esino1)、(+)-胡椒醇(Piperitol)、(+)-芝麻素酚(Sesaminol)、(+>開環異落葉松樹脂酚(Secoisolariciresinol)、(+)-芝麻素JL茶酚1(Sesamimcatecol1)(SC1),(+)-芝麻素JL茶酚2(Sesamimcateco12)(SC2),及(+)-異芝麻素兒茶酚2(Episesamimcateco12)(EC2)(NakaiM,etal.(2003)JAgricFoodChem.51,1666-1670.)，用與上述同樣的條《牛進行酶反應。HPLC分析的結果，在紫蘇PfUGT50、屋久島光紫黃芩S1UGT、金魚草AmUGTcglO及芝麻的SiUGT23的全部反應液中均得到了生成物(參照圖2_5)。此外，對於木脂素類，以SC1及SC2為底物時，得到了新型生成物。將得到最多生成物的S1UGT和SC1的反應進行LC-MS分析的結果，可表明SC1在RT.二12.8分鐘時洗脫，反應生成物在RT屍10.8分鐘洗脫(圖6)、其為m/z=517.1328[M-H]-(C25H25012、calcd.517.1346、err,2.5ppm)的SC1單葡萄糖醛酸甙(圖7)。LC一MS的條件如下所示。色譜柱DevelosilC30隱UG3，3mmx150mm流動相A:H20,B:CH3CN,C:2.5%HCOOH,0.2ml/min.梯度B20%—B70%(IO分鐘)、B70%(5分鐘)、C4%檢測A280nmMS條件Q-TOF腸Premier(Micromass、Manchester、UK帝lj)V模式，陰性(negative)，毛細管電壓(Capillary):2.3KV，錐空電壓(cone):45V以上結果可表明，通過使用紫蘇PfUGT50、屋久島光紫黃芩S1UGT、金魚草AmUGTcglO及芝麻的SiUGT23，不僅可生產多種類黃酮的葡萄糖醛酸甙，還可生產芪及木脂素的葡萄糖醛酸甙。實施例4來自屋久島光紫黃苳的S1UGT提供了在與槲皮素(QU)反應時其7位葡萄糖醛酸以外的多個生成物(圖8)。這些是來自芝麻的SiUGT23、來自金魚草的AmUGTcglO、及來自紫蘇的PfUGT50中不存在的特徵性生成物。LC-MS分析的結果，檢測出保留時間在79分鐘之間時向槲皮素轉移了兩個葡萄糖醛酸的m/f653.1009[M-H]-(C27H25019,calcd.653.0990,err.2.9ppm)的槲皮素二葡萄糖醛酸武。檢測出3種保留時間在911分鐘之間時向槲皮素轉移了一個葡萄糖醛酸的m/z=477.06[M-H]—的槲皮素單葡萄糖醛酸甙。因為R.T.=10.12分鐘時的成分與將紫蘇的GAT的反應生成物純化、進行結構分析的產物一致，所以，可知其是槲皮素7-0-葡萄糖醛酸甙。並且11工=10.34分鐘時的成分與將葡萄葉的主要黃酮醇純化、進行結構分析的產物一致，所以，可知其是槲皮素3-0-葡萄糖醛酸甙。[Hmamouch,M.etal.(1996)AmJEnolVitic.,47,186-192]為主要反應生成物的R/T.二11.3分鐘的成分，用反相HPLC純化、用NMR進行結構分析的結果，證明其是槲皮素3'-0-葡萄糖醛酸甙。表明主要的3個譜峰分別是槲皮素的7位、3位、3'位的單葡萄糖醛酸甙。LC一MS的條件如下所示。色譜柱YMC-packpolymerC18，2mmx150mm,6jim流動相A:H20,B:CH3CN,C:2.5%HCOOH,0.2ml/min.梯度B10%—B50%(IO分鐘)、B50%(5分鐘)、C4%檢測A350腿MS條《牛Q-TOF-Premier(Micromass、Manchester、UK制)V模式，陰性(negative)，毛細管電壓(Capillary):3.0KV，錐空電壓(cone):30V以上結果表明，通過使用屋久島光紫黃芩S1UGT，可由槲皮素得到多種槲皮素葡萄糖醛酸甙。本發明的UDP—葡萄糖醛酸轉移酶的底物特異性廣泛，有助於各種葡萄糖醛酸結合物的製造。製造出的葡萄糖醛酸結合物，例如，作為用於測定其在生物體內的功能的試劑、抗氧化劑等行之有效。序列表(SEQUENCELISTING)〈110〉三得利株式會社(SUNTORYLIMITED)〈120〉UDP—葡萄糖醛酸轉移酶及編碼該酶的多核苷酸(UDP-glucuronosyltransferaseandpolynucleotideencodingthesame)PIF082713C〈150〉_JP2007-267050〈151〉2007-10-12JP2008-067185〈151〉2008-03-17〈160〉25127■人工序列(Artificialsequence)〈220〉〈223〉合成DNA(syntheticDNA)〈400>1aa3C3tstggcggtgctggcgaagttc27〈210〉2〈211〉30〈212〉腿〈213〉人工序列(Artificialsequence)〈220〉〈223〉合成DNA(syntheticDNA)2ttttgatcattaatcccgagtggcgtgaag30〈210〉31326DNA<213〉屋久島光紫黃苳(Scutellarialaeteviolaceav.yakusimensis)〈400〉3atggcggtgctggcgaagttcatcagcaagaaccacccctccgtccccatcatcattatc60agcaacgccccggaatccgccgccgcctccgtggcggccatcccttccatctcctaccac120cgccttcccctcccggagatccctcccgacatgacaacagaccgcgtggagctcttcttc180gagctccctcgtctcagcaaccctaacctcctcactgctxtgcaacagatctcccagaag240ac犯ga^tcagagctgttatcctcgatttcttctgcaacgcggcttttgaggttccgacc300agcctcaatatacccacctactactacttcagcgccggaactccaaccgccatcctcacc360ttgtacttcgaaaccatcgatgagaccatccctgttgaccttcaagacctcaatgactat420gtcgacatccctggtttgccgccgattcactgcctcgatatccccgtggctttgtcaccg480cgtaagagtcttgtttac犯gagctccgtcgacatttcgaagaacctgcgcagatcggca540ggcatcctcgttaatggcttcgatgcactcgagtttagagccataggaagccatagtcaa600cggcctatgcatttcaaaggcccaactcctccggtttacttcatcgggccattggtcggagatgtcgacactaaggccggcagcgaggagc已tgagtgtctgag已tggcttgatacacag720ccaagtaagagtgtcgtcttcctttgttttgggagaaggggtgtcttctctgctaagcag780ctgaagg卿cggcggcggcgttgg卿acagtggccacaggUtctctggtcagtg卿840aacccaccggagttgaagaaggcgacggggtccgatgagccggaxxtggatgagctgctg900cccgagggcttcctggagagaaccaaggatcggggtttcgtgataaagtcgtgggctcca%0c卿鄉aggtgctggctcacgactcggtaggtggattcgtgactcactgtgggcggagc1020tccgtgtctga郷ggtgtggttcggagtgccgatgatcgggtggccggtggacgcggag1080ctgaggttgaatcgggcggtgatggtggatgatctgcaggtggcgctgccgctggaggag1140gaggcgggtgggttcgtgacggcggctgagttggaga朋cgagtt卿gagttgatggag1200acgaaggcggggaaggcggtgaggcaacgagtcaccgaactgaaactctccgccagggcg1260gcggtggcggagaatggatcctcgctaaatgatttgaaaaaatttcttcacgccactcgg1320gatt朋〈210〉41490DNA〈213〉紫蘇(Perillafrutescens)〈220>〈221〉CDS(l)..4atggauaggcMetGluGly1(1362)gtcatacttctttacteateggetVallieLeuLeuTyrSerSerAla510gagcacttgaactecGluHisLeuAsnSer15132648atgttattgetcgccaccttcategccaaacaccatccctecateccc96MetLeuLeuLeuAlaThrPhelieAlaLysHisHisProSerliePro202530ateacaatecttagetecgccgactacteagccgccgcctecgtctec144lieThrlieLeuSerSerAlaAspTyrSerAlaAlaAlaSerValSer354045ac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359位的鹼基序列、序列號10所表示的鹼基序列的第1位～第1365位的鹼基序列、序列號12所表示的鹼基序列的第1位～第1371位的鹼基序列及序列號22所表示的鹼基序列的第1位～第1371位的鹼基序列所組成的組中的1個鹼基序列所組成的多核苷酸；或多核苷酸，其含有編碼具有選自由序列號5、11、13及23所組成的組中的1個胺基酸序列的蛋白質的多核苷酸)等。文檔編號C12P17/06GK101407816SQ200810169258公開日2009年4月15日申請日期2008年10月10日優先權日2007年10月12日發明者小野榮一郎,水谷正子,福井祐子,野口秋雄申請人:三得利株式會社