天冬氨酸和/或穀氨酸系胺基酸的生物製備方法和該方法用的添加劑的製作方法

2023-07-21 05:06:16

專利名稱：天冬氨酸和/或穀氨酸系胺基酸的生物製備方法和該方法用的添加劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及權利要求1-17天冬氨酸和/或穀氨酸系胺基酸的生物製備方法、權利要求18-23的丙酮酸羧化酶基因、權利要求24的基因構建體、權利要求25的載體、權利要求26-31的轉化細胞以及權利要求32-37的用途。
胺基酸具有很大的經濟價值，因為，胺基酸有各種各樣的用途。例如L-賴氨酸以及L-蘇氨酸、L-蛋氨酸和L-色氨酸可用作飼料添加劑，L-穀氨酸用作香料添加劑，L-異亮氨酸和L-酪氨酸用於製藥工業，L-精氨酸和L-異亮氨酸用作藥物或L-穀氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸用作合成精細化工品的原料。
製備各種胺基酸的一個優選方法是藉助於微生物的生物製備技術；因為用這些方法能直接獲得生物有效和光學活性形式的各種胺基酸，同時可使用廉價、易得的原料。微生物例如可使用穀氨酸棒桿菌和其同源物ssp.flavum和ssp.乳酵母(lactofermentum)(Liebl等人，Int J SystemBacteriol 1991，41255-260)，也可使用大腸桿菌和其有關細菌。
這些細菌以正常方式或只以生長需求量產生胺基酸，因此形成不過量的胺基酸，並且被回收。這是基於按各種方法控制細胞內胺基酸的生物合成的緣故。因此，去除控制機制以提高產率的各種方法已經是眾所周知的。在這些方法中，為了除去有效調節生物合成，例如引入胺基酸類似物。為此，現有技術公開了一種方法，該方法使用了抗L-酪氨酸和L-苯丙氨酸類似物的棒狀桿菌菌株(JP19037/1976和39517/1978)。同樣也公開了一種方法，該方法為了抑制控制機制而使用了抗L-賴氨酸或L-蘇氨酸類似物的細菌(EP0205849、GB2152509)。
此外，通過重組體DNA技術構建的微生物也是已知的，其中同樣是調節生物合成，在該生物合成中克隆並表達基因，該基因是編碼不再反饋抑制的關鍵酶。例如，眾所周知一種重組體它產生L-賴氨酸的細菌具有質粒編碼、抗反饋的天冬氨酸激酶(EP0381527)。同樣還公開了一種重組體它產生L-苯丙氨酸的細菌，該細菌具有抗反饋的預苯酚酸脫氫酶(JP123475/1986，EP0488424)。
除此以外，通過基因的過表達來提高胺基酸的產率，所述的基因不對胺基酸合成的反饋敏感性酶進行編碼。這裡例如通過提高雙氫吡啶二羧酸合成酶的合成改進賴氨酸的形成(EP0197335)。同樣通過提高蘇氨酸脫水酶的合成改進異亮氨酸的形成(EP0436886)。
為提高胺基酸產率進行了其他的嘗試，目的在於更好地製備中央物質交替(Zentralstoffwechsel)的細胞初級代謝物。眾所周知，通過重組體技術獲得的轉酮酶的過表達可改進L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸產物的形成(EP0600463)。而降低棒狀桿菌中烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的活性改進了芳香族胺基酸的形成(EP03331145)，相反，提高棒狀桿菌中烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的活性則增加了天冬氨酸系胺基酸的析出(EP0358940)。
在胺基酸的生長，特別是胺基酸生產條件下，三羧酸循環(Cyclus)必須連續、有效地用諸如草乙酸酯類的C4化合物補充，以代替胺基酸合成中提取的中間產物。直到不久之前，人們還認為棒狀桿菌中的烯醇丙酮酸磷酸羧化酶起所謂的添補作用(Kinoshita，《工業微生物生物學》，1985115-142，Benjamin/Cummings Publishing公司，倫敦；Liebl，《原核生物II》，19911157-1171，Springer Verlag N.Y.；Vallino和Stephanopoulos，《生物技術、生物工程》1993，41633-646)。但是，已經發現烯醇丙酮酸磷酸羧化酶負突變體與所有試驗介質的各種起始菌株同樣生長(Peters-Wendisch等人，FEMS Microbiology Letters1993，112269-274；Gubler等人，Appl Microbiol Biotechnol1994，40857-863)。結果表明烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基本上不生長，對於添補反應無作用或僅起次要作用。上述結果進一步說明在棒狀桿菌中必須至少有另一種酶，這種酶對合成生長所需的草乙酸酯起作用。實際上，最近還在棒狀桿菌的透化細胞中發現了丙酮酸羧化酶活性(Peters-Wendisch等人，《微生物學》，1997，1431095-1103)。這些酶受到了AMP、ADP和乙醯基輔酶A的有效抑制，並且在乳酸的存在下形成大量的碳源。從生長過程中這種酶主要補充三羧酸循環(Cycluses)這一點出發，可以預料提高基因表達或酶活性不會或者說充其量不會太提高屬於天冬氨酸系的胺基酸。還可以預料提高丙酮酸羧化酶的基因表達或酶活性同樣對生產其他系列的胺基酸沒有影響。
現在令人驚奇地發現在通過基因改變酶而提高丙酮酸羧化酶活性後和/或在提高丙酮酸羧化酶基因表達後，能提高天冬氨酸和/或穀氨酸系胺基酸的生物製備。結果表明特別是有丙酮酸羧化酶基因的提高拷貝數的菌株在培養基中析出約50％以上的賴氨酸、40％以上的蘇氨酸和150％以上的高絲氨酸菌株。結果進一步表明穀氨酸的產量也是令人驚奇地大幅度增加(特別參照實施例第6點和表4)。
為了提高酶活性而進行的丙酮酸羧化酶的基因改變最好通過內源基因的突變進行。這種突變既可按常規方法(例如通過UV輻射或突變誘發的化學品)進行，也可藉助於基因技術方法例如缺失、插入和/或核苷酸交換進行。
通過提高基因拷貝數和/或通過增強對基因表達有正影響的調節元件可提高丙酮酸羧化酶的基因表達。因此，調節元件的增強優選在轉錄平面上進行，其中尤其是提高轉錄信號。例如可按下列方式進行通過改變在結構基因上在先啟動子序列來提高啟動子的效果，或用有效啟動子完全交換啟動子。也可通過相應地影響有關丙酮酸羧化酶基因的調節基因來增強轉錄。必要時可通過調節基因序列的突變來影響在需調節丙酮酸羧化酶基因的DNA上結合調節蛋白的效果，使得轉錄增強並以此提高基因表達。但是，作為調節序列的丙酮酸羧化酶基因也可以是所謂的「增強子」，該增強子通過改善RNA聚合酶和DNA之間的交替作用同樣能提高丙酮酸羧化酶的基因表達。此外，也可增強翻譯，例如提高m-RNA的穩定性。
為了提高基因拷貝數，在一個基因構建體或載體中構建進丙酮酸羧化酶基因。基因構建體特別含有有關丙酮酸羧化酶基因的調節序列，優選是增強基因表達的調節序列。對於基因構建體中的丙酮酸羧化酶基因的構建來說，優選從棒狀桿菌屬的微生物菌株中分離的基因並轉化成產生胺基酸的微生物菌株，尤其是棒狀桿菌或轉化成大腸桿菌或粘質沙雷氏菌屬。對於本發明的方法，特別合適的是從穀氨酸棒狀桿菌或穀氨酸棒狀桿菌ssp.flavum或棒狀桿菌ssp.乳酵母中分離的基因。在分離基因後並用已知的載體在體外重組(例如參照Simon等人，《生物技術》，1983，1784-791；Eikmanns等人，《基因》，1991，10293-98)，通過電穿孔(Liebl等人，FEMS Microbiology Letters 1991，65299-304)或接合(Schafer等人《細菌學雜誌》，1990，1721663-1666)轉化成產生胺基酸的菌株。優選使用這樣的胺基酸產品作為宿主菌株，即它們在合成相應的胺基酸時失調(dereguliert)和/或使相應的胺基酸具有提高的輸出載體活性。此外，優選的是在中心代謝代謝物中含量高並且參預相應胺基酸合成的菌株和/或在不參預相應胺基酸合成的中心代謝代謝物中含量低，尤其是在負責競爭反應的代謝物中的菌株；即優選這樣的菌株，對相應的胺基酸生物合成法競爭的生物合成法具有降低的活性。尤其是抗L-天冬氨酸-β-甲酯(AME)的有檸檬酸-合成酶-活性降低的形成棒狀的(coyneformer)微生物菌株(EP0551614)。
在進行分離後獲得具有核苷酸序列的丙酮酸羧化酶基因，該基因編碼SEQ ID No.2列出的胺基酸序列或其等位基因變異體或具有SEQ ID No.1核苷酸165-3587的核苷酸序列或基本上相同作用的DNA序列。還可獲得這樣的基因，該基因具有SEQ ID No.1核苷酸20-109的核苷酸序列或基本上作用相同的DNA序列的預連結的啟動子。等位基因變異體或相同作用的DNA序列尤其包括官能團衍生物，它們是通過缺失、插入和/或取代核苷酸而由相應的序列中獲得的，其中酶活性或酶功能得到保持或甚至得到提高。最好在本發明的方法中使用這種丙酮酸羧化酶基因。
有或沒有在先啟動子或者有或沒有、有關的調節基因的丙酮酸羧酸酶基因，可在先或在後結合一個或多個DNA序列，以便在基因構建體中包含該基因。
優選將tac啟動子(lacIQ基因)在先連接到丙酮酸羧化酶基因，由此歸入調節序列。
通過克隆丙酮酸羧化酶基因獲得質粒，該質粒含有基因並且適於轉化胺基酸生產者。通過轉化獲得的細胞優選是含有可複製的基因，即染色體上的附加拷貝形式的基因的棒狀桿菌的轉化細胞，其中所述的基因拷貝是通過在基因組的任一位置上重組成為一體。實施例1.由穀氨酸棒狀桿菌克隆丙酮酸羧化酶基因由釀酒酵母(《生物化學雜誌》，1988，26311493-11497；Mol GenGenet 1991，229307-315)，人(Biochim Biophys Acta 1994，122746-52)、小鼠(Proc Natl Acad Sci，USA 1993，901766-1770)、埃及伊蚊屬(aegypti)(EMBL-基因庫登記號L36530)的所有至今已知的丙酮酸羧化酶(pyc-)基因的保藏部分或以及由結核分枝桿菌(EMBL-基因庫登記號U00024)開始合成PCR引物(MWG生物技術)。該引物相當於結核分枝桿菌pyc基因的鹼基810-831和1015-1037。用這些引物藉助於PCR按Innis等人的標準方法(PCR方案，《方法和應用導論》，1990，Academic出版)對於未產生的、均勻的引物從穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的染色體DNA(例如Eikmann等人公開，《微生物學》，1994，1401817-1828)中分離約200bp的片段，並進行擴增。200bp的大小符合pyc基因的要求。正如Sanger等人(Proc Natl Acad Sci USA 1977，745463-5467)所描述的，測序PCR產物。測序是用螢光標記的ddNTPs和DNA自動測序儀(生物系統使用)進行。
基於穀氨酸棒狀桿菌的DNA片段製備下列同源寡核苷酸pyc15′-CGTCTTCATCGAAATGAAC-3′pyc25′-ACGGTGGTGATCCGGCACT-3′將寡核苷酸用作PCR引物以分離由穀氨酸棒狀桿菌的丙酮酸羧化酶(pyc)基因用的探針。向穀氨酸棒狀桿菌染色體DNA和標記洋地黃毒苷的核苷酸的PCR反應中加入引物。按Boehringer Mannheim公司的『PCR DIG標記試劑盒』步驟進行反應。可用這種添加物擴增洋地黃毒苷標記的DNA片段，該片段的大小相當於約200bp的預定大小。然後使用由此製備的pyc探針，以便通過Southern印跡雜交以在穀氨酸棒狀桿菌的染色體DNA中以識別DNA片段，在該DNA片段上定位有pyc基因。對此，用限制酶HindIII、SphI、SaII、DraI、EcoRI和BamHI切割各2-5微克穀氨酸棒狀桿菌WT的染色體DNA，在20V 0.8％的瓊脂糖凝膠中凝膠電泳16小時分離獲得的相應大小的DNA片段。在將瓊脂糖凝膠中的DNA片段按Southern法變性和真空促進後(J Mol Biol 1975，98503-517)，用Pharmacia LKB的Vacu基因印跡裝置(Uppsala，瑞典)真空支持分離從凝膠基質轉移和固定到尼龍膜上(Schleicher和Schull，Dassel，瑞士的Nytran N13)，藉助於用鹼性磷酸酶轉變NBT/X-磷酸鹽，證明洋地黃毒苷標記。接著，可用pyc-DNA-探針雜交的染色體片段檢測下列物質17kb HindIII片段、6.5kb SaII片段和1.35kb EcoRI片段。
分離和亞克隆17kb HindIII片段。對此，在粘粒pHC79中使用由穀氨酸棒狀桿菌的染色體DNA得的粘粒基因庫，這代表了99％穀氨酸棒狀桿菌的基因組(Mol Microbiol 1992，6317-326)。按Sambrook等人的CaCl2法(《分子克隆》，實驗室手冊，1989，Cold Spring Habour實驗室印刷)用這種基因庫轉化大腸桿菌菌株DH5α並用50微克/升卡那酶素使每個LB-瓊脂板上平鋪(ausplattiert)了約300株菌落(總共5000株菌落)。接著將獲得的轉化體轉移到Nytran N13-濾膜中，為鹼性裂解細胞和變性DNA，在用0.5M NaOH和1.5M NaCl浸泡的Whatmann紙上將其溫育5分鐘。接著用1MTris/HCl pH7.5和1.5M NaCl進行中和。在溫育濾紙2×SSC後，通過366納米的UV輻射將釋放的DNA固定在濾膜上。接著在50℃下0.1％ SDS中振動3×SSC除去剩餘的細胞碎片。使用這種形式的濾膜用特異性pyc探針進行雜交，如Southern所公開的(J Mol Biol 1975，98，503-517)。由pyc探針雜交鑑別3個轉化體。按Birnboim的鹼性裂解法(Meth Enzymol1983，100243-255)用質粒-製劑從該轉化體中分離出粘粒DNA，接著通過限制和Southern印跡分析對存在的HindIII片段進行試驗。含40kb插入片段的粘粒pHC79-10總共攜帶了17kb HindIII片段並進一步進行分析。結果表明在用內切核酸酶SaII和EcoRI限制後，獲得了與染色體DNA相同的雜交片段，即6.5kb SaII片段和1.35kb EcRI片段。通過用HindIII限制從粘粒中分離出17kb HindIII片段並連接在同樣用HindIII切割的大腸桿菌載體pUC18上。在產生的載體pUCpyc中進行片段的限制分析。

圖1示出了片段的物理圖譜。2.丙酮酸羧化酶基因的測序在其他的亞克隆步驟中，通過用相應的限制酶如1.35kb EcoRI片段、1.6kb EcoRI-EcoRI-StuI片段以及一部分和0.85kb SaII-EcoRI片段搭接的1.6kb ClaI片段限制而從質粒pUCpyc中分離0.85kb SaII-EcoRI片段。通過連接，將該片段克隆在相應的限制載體pUC18中，接著按照如上所述的Sanger等人的方法進行測序(Proc Natl Acad Sci USA 1977，745463-5467)。用德國腫瘤研究中心(Heidelberg)的程序包HUSAR(釋放3.0)分析獲得的核苷酸序列。片段的序列分析獲得了3576bp完全敞開的讀框(Leseraster)，對1140胺基酸的蛋白質序列進行編碼。將得到的蛋白質序列與EMBL基因資料庫(Heidelberg)進行對比，表明與所有已知的丙酮酸羧化酶類似。人們發現高度的一致性(62％)是將結核分枝桿菌(EMBL基因庫登記號U00024)假定為丙酮酸羧化酶。在考慮到保存胺基酸交換的情況下，相似性為76％。與其他有機物的丙酮酸羧化酶對比，相似性為46-47％，類似的胺基酸為64-65％(《基因》，1997，19147-50；《細菌學雜誌》，1996，1785960-5970；Proc Natl Acad Sci USA1993，901766-1770；《生物化學雜誌》，1996，316631-637；EMBL基因庫登記號L36530；《生物化學雜誌》，1988，26311493-11497；Mol Gen Genet 1991，229307-315)。由這些結果得出克隆片段是來自穀氨酸棒狀桿菌的丙酮酸羧化酶基因。該基因的核苷酸序列是SEQ IDNo1，相應的胺基酸序列為SEQ ID No2。3.丙酮酸羧化酶基因的過表達為了過表達來自穀氨酸棒狀桿菌的丙酮酸羧化酶基因，將來自質粒pUCpyc的基因作為6.2kb SspI-Scal片段克隆在大腸桿菌-穀氨酸棒狀桿菌振動載體pEK0中(《基因》1991，10293-98)，用限制內切核酸酶EcoRI和PstI切割該載體。藉助於科列諾聚合酶處理，將突出端添滿(EcoRI)或連接(abgedaut)(PstI)成平端並且將線性載體與6.2kb SspI-ScaI片段連接。首先將獲得的構建體pEK0pyc轉化在大腸桿菌菌株DH5α，接著從獲得的轉化體中分離質粒DNA，通過限制控制插入片段的正確性。接著通過電穿孔將DNA加入到菌株SP733中(FEMS Microbiol Lett 1989，65299-304)。該菌株是限制性負穀氨酸棒狀桿菌菌株R127的突變體(Dechema生物技術會議1990，4323-327，化學出版社)，它們通過化學突變製得，其特徵在於它不可能在有作為單個碳源的丙酮酸和乳酸的基本培養基上生長(《微生物學》1997，1431095-1103)。這種表型是以丙酮酸羧化酶基因缺損而識別的，可通過引入來自穀氨酸棒狀桿菌的丙酮酸羧化酶基因進行補償，即質粒pEK0pyc攜帶的菌株，在有作為單個碳源的乳酸基本培養基上具有生長的能力的與起始菌株反。因此，結果證明基因編碼了官能性的丙酮酸羧化酶。
此外，質粒pEK0pyc通過電穿孔被轉化成穀氨酸棒狀桿菌野生型ATCC13032。與有關的野生型ATCC 13032相比，研究所製成的菌株WT(pEK0pyc)的丙酮酸羧化酶活性。在有0.5％乳酸的絡合介質(Luria-Bertani，《分子克隆》，實驗手冊，1989，Cold Spring Harbour實驗室出版)中，並在有2％乳酸或4％葡萄糖的基本培養基上培育菌株，並且按Peters-Wendisch等人描述的相應方法進行丙酮酸羧化酶試驗(《微生物學》1997，1431095-1103)。分析結果(表1)表明pEK0-pyc-攜帶的菌株中丙酮酸羧化酶活性比起始菌株高約4倍。4.通過穀氨酸棒狀桿菌菌株DG52-5中的丙酮酸羧化酶基因的過表達增強賴氨酸的積累為了檢測基因對賴氨酸生產菌株DG52-5中的丙酮酸羧化酶基因的過表達效果(《基因微生物雜誌》1988，1343221-3229)，使用表達載體pVWEX1以促進IPTG可誘導表達。在該載體中無啟動子克隆pyc基因。為此，先合成PCR引物(根據SEQ ID No.1，在核苷酸序列中，引物1＝位置112-133；引物2＝位置373-355)並藉助於PCR擴增丙酮酸羧化酶基因的261bp的無啟動子的開始範圍。如此地選擇引物，以使得引物1用PstI切割位點，引物2用BamHI切割位點。PCR後分離製得的274bp PCR產物，以連接多聯體和接著用限制酶PstI和BamHI切割，通過乙醇沉澱濃縮限制產物，接著與切割的PstI-BamIII的載體pVWEXI連接。通過限制試驗獲得構建體pVWEXI-PCR。通過RcaI-Klenow-SaII處理從載體pEK0pyc中分離pyc基因的末端範圍並連接到BamHI-Klenow-SalI處理的載體pVWEX1-PCR上。通過限制酶切作圖分析獲得的構建體pVWX1pyc。圖2示出了質粒的物理圖譜。
通過電穿孔將質粒引入到穀氨酸棒狀桿菌菌株DG52-5中。作為對照，在無插入片段的情況下用載體pVWEXI轉化菌株DG52-5，對比3種不同轉化體的L賴氨酸析出。對此，在絡合介質中(2×TY；《分子克隆》，實驗室手冊，1989，Cold Spring Harbour實驗室出版，含有50微克/升卡那黴素)培育DG52-5(pVWEXI)1、2和3以及DG52-5(pVWEXIpyc)3、4和6，並由各預培養基中分別接種各發酵介質CGXII(《細菌學雜誌》1993，1755595-5603)。為使質粒保持穩定，該介質還含有卡那黴素。每次進行2種平行添加，其中向一個燒瓶中添加200微克IPTG/毫升，而第二個燒瓶不含IPTG。在30℃、在120Upm的旋轉搖動器上培養48小時後，測定在該介質中積累的賴氨酸量。用高壓液相色譜法進行胺基酸濃度的測量(《色譜雜誌》，1983，266471-482)。表2示出了發酵結果，其中所給出的值是進行各種克隆由每3次試驗得出的平均值。結果表明丙酮酸羧化酶基因的過表達導致介質中賴氨酸的積累增加約50％。因此，為了大大提高L-賴氨酸的形成，一種方法是使用隱蔽的和公開的基因作為丙酮酸羧化酶的補充酶。5.通過穀氨酸棒狀桿菌菌株DM368-3中的丙酮酸羧化酶基因的過表達增強蘇氨酸和高絲氨酸的積累與試驗L-賴氨酸的形成類似，也通過對丙酮酸羧化酶基因的過表達檢測在培養上清液中蘇氨酸的積累。對此，按第4點描述，用質粒pVWEX1pyc以及作為對照用質粒pVWEX1轉化蘇氨酸產物菌株穀氨酸棒狀桿菌DM368-3(DegussaAG)，檢測每3種不同轉化體的蘇氨酸的析出。對此，在絡合介質中(2×TY，含有50微克/升卡那黴素)培育DM368-3(pVWEXI)1、2和3以及DM368-3(pVWEXIpyc)1、2和3，由各預培養基中的發酵介質CGXII(《細菌學雜誌》1993，1755595-5603)進行分別接種。為使質粒保持穩定，該介質還含有卡那黴素。每次進行2個平行添加，其中向一個燒瓶中添加200微克IPTG/毫升，而第二個燒瓶不含IPTG。在30℃、在120Upm的旋轉搖動器上培養48小時後，測定在該介質中積累的蘇氨酸量。使用高壓液相色譜法進行胺基酸濃度的測量(《色譜雜誌》，1983，266471-482)。表3示出了發酵結果，其中所給出的值是進行各種克隆由每3次試驗得出的平均值。結果表明丙酮酸羧化酶基因的過表達導致介質中蘇氨酸的濃度增加約40％。因此，為了大大提高L-蘇氨酸的形成，一種方法是使用隱蔽的和公開的基因作為丙酮酸羧化酶的補充酶。
胺基酸濃度的測定進一步表明令人驚奇地是有過表達的丙酮酸羧化酶基因的菌株使在介質中析出的高絲氨酸比沒有過表達的菌株高出約150％。相應的結果，同樣示於表3，這很明顯，通過本發明方法不僅蘇氨酸而且高絲氨酸都有重大的改良。6.通過野生型穀氨酸棒狀桿菌菌株中的丙酮酸羧化酶基因的過表達增強穀氨酸的積累與試驗L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-高絲氨酸的形成類似(參見上文第4和5點)，也通過對丙酮酸羧化酶基因的過表達檢測在培養基上清液中穀氨酸的積累。對此，如第4點的描述，用質粒pVWEX1pyc以及作為對照用質粒pVWEX1轉化野生型穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032，檢測每2種不同轉化體的穀氨酸的析出。對此，在絡合介質中(2×TY，含有50微克/升卡那黴素)培育穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032(pVWEXIpyc)D1和D2以及穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032(pVWEXIpyc)1和2，由各預培養基中分別接種發酵介質CGXII(《細菌學雜誌》1993，1755595-5603)。為使質粒保持穩定，該介質還含有卡那黴素。為了誘導穀氨酸析出，在接種後6小時在介質中加入25毫克Tween60/毫升。進行2套平行添加，其中向一個燒瓶中添加200微克IPTG/毫升，而第二個燒瓶不含IPTG。在30℃、在120Upm的旋轉搖動器上培養48小時後，測定在該介質中積累的穀氨酸量。同樣用高壓液相色譜法進行胺基酸濃度的測量(《色譜雜誌》，1983，266471-482)。表4示出了發酵結果，其中所給出的值是由有不同克隆的每2次試驗得出的平均值。結果表明丙酮酸羧化酶基因的過表達導致介質中穀氨酸的濃度增加約500％。因此，為了大大提高L-穀氨酸的形成，一種方法是用隱蔽的和公開的基因作為丙酮酸羧酸酶的添補酶。
表1
表2
>表3
表4
序列記錄(1)一般數據(i)申請人(A)名稱Juelich GmbH研究中心(B)街道Postfach 1913(C)地點Juelich(E)國家德國(F)郵編52425(ii)本發明的特徵丙酮酸羧酸酶(iii)序列的總數2(iv)計算機易讀文本(A)數據載體Floppy盤(B)計算機IBM PC compatible(C)驅動系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patenln Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)SEQ ID No1數據(i)序列標記(A)長度3728鹼基對(B)種類核苷酸(C)束狀形式單束(D)拓撲學線性(ii)分子種類基因組-DNA(xi)序列描述SEQ ID No1CGCAACCGTG CTTGAAGTCG TGCAGGTCAG GGGAGTGTTG CCCGAAAACA TTGAGAGGAA 60AACAAAAACC GATGTTTGAT TGGGGGAATC GGGGGTTACG ATACTAGGAC GCAGTGACTG 120CTATCACCCT TGGCGGTCTC TTGTTGAAAG GAATAATTAC TCTAGTGTCG ACTCACACAT 180CTTCAACGCT TCCAGCATTC AAAAAGATCT TGGTAGCAAA CCGCGGCGAA ATCGCGGTCC 240GTGCTTTCCG TGCAGCACTC GAAACCGGTG CAGCCACGGT AGCTATTTAC CCCCGTGAAG 300ATCGGGGATC ATTCCACCGC TCTTTTGCTT CTGAAGCTGT CCGCATTGGT ACCGAAGGCT 360CACCAGTCAA GGCGTACCTG GACATCGATG AAATTATCGG TGCAGCTAAA AAAGTTAAAG 420CAGATGCCAT TTACCCGGGA TACGGCTTCC TGTCTGAAAA TGCCCAGCTT GCCCGCGAGT480GTGCGGAAAA CGGCATTACT TTTATTGGCC CAACCCCAGA GGTTCTTGAT CTCACCGGTG540ATAAGTCTCG CGCGGTAACC GCCGCGAAGA AGGCTGGTCT GCCAGTTTTG GCGGAATCCA600CCCCGAGCAA AAACATCGAT GAGATCGTTA AAAGCGCTGA AGGCCAGACT TACCCCATCT660TTGTGAAGGC AGTTGCCGGT GGTGGCGGAC GCGGTATGCG TTTTGTTGCT TCACCTGATG720AGCTTCGCAA ATTAGCAACA GAAGCATCTC GTGAAGCTGA AGCGGCTTTC GGCGATGGCG780CGGTATATGT CGAACGTGCT GTGATTAACC CTCAGCATAT TGAAGTGCAG ATCCTTGGCG840ATCACACTGG AGAAGTTGTA CACCTTTATG AACGTGACTG CTCACTGCAG CGTCGTCACC900AAAAAGTTGT CGAAATTGCG CCAGCACAGC ATTTGGATCC AGAACTGCGT GATCGCATTT960GTGCGGATGC AGTAAAGTTC TGCCGCTCCA TTGGTTACCA GGGCGCGGGA ACCGTGGAAT 1020TCTTGGTCGA TGAAAAGGGC AACCACGTCT TCATCGAAAT GAACCCACGT ATCCAGGTTG 1080AGCACACCGT GACTGAAGAA GTCACCGAGG TGGACCTGGT GAAGGCGCAG ATGCGCTTGG 1140CTGCTGGTGC AACCTTGAAG GAATTGGGTC TGACCCAAGA TAAGATCAAG ACCCACGGTG 1200CAGCACTGCA GTGCCGCATC ACCACGGAAG ATCCAAACAA CGGCTTCCGC CCAGATACCG 1260GAACTATCAC CGCGTACCGC TCACCAGGCG GAGCTGGCGT TCGTCTTGAC GGTGCAGCTC 1320AGCTCGGTGG CGAAATCACC GCACACTTTG ACTCCATGCT GGTGAAAATG ACCTGCCGTG 1380GTTCCGACTT TGAAACTGCT GTTGCTCGTG CACAGCGCGC GTTGGCTGAG TTCACCGTGT 1440CTGGTGTTGC AACCAACATT GGTTTCTTGC GTGCGTTGCT GCGGGAAGAG GACTTCACTT 1500CCAAGCGCAT CGCCACCGGA TTCATTGCCG ATCACCCGCA CCTCCTTCAG GCTCCACCTG 1560CTGATGATGA GCAGGGACGC ATCCTGGATT ACTTGGCAGA TGTCACCGTG AACAAGCCTC 1620ATGGTGTGCG TCCAAAGGAT GTTGCAGCTC CTATCGATAA GCTGCCTAAC ATCAAGGATC 1680TGCCACTGCC ACGCGGTTCC CGTGACCGCC TGAAGCAGCT TGGCCCAGCC GCGTTTGCTC 1740GTGATCTCCG TGAGCAGGAC GCACTGGCAG TTACTGATAC CACCTTCCGC GATGCACACC 1800AGTCTTTGCT TGCGACCCGA GTCCGCTCAT TCGCACTGAA GCCTGCGGCA GAGGCCGTCG 1860CAAAGCTGAC TCCTGAGCTT TTGTCCGTGG AGGCCTGGGG CGGCGCGACC TACGATGTGG 1920CGATGCGTTT CCTCTTTGAG GATCCGTGGG ACAGGCTCGA CGAGCTGCGC GAGGCGATGC 1980CGAATGTAAA CATTCAGATG CTGCTTCGCG GCCGCAACAC CGTGGGATAC ACCCCGTACC 2040CAGACTCCGT CTGCCGCGCG TTTGTTAAGG AAGCTGCCAG CTCCGGCGTG GACATCTTCC 2100GCATCTTCGA CGCGCTTAAC GACGTCTCCC AGATGCGTCC AGCAATCGAC GCAGTCCTGG2160AGACCAACAC CGCGGTAGCC GAGGTGGCTA TGGCTTATTC TGGTGATCTC TCTGATCCAA2220ATGAAAAGCT CTACACCCTG GATTACTACC TAAAGATGGC AGAGGAGATC GTCAAGTCTG2280GCGCTCACAT CTTGGCCATT AAGGATATGG CTGGTCTGCT TCGCCCAGCT GCGGTAACCA2340AGCTGGTCAC CGCACTGCGC CGTGAATTCG ATCTGCCAGT GCACGTGCAC ACCCACGACA2400CTGCGGGTGG CCAGCTGGCA ACCTACTTTG CTGCAGCTCA AGCTGGTGCA GATGCTGTTG2460ACGGTGCTTC CGCACCACTG TCTGGCACCA CCTCCCAGCC ATCCCTGTCT GCCATTGTTG2520CTGCATTCGC GCACACCCGT CGCGATACCG GTTTGAGCCT CGAGGCTGTT TCTGACCTCG2580AGCCGTACTG GGAAGCAGTG CGCGGACTGT ACCTGCCATT TGAGTCTGGA ACCCCAGGCC2640CAACCGGTCG CGTCTACCGC CACGAAATCC CAGGCGGACA GTTGTCCAAC CTGCGTGCAC2700AGGCCACCGC ACTGGGCCTT GCGGATCGTT TCGAACTCAT CGAAGACAAC TACGCAGCCG2760TTAATGAGAT GCTGGGACGC CCAACCAAGG TCACCCCATC CTCCAAGGTT GTTGGCGACC2820TCGCACTCCA CCTCGTTGGT GCGGGTGTGG ATCCAGCAGA CTTTGCTGCC GATCCACAAA2880AGTACGACAT CCCAGACTCT GTCATCGCGT TCCTGCGCGG CGAGCTTGGT AACCCTCCAG2940GTGGCTGGCC AGAGCCACTG CGCACCCGCG CACTGGAAGG CCGCTCCGAA GGCAAGGCAC3000CTCTGACGGA AGTTCCTGAG GAAGAGCAGG CGCACCTCGA CGCTGATGAT TCCAAGGAAC3060GTCGCAATAG CCTCAACCGC CTGCTGTTCC CGAAGCCAAC CGAAGAGTTC CTCGAGCACC3120GTCGCCGCTT CGGCAACACC TCTGCGCTGG ATGATCGTGA ATTCTTCTAC GGCCTGGTCG3180AAGGCCGCGA GACTTTGATC CGCCTGCCAG ATGTGCGCAC CCCACTGCTT GTTCGCCTGG3240ATGCGATCTC TGAGCCAGAC GATAAGGGTA TGCGCAATGT TGTGGCCAAC GTCAACGGCC3300AGATCCGCCC AATGCGTGTG CGTGACCGCT CCGTTGAGTC TGTCACCGCA ACCGCAGAAA3360AGGCAGATTC CTCCAACAAG GGCCATGTTG CTGCACCATT CGCTGGTGTT GTCACCGTGA3420CTGTTGCTGA AGGTGATGAG GTCAAGGCTG GAGATGCAGT CGCAATCATC GAGGCTATGA3480AGATGGAAGC AACAATCACT GCTTCTGTTG ACGGCAAAAT CGATCGCGTT GTGGTTCCTG3540CTGCAACGAA GGTGGAAGGT GGCGACTTGA TCGTCGTCGT TTCCTAAACC TTTCTGTAAA3600AAGCCCCGCG TCTTCCTCAT GGAGGAGGCG GGGCTTTTTG GGCCAAGATG GGAGATGGGT3660GAGTTGGATT TGGTCTGATT CGACACTTTT AAGGGCAGAG ATTTGAAGAT GGAGACCAAG3720GCTCAAAG(2)SEQ ID No數據2(i)序列標記(A)長度1140胺基酸(B)種類胺基酸(C)束狀形式單束(D)拓撲學線性(ii)分子種類蛋白質(xi)序列描述SEQ ID No2Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu1 5 10 15Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu20 25 30Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly35 40 45Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu50 55 60Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala65 70 75 80Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu85 90 95Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr100 105 110Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser115 120 125Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu130135 140Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly145 150 155 160Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg165 170 175Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr180 185 190Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr
195 200 205Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu210 215 220Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225 230 235 240Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His245 250 255Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe260 265 270Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val275 280 285Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln290 295 300Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305 310 315 320Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu325 330 335Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile340 345 350Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile355 360 365Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala370 375 380Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385 390 395 400Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala405 410 415Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile420 425 430Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg435 440 445Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro450 455 460Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val465 470 475 480Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro
485 490 495Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser500 505 510Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu515 520 525Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala530 535 540His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro545 550 555 560Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu565 570 575Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu580 585 590Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val595 600 605Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro610 615 620Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser625 630 635 640Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln645 650 655Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala660 665 670Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys675 680 685Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys690 695 700Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg705 710 715 720Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp725 730 735Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala740 745 750Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala755 760 765Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile
770 775 780Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785 790 795 800Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr805 810 815Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg820 825 830His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr835 840 845Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala850 855 860Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865 870 875 880Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp885 890 895Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser900 905 910Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp915 920 925Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys930 935 940Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945 950 955 960Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro965 970 975Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr980 985 990Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg995 10001005Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg101010151020Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val1025103010351040Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser104510501055Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys
106010651070Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala107510801085Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala109010951100Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp1105111011151120Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile112511301135Val Val Val Ser1140
權利要求
1.天冬氨酸和/或穀氨酸系胺基酸的微生物製備方法，其特徵在於通過酶的基因改變和/或產生相應胺基酸的微生物的丙酮酸羧化酶的基因表達提高丙酮酸羧化酶的活性。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於通過內源性丙酮酸羧化酶基因的突變產生具有較高丙酮酸羧化酶活性的酶。
3.根據權利要求1或2的方法，其特徵在於通過提高基因拷貝數提高丙酮酸羧化酶的基因表達。
4.根據權利要求3的方法，其特徵在於為提高基因拷貝數，在基因構建體中引入丙酮酸羧化酶基因。
5.根據權利要求4的方法，其特徵在於在基因構建體中引入含有有關丙酮酸羧化酶基因的調節基因序列的基因。
6.根據權利要求4或5的方法，其特徵在於用含基因的基因構建體轉化產生相應胺基酸的微生物。
7.根據權利要求6的方法，其特徵在於用含基因的基因構建體轉化棒狀桿菌類的微生物。
8.根據權利要求6或7的方法，其特徵在於使用微生物進行轉化，其中參預相應胺基酸合成的酶失調和/或對相應胺基酸具有高的輸出載體活性。
9.根據權利要求6-8任一項的方法，其特徵在於使用微生物進行轉化，其中提高參預相應胺基酸合成的中央代謝代謝物的含量。
10.根據權利要求6-9任一項的方法，其特徵在於使用微生物進行轉化，其中與相應胺基酸合成法競爭的生物合成法使活性降低。
11.根據上述任一項權利要求的方法，其特徵在於從棒狀桿菌屬微生物菌株中分離丙酮酸羧化酶基因。
12.根據上述任一項權利要求的方法，其特徵在於通過增強轉錄信號提高基因表達。
13.根據上述任一項權利要求的方法，其特徵在於對丙酮酸羧化酶基因tac啟動子在先。
14.根據權利要求13的方法，其特徵在於tac啟動子是有關調節序列。
15.根據上述任一項權利要求的方法，其特徵在於使用具有SEQ IDNo.2給出的胺基酸序列的基因和其等位基因變異編碼的核苷酸序列的基因作為丙酮酸羧化酶基因。
16.根據權利要求15的方法，其特徵在於使用具有根據SEQ ID No.1核苷酸165-3587的核苷酸序列的基因或基本起相同作用的DNA序列的基因作為丙酮酸羧化酶基因。
17.根據上述任一項權利要求的方法，製備賴氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸和/或精氨酸。
18.編碼具有SEQ ID No.2給出的胺基酸序列和/或等位基因變異的核苷酸序列的丙酮酸羧化酶基因。
19.根據權利要求18的具有SEQ ID Nr.1核苷酸165-3587的核苷酸序列或基本起相同作用的DNA序列的丙酮酸羧化酶基因。
20.根據權利要求18或19的具有SEQ ID No.1核苷酸20-109的核苷酸序列或基本起相同作用的DNA序列的在先啟動子的丙酮酸羧化酶基因。
21.根據權利要求18或19的具有在先tac啟動子的丙酮酸羧化酶基因。
22.根據權利要求21的具有有關啟動子的調節序列的丙酮酸羧化酶基因。
23.根據權利要求18-20任一項的具有其有關的調節基因序列的丙酮酸羧化酶基因。
24.含權利要求18-23任一項丙酮酸羧化酶基因的基因構建體。
25.含權利要求18-23任一項丙酮酸羧化酶基因或權利要求24基因構建體的載體。
26.含權利要求18-23任一項複製形式的丙酮酸羧化酶基因或權利要求24基因構建體的轉化細胞。
27.根據權利要求26的轉化細胞，含有權利要求25的載體。
28.根據權利要求26或27的轉化細胞，其特徵在於它們屬於棒狀桿菌屬。
29.根據權利要求26-28任一項的轉化細胞，其特徵在於參預相應胺基酸合成的酶和/或參預相應胺基酸輸出的酶失調。
30.根據權利要求26-29任一項的轉化細胞，其特徵在於它們含有參預相應胺基酸合成的中央代謝的代謝物具有高含量。
31.根據權利要求26-30任一項的轉化細胞，其特徵在於它們含有未參預相應胺基酸合成的中央代謝的代謝物具有低含量。
32.丙酮酸羧酸酶基因的用途，用於提高來自天冬氨酸和/或穀氨酸系菌株的微生物胺基酸產量。
33.根據權利要求32的用途，其特徵在於使用一種編碼有高丙酮酸羧化酶活性的酶的突變丙酮酸羧化酶基因。
34.根據權利要求32或33的用途，其特徵在於用含丙酮酸羧化酶基因的基因構建體轉化產生相應胺基酸的微生物。
35.根據權利要求34的用途，其特徵在於基因構建體還含有調節基因序列。
36.根據權利要求32-35任一項的用途其特徵在於使用來自棒狀桿菌的丙酮酸羧化酶基因。
37.根據權利要求32-36的用途，其特徵在於使用棒狀桿菌作為產生胺基酸的微生物。
全文摘要
本發明涉及天冬氨酸和/或穀氨酸系胺基酸的微生物製備方法,其中通過基因改變酶和/或產生相應胺基酸的微生物的丙酮酸羧化酶基因表達而提高丙酮酸羧化酶的活性。另外,本發明涉及丙酮酸羧化酶基因和可用於本發明方法的添加劑。
文檔編號C12N15/52GK1275167SQ98809838
公開日2000年11月29日 申請日期1998年9月30日 優先權日1997年10月4日
發明者伯恩德·艾克曼斯, 佩特拉·彼得斯－溫迪希, 赫爾曼·薩姆 申請人:於利希研究中心