溶液中蛋白質的穩定化的製作方法
2023-07-21 13:12:06 1
專利名稱：溶液中蛋白質的穩定化的製作方法
技術領域：
本發明尤其涉及作為容納或儲存特別是維生素K依賴性凝結蛋白質，例如因子VIIa的蛋白質的藥物製劑的內壁材料的用途，所述材料減少目的蛋白質發生造成目的蛋白質活性喪失的二聚、寡聚和/或多聚化和/或其它可能過程的傾向或使其最小化。本發明尤其涉及蛋白質液體製劑-尤其是水性液體製劑-的容納和暫時儲存。
背景技術：
在本發明的上下文中，對已知是維生素K依賴性凝結酶原蛋白質的蛋白質組群尤其有興趣，其中因子VII(FVII)是一例。討論的蛋白質構成參與已知是止血的天然發生生理過程的一類重要的凝結因子，它們均有相似的蛋白質結構域結構並且具有氨基末端γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域，帶有9至12個Gla殘基。應答由例如外傷或手術過程引起的血管壁損傷的結果造成的流血事件而發生的止血過程由組織因子(TF)和FVII的激活形式(FVIIa)之間複合物的形成而啟動，所述組織因子在血管壁損傷後開始暴露於循環血，FVIIa以相當於總FVII蛋白質量的大約1％的量存在於血液循環中。這個複合物錨定於有TF的細胞，它激活因子X(FX)和因子IX(FIX)以在細胞表面形成它的激活形式(分別是FXa和FIXa)。FXa將凝血酶原激活為凝血酶，凝血酶反過來激活因子VIII(FVIII)、因子V(FV)、因子XI(FXI)和因子XIII(FXIII)以形成它們的激活形式(分別是FVIIIa、FVa、FXIa和FXIIIa)。
此外，止血這個起始步驟中形成的有限量的凝血酶也通過造成血小板形狀改變並暴露其表面帶電荷磷脂來激活血小板。激活的血小板表面形成其後進一步FX激活和全凝血酶產生的模板。激活的血小板表面上進一步的FX激活經由激活的血小板表面上形成的FIXa-FVIIIa複合物而發生，然後FXa將仍在表面的凝血酶原轉化為凝血酶。然後凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，纖維蛋白是不溶的並穩定初始血小板塞。這個過程是腔室化的，即局限於TF表達或暴露的位點，因而最小化凝結系統全身激活的危險。FXIII催化的纖維蛋白纖維的交聯進一步穩定形成塞子的不溶性纖維蛋白。
本發明的上下文中因子VII(FVII)是尤其有興趣的蛋白質；FVII蛋白質出現在哺乳動物(包括人)和無數其它動物種類(例如某些魚)中。FVII主要以單鏈酶原存在於血漿中，酶原被FXa切割成其兩個鏈的激活形式，稱為FVIIa。重組激活的VIIa因子(rFVIIa)已經被開發為促止血劑。研究顯示rFVIIa的給予導致血友病研究對象快速和高度有效的促止血反應，他們經歷由於抗體的形成而不能用凝血因子產物例如FVIII或FIX治療的流血事件。此外，用FVIIa能成功地治療有VII因子缺陷的流血的研究對象以及有正常凝結系統但經歷過度流血(例如嚴重外傷的結果)的研究對象。在這些研究中，沒有遭遇rFVIIa的不良副作用(尤其是血栓栓塞的發生)額外外源性FVIIa的給予增加了激活的血小板表面凝血酶的形成，這個已經通過缺乏FIX或FVIII因而缺乏完全凝血酶形成最有效途徑的血友病研究對象而證實。同樣，在顯示降低的血小板計數或缺陷性血小板功能的研究對象中，額外FVIIa的給予增加了凝血酶的形成。
重組人FVIIa(rhFVIIa)市售製品名稱為NovoSevenTM(諾和諾德製藥，丹麥)，它供應為小瓶中的冷凍乾燥製劑，含有例如1.2mgrhFVIIa，5.84mg NaCl，2.94mg CaCl2·2H2O，2.64mg甘氨醯甘氨酸(glygly)，0.14mg PolysorbateTM80，60.0mg甘露醇，並且在使用前用2.0ml注射用水(WFI)重構。一旦重構，如果儲存在最高25℃，所得到的溶液可在24小時內使用。目前沒有液體或高濃縮FVIIa製劑可以購買得到，但是足夠活性和穩定性的FVIIa液體製劑顯然是非常期望的。
一般，溶液中蛋白質的穩定性受尤其是例如離子強度、pH、溫度、冷凍/解凍重複循環或暴露於剪切力的因素影響。作為各種物理或物理化學不穩定性以及化學不穩定性的結果，活性蛋白質會喪失，物理或物理化學不穩定性包括發生變性和/或聚集(可溶性和/或不溶性聚集物的形成)的傾向，化學不穩定包括性例如發生水解、脫醯胺和/或氧化的傾向，這裡僅例舉一部分。對於蛋白質藥物穩定性的全面綜述，見，例如，Manning等人，藥物研究6903-918(1989)。
雖然廣泛認識到蛋白質不穩定性發生的可能性，對特定蛋白質所期待的不穩定性問題的類型作業可靠的預言多半是不可能的。很多種不穩定性能導致蛋白質副產品或蛋白質衍生物的形成，展現例如降低的活性、增加的毒性和/或增加的免疫原性。因而，例如，在作為絲氨酸蛋白酶的FVIIa的情況下，由於自體水解的蛋白質片段化是必須考慮的降解途徑。
蛋白質從溶液中沉澱最輕可導致劑量形式和量的非同質性以及注射器的堵塞，或者最嚴重地導致治療研究對象的血栓。此外，翻譯後修飾，例如蛋白質氨基末端某些穀氨酸殘基的γ-羧基化或糖類側鏈的引入，提供了儲存時可能容易受化學修飾影響的位點。
因而，蛋白質任何藥物製劑的安全性和有效性與其穩定性直接有關。在這方面，維持液體劑量形式的穩定性一般比固體製劑更加迫切，例如打算在給藥前立刻溶於或重構在合適的液體載體(vehicle)的冷凍乾燥製劑，由於液相中分子運動更加大的可能性，因而分子相互作用的可能性增加。另外，由於蛋白質濃度增加時聚集物形成有更大的傾向性，維持蛋白質濃縮液體製劑的穩定性一般比更加稀釋的液體製劑要費事。
本發明來自發明者的觀察，就是儲存在某些類型的容器中的FVII(在這個情況下例如FVIIa)水性液體製品/製劑展現了不令人滿意地高速率和/或高程度的聚集物形成。在這些觀察的基礎上，本發明進行了導致FVII以及相關類型蛋白質的液相穩定性顯著改善的措施的研究。
發明簡述本發明者的研究顯示就聚集物形成(雙體、寡聚體或多聚體)而言，水溶液(即水性製劑)中因子VIIa(FVIIa)的穩定性受組成儲存了水性製劑的容器內壁材料之材料的性質顯著影響，本發明者鑑別出來許多類型的材料，就聚集物形成(和其它可能形式的降解)最小化因而蛋白質活性損失最小化而言，它們似乎是期望的材料。
如上面已經提到地，FVII是共有相似蛋白質結構域結構並在氨基末端具有含有從9至12個γ-羧基穀氨酸(Gla)殘基的Gla結構域的許多蛋白質(同樣地，前面提到是所謂的維生素K依賴性凝結酶原蛋白質)中的一個；這類蛋白質在下面有時為了方便指的是「Gla結構域蛋白質」。似乎不僅FVII而且這個類型其它蛋白質的生理活性形式(FVIIa)的形成涉及尤其是這些蛋白質中Gla結構域對鈣離子(Ca2+)結合的親和力。基於本發明者得到的FVII(作為FVIIa)的結果(見此處提供的有指導意義的實例)指出，在本發明的上下文中，通過使用某些類型材料作為容器內壁材料而觀察到的蛋白質聚集物形成的最小化-以廣義反轉方式-與內壁材料能夠釋放某些金屬離子，特別是某些三價和可能是二價金屬離子進入溶液有關聯，相信這個結論可以外推到除了FVII以外的Gla結構域蛋白質。
沒有束縛於任何特定的理論，本發明的一個方面涉及選自下面的材料作為容器內壁材料的用途氧化矽塗層玻璃、矽氧烷塗層玻璃、非環形烯烴聚合物、環烯聚合物和環烯/線性烯烴共聚物，所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成壁部分的一部分的一個或多個閉合(closure)部分，並且含有具有9-12個Gla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質製劑。
本發明另一個相關方面提供了至少部分填充的容器，具有選自上面剛剛提到的那些作為容器內壁材料的材料，所述容器包含(1)壁部分和(2)不構成壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有9-12個Cla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質製劑。
關於本發明各個方面和實施例的進一步的細節描述如下。
實驗部分實施例實施例1不同材料製成的容器中二聚體/寡聚體的形成新鮮製備的具有pH5.0(通過加入小分裝的0.1M或1M HCl或NaOH調節的)的水性rFVIIa製劑的部分儲存在下面表1詳述的各種材料製成的小瓶中於30℃共12周。rFVIIa製劑有如下的組合物rFVIIa 1mg/ml氯化鈣 1.47mg/ml氯化鈉 2.92mg/ml甘氨醯甘氨酸 1.32mg/ml
組氨酸1.55mg/ml乙酸鈉0.82mg/ml分別在0時間點和在2、4、8和12周後通過凝膠滲透高效液相色譜(GP-HPLC)測定二聚體+寡聚體的百分含量(表示為組合物中原來FVIIa量的百分數)，在Waters Protein PakTM300SW柱7.5×300上運行，使用0.2M硫酸銨，pH7.0作為流動相；流速0.5ml/min。通過在分光光度計法在215nm進行檢測。結果總結在下面表1中。
從結果看很明顯地當I型玻璃容器經清洗和加熱(消毒)後，容器中rFVIIa二聚體+寡聚體的形成大大地降低了，但是氧化矽塗層I型玻璃小瓶和CZTM樹脂小瓶得到了最好的結果，就二聚體/寡聚體形成的最小化而言都表現地大約一樣地好。
表1.
A未處理玻璃小瓶，I型玻璃(矽硼酸玻璃)，Ph.Eur。
BI型玻璃(Ph.Eur.)小瓶，用90℃水清洗然後加熱至300℃。
C氧化矽塗層I型玻璃(Ph.Eur.)小瓶(Schott，Type I plus)。
DCZTM樹脂塑料小瓶(Daikyo Seiko)。
實施例2盒子(cartridge)中二聚體/寡聚體的形成具有與上面實施例1中描述的相同組成的新鮮製備水性rFVIIa製劑並同樣調至pH5.0的部分儲存在分別由未處理的I型玻璃(硼矽酸玻璃)，Ph.Eur.，以及經清洗的矽氧烷和熱處理的I型玻璃(硼矽酸玻璃)，Ph.Eur.，製成的盒子(容器)中30℃共12周。分別在0時間點和2、4和12周後(如上面實施例1中描述地)測定二聚體+寡聚體的百分含量。結果總結在下面表2中。
結果表明，就二聚體/寡聚體形成的最小化而言，矽氧烷和熱處理的盒子顯著地表現地比未處理的盒子好。
表2.
A未處理的I型玻璃(硼矽酸玻璃)，Ph.Eur.，製成的並裝有直徑7.2mm的滷素-橡膠柱塞(plunger)(西部藥物服務，目錄號4002，已經用Dow Corning Medical Fluid 360矽氧烷處理並消毒的)和波片狀(laminate)針頭可穿透的蓋子的1.5ml筆填(penfill)盒子。
B如A中的盒子，但是用水清洗，用Wacker E2矽氧烷油乳劑(大約35％矽氧烷油)製備的1％矽氧烷油乳劑處理，然後在最高330℃加熱最多5小時；柱塞和蓋子如A。
*未獲得可靠的數據。
實施例3在加入的鋁離子(Al3+)存在下rFVIIa二聚體/寡聚體的形成將鋁離子(如AlCl3.6H2O 100μM去離子水水性溶液)加入到具有與上面實施例1中描述的相同組成的新鮮製備水性rFVIIa製劑的部分，裝在CZTM樹脂製成的小瓶中並具有通過加入小分裝的0.1M或1MHCl或NaOH溶液調節的從4.0至6.0不同的pH值。小瓶儲存在30℃。
分別在0時間點以及1和2周後，(如上面實施例1中描述地)測定FVII二聚體+寡聚體聚集物的百分數含量。結果總結在下面表3中，從結果看很明顯地rFVIIa二聚體+寡聚體的百分數含量隨著時間隨著在受試的所有4個pH值加入的終濃度的增加而增加。
表3.
發明詳述如上面已經指出地，本發明的第一方面涉及選自下面的材料作為容器內壁材料的使用氧化矽塗層玻璃、矽氧烷塗層玻璃、非環形烯烴聚合物、環烯聚合物和環烯/線性烯烴共聚物；所述容器包含(1)壁部分和(2)不構成壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有9-12個Gla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
與本發明這後一方面密切相關地，本發明的另一方面提供了具有選自上面剛剛提到的那些的材料作為容器內壁材料的至少部分填充的容器，所述容器包含(1)壁部分和(2)不構成壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有9-12個Gla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
如上面指出地，本發明上下文中優選的容器內壁材料包括應用了氧化矽(二氧化矽，SiO2)塗層的各種等級/類型的玻璃；非常合適的一個這樣的材料是所謂的氧化矽塗層「I型」玻璃(如歐洲藥典，Ph.Eur.中定義的)。對於I型玻璃和其它類型藥物可接受的玻璃(II、III和IV型)的定義和特徵分析試驗，見，例如歐洲藥典(第四版)的3.2.1部分。
歐洲藥典(第4版，在線)3.2.1部分描述了I型玻璃容器，如下「它們是中性玻璃並由於玻璃本身的化學組成而具有高水解抗性。」，中性玻璃此處定義如下「中性玻璃是含有顯著量的氧化硼、鋁或鹼土金屬氧化物的硼矽酸玻璃。由於它的組成，中性玻璃具有很高的熱衝擊抗性和非常高的水解抗性。」
這個類型的容器內壁上的氧化矽塗層優選地具有至少大約0.05μm基本上一致的厚度，雖然相信範圍從大約0.1μm至大約0.2μm基本上一致的厚度一般是更加期望的。化學氣相沉積(CVD)似乎是對玻璃表面採用這樣基本上一致厚度氧化矽塗層非常適合的一種技術，其中氧化矽塗層通過CVD技術沉積到容器內部表面，並且在本發明的上下文中非常適合使用的I型玻璃容器(例如小瓶)是市售的，例如Schott Glaskontor，M llheim/Baden，德國的Schott I型plusTM容器。
對於CVD技術的描述，參考例如網際網路上下面的文章http//www.azom.com/details.asp？AfticleID＝1552。
也如上面指出地，本發明上下文中容器內壁進一步優選的材料包括各種等級/類型的玻璃，所述玻璃通常在水或另外的水性介質中最初清洗或浸泡以去除水可濾去的物質或種類之後已經被塗上矽氧烷。如上述，在這點上優選類型的玻璃是I型玻璃(Ph.Eur.)。
術語「矽氧烷」此處廣義使用，指的不僅是矽氧烷本身，也是共聚物，所述矽氧烷通常是聚合二烷基化的、二芳基化或單烷基化+單芳基化的矽氧烷(siloxane)，所述共聚物(一般是嵌段和枝接共聚物)包含矽氧烷節段和其它聚合材料(例如聚苯乙烯、聚烯烴、聚醯胺或聚氨基甲酸酯)的共聚物。
塗層材料合適地是聚(二烷基矽氧烷)油或共聚物，在這點上合適類型的聚(二烷基矽氧烷)包括聚(二甲基矽氧烷)(PDMS)、聚(二丙基矽氧烷)和聚(二己基矽氧烷)。
當應用於所述組分時，油的粘度很重要，尤其是為了消除例如當討論的容器是包含可置換柱塞以用於將液體(蛋白質製劑)排出容器的盒子等等時可以發生的滑動-停滯(slip-stick)現象。越粘稠，滑動-停滯現象的危險越小，由此阻止柱塞流暢活動。本發明的一個實施方案中，塗層包含線性或分支的親水性聚(二烷基矽氧烷)油。當應用於所述組分時，油的粘度優選地在200,000釐斯(centistokes)之上，例如500,000釐斯之上。
在優選的實施方案中，矽氧烷塗層包含交聯或膠凝矽氧烷油，例如親水聚(二烷基矽氧烷)油，或交聯和非交聯油的混合物。通過使用交聯或膠凝的油，油的遷移能力顯著降低，塗層可當作固體材料。
交聯或固化的(cured)矽氧烷油一般通過採用帶有在後續步驟中用於交聯塗層的反應官能團的線性或分支的矽氧烷油獲得。有許多不同的可利用的交聯方法，例如，用UV光照射固化的，升高溫度下加熱固化的以及在水的存在下固化的。交聯的矽氧烷油也可以通過第一次應用線性或分支側鏈的矽氧烷油然後用高能量照射源例如電子源或X射線源照射所述油而獲得。可交聯的矽氧烷油合適地是醫學等級的，例如Dow Corning(MDX4-4159流體)供應的MDXTM；其他合適的類型包括Wacher E2矽氧烷油，供應為大約35％水性乳劑。
另一個實施方案中，矽氧烷塗層包含親水聚(二烷基矽氧烷)嵌段和枝接共聚物。共聚物可以是任何包含例如PDMS的聚(二烷基矽氧烷)聚合節段的嵌段和枝接共聚物。聚合節段，例如，與聚苯乙烯、聚烯烴、聚醯胺或聚氨基甲酸酯的聚合節段聯合以形成期望的共聚物。共聚物可以通過任何合適的已知方法製備，例如通過順序陰離子聚合，或多種枝接方法。
矽氧烷塗層的親水性通過任何適當的方法獲得，例如在所述塗層應用於玻璃表面後，通過例如等離子處理或電暈處理氧化處理塗層。
親水性也可通過用親水基團或側鏈節段來封尾(end-capping)共聚物而獲得。親水基團例如可以是帶負電荷的化學基團或磷酸膽鹼(PC)基團，側鏈節段例如可以是聚(環氧乙烷)(PEO)或聚(2-羥乙基異丁烯酸酯)(pHEMA)。
為了降低蛋白質吸附可以通過親水聚合節段或功能基團的偶聯來修飾等離子處理的表面。這些聚合節段或功能性基團可以是上面描述的那些的同類，可以進一步偶聯於等離子處理過程中產生的功能性基團。
矽氧烷塗層的厚度依賴於特定塗層，優選的從0.005到10μm，更加優選地從0.01到1μm。最佳的厚度依賴於容器的尺寸、形狀和類型，並且很容易地由本領域的技術人員測定。在例如有可替換的柱塞或活塞(piston)部分的盒子的情況下，如果塗層太薄，它可在使用中破裂，因而增加柱塞和壁部分之間的摩擦。當塗層的厚度達到一定的平臺值時，即使厚度繼續增加，摩擦力大約是恆定的。對於任何塗層組合物，塗層應當優選儘可能的薄以降低成本。這樣薄的塗層合適地具有從0.005到0.4μm的厚度，例如從0.015到0.25μm，更加優選的大約0.2μm。
依賴於矽氧烷塗層的遷移能力，塗層的親水基團將傾向於往塗層裡面運動，由於周圍空氣的疏水性使得表面是疏水的。在注滿了Gla結構域蛋白質的水性液體製劑的容器的情況下，為了最小化蛋白質水性液體製劑中的蛋白質吸附到內部容器表面的傾向，期望在儲存過程中塗層保持親水的一直到液體蛋白質製劑引入容器中。這個在塗層過程發生之後立即用蛋白質製劑注滿容器而最容易獲得。
如上面指出地，本發明上下文中進一步優選的容器內壁材料包括非環形(例如直或分支側鏈)的烯烴聚合物，即聚烯烴。這樣的材料中，有用的來源於單個單體的聚合物包括聚乙烯和聚丙烯，許多等級的聚合物在結構上是部分結晶的。非環形烯烴的共聚物[例如乙烯(ethene)和丙烯(propene)的共聚物]是本發明上下文中同樣有興趣的內壁材料。
也如上面指出的，本發明上下文中容器內壁進一步優選的材料包括環烯烴聚合物，它們的合適的類型包括由基本上100％的5-7元脂族環烴環組成的那些。由環烯烴聚合材料製成的合適的市售容器包括從CZTM樹脂生產的容器，得自Daikyo Seiko公司，東京，日本。這個類型其他相關的聚合材料包括ZeonorTM和ZeonexTM，都得自Nippon Zeon有限公司，東京，日本。
環烯烴/線性烯烴共聚物合適的類型包括帶有無定形結構的材料，例如TopasTM類高度透明的共聚物(得自Ticona GmbH，Frankfurtam Main，德國)，可以獲得各種等級的(例如TopasTM8007、TopasTM5013、TopasTM6013、TopasTM6015和TopasTM6017)。
本發明的另一方面涉及固相材料的用途，當在不超過40℃的溫度與水或具有pH從大約3至大約8的水溶液接觸溫育至少24個月時，所述固相材料釋放最多大約3μM三價金屬離子到溶液中；作為容器內壁材料包含(1)壁部分和(2)不構成壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有9-12個Gla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
與本發明這後一方面密切相關，本發明的另一方面提供了至少部分填充的容器，其具有固相材料作為容器內壁材料，當在不超過40℃的溫度與水或具有pH從大約3至大約8的水溶液接觸溫育至少24個月時，它釋放最多大約3μM三價金屬離子到溶液中；作為容器內壁材料包含(1)壁部分和(2)不構成壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有9-12個Gla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
儘管相信(如上面指出地)三價金屬離子的釋放水平/濃度可接受的上限是大約3μM(即釋放水平≤大約3μM)，釋放水平最多大約2.5μM(即≤大約2.5μM)，更加期望得最多大約1μM(即≤大約1μM)，例如最多大約0.5μM(即≤大約0.5μM)似乎是有利的。
對於本發明後兩個方面的上下文中的三價金屬離子，Al3+的釋放似乎是特別不期望的；Fe3+構成了三價金屬離子的進一步的實例，它釋放到溶液中是要避免的。
除了避免三價金屬離子釋放到溶液中，更相信避免特別是Zn2+的某些二價金屬離子釋放到溶液中是期望的。在這點，釋放的水平應當可能不超過大約3μM(即釋放的水平≤大約3μM)，更加優選的大約1μM(即釋放的水平≤大約1μM)，例如最多大約0.5μM(即≤大約0.5μM)。
在這點也提到了儘管塗層玻璃材料，特別是氧化矽塗層玻璃(特別是氧化矽塗層I層玻璃)和矽氧烷塗層玻璃(特別是矽氧烷塗層I型玻璃)，是本發明各個方面的上下文中優選的內壁材料，為了遵守關於三價或二價離子釋放到溶液中的標準，在一些實施方案中採用進行了清洗或提取處理以降低玻璃表面裡面/上可提取的三價和二價金屬離子存在水平的玻璃就足夠了，特別是I型(歐洲藥典)玻璃。這樣的處理包括浸泡在熱(優選的至少90℃)水(提取)或例如硫酸銨溶液的另一種水性介質中，或者用二氧化硫的處理。
如已經指出地，本發明上下文中特別相關的蛋白質是具有有9-12個Gla殘基的γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質。這樣的蛋白質包括所謂的「維生素K依賴性凝結酶原蛋白質」，它們的實例是凝血酶原、因子VII(FVII)、因子IX、因子X和蛋白質C。這樣蛋白質的Gla結構域似乎參與這樣的蛋白質與鈣離子的結合，相信鈣離子結合形式負責介導與磷脂膜的結合；對於這樣的Gla結構域蛋白質進一步的信息和結構細節，參考例如H.R，Roberts等人，「凝結因子的分子生物學和生物化學以及止血的途徑」，1409頁以及下列等等(et seq.)，112章，Williams血液學，第6版(編輯E.Beutler等人)，McGraw-Hill，2001年。
所討論的類型之Gla結構域蛋白質展現了最初42個殘基的胺基酸序列非常高程度的同源性，根據H.R.Roberts等人(在上述引文中的)，現在一般相信含有Gla凝結因子蛋白質結合於脂質表面是由Gla結構域最初十個胺基酸中疏水殘基的膜內插入介導的，在這點上鈣離子是必須的，因為Ca2+結合於Gla殘基誘導顯著的構象變化，暴露了蛋白質表面上「片」(patch)中疏水性胺基酸殘基；這個「片」允許蛋白質插入磷脂膜。
在根據本發明用途和至少部分填充容器的實施方案中，包括蛋白質製劑含有因子VII(FVII)或它們的激活形式(FVIIa)的那些。在重要的實施方案中，根據本發明採用的因子VII多肽是人因子VII，但是在其它的實施方案中，因子VII可以例如是牛、豬、犬、馬、鼠或鮭魚因子VII。討論的因子VII多肽得自血漿或重組產生。對於人治療中的使用，採用的FVII多肽優選地是重組生產的人FVII(rhFVII)(見例如，美國4,784,950)。
可以理解本發明的上下文中提到的Gla結構域蛋白質不僅包含具有野生型(天然)胺基酸序列(即具有如在人類或另一個動物種類中天然出現的Gla結構域蛋白質的胺基酸序列)，還包含例如這樣的蛋白質的序列變異體，其中相對於野生型序列，一個或多個胺基酸殘基被取代(置換)、缺失或插入，但所述變異體保留了有9至12個Gla殘基的Gla結構域。
本發明的上下文中，如涉及人所採用的術語「因子VII」、「因子VII多肽」和「因子VII相關多肽」包含野生型人因子VII(即具有美國專利號4,784,950中公開的胺基酸序列的多肽)，以及人因子VII的變異體，所述變異體以激活的形式展現了基本上與野生型因子VII相同或改善的生物活性。術語「因子VII」意在更廣泛地包含它們非切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及被酶解(proteolytically)加工以得到它們各自生物活性形式的那些，稱為因子VIIa。一般地，因子VII在殘基152和153之間切割以得到因子FVIIa。
本發明的上下文中目的因子VII相關多肽也包含包括了變異體的多肽，其中相對於野生型因子VIIa的活性因子VIIa的生物活性明顯被修飾或降低。這些多肽包括但不限於因子VII或因子VIIa，特異性胺基酸序列的改變引入其中以改善或破壞多肽的生物活性。FVII多肽的修飾形式在這個類別內，其中活性位點被抑制，例如產物有時指的是「ASIS」[激活位點抑制的(人)因子七]，其中人FVII通過與形式為D-Phe-Phe-Arg-氯甲基酮的絲氨酸蛋白酶抑制劑反應而被修飾(見，例如WO 02/087605)。
血液凝結中因子VII(作為因子VIIa)的生物活性來自它(i)結合於組織因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的酶解切割以產生激活的因子IX或X(分別是因子IXa或Xa)的能力。為了本發明的目的，通過使用如例如美國專利號5,997,864中描述的因子VII缺陷血漿和促凝血酶原激酶測量製備物促進血液凝結的能力，從而定量分析人因子VIIa的生物活性。這個試驗中，生物活性表示為相對於對照樣品的凝結時間的降低，並轉化為與含有1單位/ml因子VII活性的合併人血清標準品相比的「因子VII單位」。或者，可以通過(i)測量包含了埋於液體膜中的TF和因子X的系統中因子VIIa產生因子Xa的能力(Persson等人，生物化學雜誌27219919-19924，1997)；(ii)測量水性系統中因子X的水解；(iii)使用基於表面等離子共振的設備測量因子VIIa與TF物理的結合(Persson，歐洲生物化學學會聯盟通訊413359-363，1997)和(iv)測量合成底物的水解而定量分析因子VIIa的生物活性。
具有相對於野生型因子VIIa基本上相同或改善的生物活性的因子VII變異體包含了在如上面描述的一個或多個凝結試驗、酶解試驗或TF結合試驗中測試時展現了至少大約25％，優選地至少大約50％，更加優選地至少大約75％以及最優選地至少大約90％在相同細胞類型中產生的因子VIIa比活性的那些。具有相對於野生型因子VIIa基本上降低的生物活性的因子VII變異體包含了在如上面描述的一個或多個凝結試驗、酶解試驗或TF結合試驗中測試時展現了至少大約25％，優選地至少大約10％，更加優選地至少大約5％以及最有選地至少大約1％在相同細胞類型中產生的野生型因子VIIa比活性的那些。具有相對於野生型因子VII基本上改善的生物活性的因子VII變異體包括但不限於展現了TF非依賴性因子X酶解活性的因子VII變異體和結合於TF但不切割因子X的那些。
不管展現了與野生型因子VII基本相同或更好的生物活性或者展現了相對於野生型因子VII明顯修飾的或降低的生物活性，因子VII的變異體包括但不限於具有通過一個或多個胺基酸的插入、缺失或取代而不同於野生型因子VII序列的胺基酸序列的多肽。
具有與野生型因子VII基本相同生物活性的激活(FVIIa)形式的人因子VII(FVII)非限制性實例包括S52A-FVII、S60A-FVII(Lino等人，生物化學和生物物理學報352182-192，1998)；如美國專利號5,580,560中公開的展現了增加的酶解穩定性的FVII變異體；在殘基290和291之間或殘基315或316之間被酶解切割的因子VII(Mollerup等人，生物技術生物工程48501-505，1995)；因子VII的氧化形式(Kornfelt等人，生物化學和生物物理檔案36343-54，1999)；如PCT/DK02/00189中公開的FVII變異體；以及如WO 02/38162中公開的展現了增加的酶解穩定性的FVII變異體(Scripps研究所)；如WO99/20767(明尼蘇達州大學)中公開的具有修飾的Gla結構域並展現了增強的膜結合的FVII變異體；以及如WO 01/58935(MaxygenApS)中公開的FVII變異體。
具有相對於野生型FVIIa增加的生物活性的激活(FVIIa)形式的FVII變異體非限制性實例包括如WO 01/83725、WO 02/22776、WO02/077218、PCT/DK02/00635、丹麥專利申請PA 2002 01423、丹麥專利申請PA 2001 01627中公開的FVII變異體；WO 02/38162(Scripps研究所)；以及如JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic研究所)中公開的有增強活性的FVII變異體。
具有相對於野生型因子VIIa明顯降低或修飾的生物活性的激活(FVIIa)形式的因子FVII變異體非限制性實例包括R152E-FVII(Wildgoose等人，生物化學293413-3420，1990)、S344A-FVII(Kazama等人，生物化學雜誌27066-72，1995)、FFR-FVII(Holst等人，歐洲血管內皮血管外科15515-520，1998)和缺乏Gla結構域的因子VII(Nicolaisen等人，歐洲生物化學學會聯盟通訊317245-249，1993)。
相關人因子VII或因子VII相關的多肽的實例包括但不限於下面[這裡(i)序列位置數字前緊接著的一個字母的胺基酸殘基符號指的是野生型序列中那個位置存在的胺基酸殘基，序列位置數字後緊接著的一個字母的胺基酸殘基符號指的是取代胺基酸殘基；(ii)相同多肽中多個胺基酸取代(代替)由斜槓(「/」)指出，分開單個的替代；以及(iii)下面段落中「FVII」指的是野生型人因子VII]野生型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V1581/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V1S8T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/Vl58T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/Vl58D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/EZ96V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/Vl58D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M295Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M295Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V155D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314F/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/Vl58T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺乏Gla結構域的因子VIIa；以及P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；從233Thr至240Asn的胺基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII，以及從304Arg至329Cys的胺基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII。
一般，本發明上下文中人FVII相關序列變異體是其中與如美國專利號4,784,950中公開的野生型人因子VII的胺基酸序列相比至多達20個胺基酸殘基置換、缺失或插入的變異體，儘管優選地不多於15個並且更加優選地不多於10個(例如9、8、7、6、5、4、3、2或1個)胺基酸殘基置換、缺失或插入。
本發明上下文中採用的容器是任何類型，就內壁材料的性質而言它與本發明的要求一致，並且對於其中所含的Gla結構域蛋白質製劑給予需要它的研究對象或患者劑量而言，所述容器使用很方便。便利類型的容器(尤其當討論的蛋白質通過液體注射給予時)將包括具有閉合部分或閉合單元工具(means)的小瓶或管形瓶、盒子等等，所述閉合部分或閉合單元包含了注射器針頭可穿透的自密封的橡膠隔膜或膜。盒子型容器額外合適地包含可替換的活塞單元(例如柱塞等等，一般由橡膠材料製成)，籍此存在的液體依靠所述活塞單元從容器中排出或吸入容器中。盒子型容器尤其合適地與「筆」型注射裝置聯合使用；合適類型的筆裝置的實例包括FlexPenTM、NovoLetTM和NovoPenTM型的筆(都來自Novo Nordisk A/S，丹麥)。
其它可應用類型的容器包括可變形的囊袋、小包、瓶包(bottlepack)、瓶子等等，它們包含可變形的內壁材料(如本發明上下文中提到的)，例如聚丙烯或聚乙烯，由此存在的液體通過對上述容器施壓而從它們排出。這樣可變形的容器合適地與「luer」接頭、螺紋接頭或其它用於附著注射器針頭的已知類型的接頭一起提供，針頭附著接頭例如合適地包含可破裂的膜或隔膜，例如彈性膜或隔膜，它在使用前起封閉物的作用以維持容器和其液體內含物的完整性，但是它在使用中，例如由於施加於容器上的中等強度壓力或由於適當設計[例如裝有圓錐帽、螺紋帽等等的注射器針頭，注射針頭本身向其內部(即朝向容器)和外部(即遠離容器)延伸，例如聯合於筆型注射裝置的經常採用的注射器針頭類型，所述筆型注射裝置被設計成容納具有針頭可穿透的隔膜或膜的盒子型容器]的注射器針頭內部延伸部分穿過膜而破裂。
能夠與容器中含有的水性液體蛋白質製劑長久接觸的容器閉合部分的那些部分(塞子、彈性隔膜、柱塞(plunger)、針頭附著接頭等等)應當優選地也遵守上面本發明上下文中容器內壁部分列出的一個或多個標準。某些類型的材料(例如矽氧烷橡膠/彈性體等等)通常符合這些要求而不需要任何進一步的處理，而某些其它材料(例如某些類型的橡膠，例如溴丁基橡膠，一般用於注射膜、隔膜、塞子、柱塞等等)要求合適的表面處理，合適地依靠上面總結的矽氧烷表面處理。本領域一般技術人員將能夠在廠商的數據和/或簡單的測試的基礎上評估為了滿足此處列出的標準什麼程度的表面處理是期望的，尤其是就暴露的、未處理的閉合材料本身能夠釋放非期望的金屬離子到溶液中的程度而言。
如上面某些程度上已經指出地，本發明上下文中容器中含有的蛋白質製劑非常合適的是液體水性製劑。對於討論的類型蛋白質(Gla結構域蛋白質)，這樣的水性製劑的pH將一般在大約3至大約8的範圍之內，儘管通常在大約4至大約7的範圍內。在FVII或FVIIa特別是人FVII或FVIIa[在本發明上下文中水性製劑的重要實施方案中它是重組產生的人FVII(rhFVII)或FVIIa(或rhFVIIa)]的情況下，pH在大約5至大約7的範圍內似乎是最有利的，例如大約5.5至大約6.5的範圍內，或大約6.0至大約6.5的範圍內。
除了如上面討論的液體水性製劑外，基本上固相形式的蛋白質製劑，例如含有目的蛋白質並且意在使用前溶於/重構於水或水性介質(載體、溶劑)的冷凍乾燥固體，在本發明上下文中仍然是重要的實施方案。因而，例如，NovoSevenTM(rhFVIIa；Novo Nordisk A/S)-如上面以前已經提到地-目前在配備了彈性隔膜的小瓶內並且含有rhFVIIa、NaCl、CaCl22H2O、甘氨醯甘氨酸、聚山梨醇酯TM80和甘露醇的冷凍乾燥(凍幹)製備物的形式提供，意在使用前(即給予患者之前)使用注射用滅菌水(WFI)重構。在後面這點，作為在FVIIa的使用過程中造成得到的重構水性FVIIa溶液中FVIIa活性的保留最大化的原因，從上面的討論很清楚地(在必需體積的水或賦形劑注射到含有冷凍乾燥製備物的小瓶之後)溶有冷凍乾燥蛋白質製備物(製劑)的體積水(或其它水性溶劑)的容器內壁材料應當優選地也是符合本發明的上下文中此處(上面)列出的一個或多個標準的材料。
本發明其它方面因而涉及(1)上面已經公開的一種類型的材料(固相材料)作為容器內壁材料的用途，所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成壁部分的一部分的閉合部分(例如包含彈性隔膜)，並含有水(例如滅菌注射水)或另一種水性載體；以及，類似地
(2)具有上面已經公開的一種類型的材料作為容器內壁材料的的至少部分填充的容器，所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成壁部分的一部分的閉合部分(例如包含彈性隔膜)，並含有水(例如滅菌注射水)或另一種水性載體。
本發明另一方面涉及包含(a)上面描述的一種類型的部分填充的容器，所述容器含有此處公開的具有帶有9-12個Gla殘基的氨基末端γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域[例如rhFVII、rhFVIIa或「ASIS」(見上)]的蛋白質類型的固相製劑，討論的固相製劑意在使用前溶於水或水性溶劑，以及(b)描述的一種類型的部分填充的容器，所述容器含有適於討論的固相製劑使用前的溶解/重構的水(例如滅菌注射水)或另一水性溶劑。
關於此處公開的本發明的所有方面，為了最大化使用一種指定類型的材料作為本發明上下文中容器的內壁材料而獲得的蛋白質穩定性，討論的材料應當基本上覆蓋容器壁部分所有(即基本上100％)內部表面區域[不算容器封閉部分的內部表面區域]明顯是期望的。然而依賴於與蛋白質製劑或與容器中含有的重構液體(水或水性載體)接觸的其它材料的性質，容器內壁覆蓋較低的程度-例如80％或更少的內表面區域-也是可以接受的。
藥物製劑和Gla結構域蛋白質的給予一般，根據本發明部分填充的容器內含有的Gla結構域蛋白質製劑的水性液體製劑(水性藥物製劑)-不管水性製劑是否一開始就以水性液體形式存在或通過加入水或另一水性載體或賦形劑由基本上固體的製劑(例如冷凍製備物)的溶解/重構產生-一般將合適地由非胃腸道給予，即靜脈、皮下或肌肉內或通過連續的或脈動的(pulsatile)注入。
在更加具體的水平，提到因子VII多肽和人研究對象時，非胃腸道給藥的組合物通常包含聯合於藥物可接受的水性載體的因子VII多肽，優選地溶於所述水性載體。可使用各種水性載體，例如水、緩衝水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等等。本發明上下文中因子VII多肽也可製成脂質體製品以遞送到或靶向損傷位點。脂質體製品一般在例如美國4,837,028、美國4,501,728和美國4,975,282中有描述。可以通過傳統的眾所周知的消毒技術消毒組合物。為了就這樣使用對得到的水性溶液進行包裝，或它們可以在無菌條件下過濾並冷凍乾燥，冷凍乾燥的製備物在給藥前與滅菌水或滅菌水性溶液(載體、賦形劑)聯合。組合物如需符合近似生理條件和/或增強組合物的化學和/或物理穩定性的要求可含有藥物可接受的輔助物質。這些包括pH調節和/或緩衝劑，例如枸櫞酸鹽(鈉或鉀)、乙酸鹽(銨、鈉或鈣)、組氨酸(L-組氨酸)、蘋果酸鹽、磷酸鹽(鈉或鉀)、酒石酸、琥珀酸、MES(2-N-嗎啉代乙磺酸)、HEPES(4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-乙基-磺酸)、咪唑、TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、乳酸鹽和穀氨酸鹽。選擇緩衝濃度範圍以維持溶液優選的pH。緩衝劑也可以是兩個或兩個以上緩衝劑的混合物，例如兩個這樣試劑的混合物，使得混合物能夠提供指定範圍內的pH值。在一個實施方案中，緩衝劑是枸櫞酸鹽和乙酸鹽(銨、鈉或鈣)、組氨酸(L-組氨酸)、蘋果酸鹽、磷酸鹽(鈉或鉀)、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸鹽和穀氨酸鹽至少一個緩衝劑的混合物。緩衝劑的總濃度一般在從大約1mM至大約100mM的範圍內，例如從大約1mM至大約50mM，通常從大約1mM至大約25mM，例如從大約2mM至大約20mM；鈣鹽組合物-不管是液體、冷凍乾燥或重構形式-可選地含有鈣鹽。鈣鹽可以低濃度存在，例如從大約0.1mM至大約5mM；它可以中濃度存在，例如從大約5mM至大約15mM；或者它可以高濃度存在，例如從大約15mM至大約1000mM。一方面，鈣鹽選自氯化鈣、乙酸鈣、葡萄糖酸鈣和果糖酸鈣(calcium laevulate)及其中兩個或兩個以上的混合物。或者，組合物中鈣離子濃度可以低於0.1mM，鈣離子濃度可以有效地降低，例如通過離子交換、透析過濾或其它相似的方法。
另一方面，非複合鈣離子(Ca2+)和因子VII多肽的摩爾比例低於0.5，例如在0.001-0.499的範圍內，例如0.005-0.050，或0.000-0.499的範圍內，例如0.000-0.050的範圍內，或者大約0.000。為了得到鈣離子(Ca2+)和因子VII多肽這樣低的摩爾比例，為了結合(複合)過剩的鈣離子加入鈣離子螯合劑是必須的或期望的。當源自製劑步驟之前加工步驟的溶液中鈣離子和因子VII多肽的比例超過了上面陳述的限度時這個特別相關。「鈣螯合劑」的實例包括而不限於乙二銨四乙酸(EDTA)及其鹽；二或三羧酸鹽，例如枸櫞酸、酒石酸、穀氨酸、蘋果酸、馬來酸或琥珀酸的鹽；氨基三乙酸(NTA)和DTPA；乳酸及其鹽；以及HIMDA、ADA和相似的化合物。
此處可以注意除了具有螯合特性外，許多後面提到的物質是本發明上下文中合適的緩衝劑(見上)。在這點，也進一步提到了某些組合物中比結合於(特別是)鈣離子更加強地結合於某些去穩定金屬離子(例如鋁離子)的緩衝/螯合劑的整合在一些情形下是有利的；滲透強度(tonicity)調節劑(造成製劑滲透壓的滲透強度調節物質)，例如胺基酸、小肽(具有例如從2至5個胺基酸殘基)、中性鹽、單或二糖、多糖、糖醇或至少兩個這樣的物質的混合物。具體實例包括但不限於氯化鈉、氯化鉀、枸櫞酸鈉、蔗糖、葡萄糖和甘露醇。滲透強度調節劑的濃度調節為接近等滲度，取決於製劑中存在的其它成分。一般，依賴於存在的其它成分滲透強度調節劑以從大約1至大約500mM的濃度摻入，例如從大約1至大約300mM，通常從大約10至大約200mM，例如從大約20至大約150mM。可以使用中性鹽，例如氯化鈉或氯化鉀。術語「中性鹽」指的是基本上不是酸性也不是鹼性的鹽，即當溶解時對製劑pH影響很小或沒有影響；表面活性劑，一般合適地是聚山梨醇酯或TweenTM類型(例如聚山梨醇酯TM20或80、或TweenTM80)，或泊洛沙姆(poloxamer)或PluronicTM類型(例如泊洛沙姆TM188或407)的非離子表面活性劑。混合的表面活性劑的量一般範圍從大約0.005至大約1％重量/重量(w/w)，從大約0.005至大約1％w/w，例如從大約0.005至0.02％w/w的量一般是優選的。在一些情形下，例如至多大約0.5％w/w的相對高的濃度是期望的以維持蛋白質穩定性。然而，用於實際操作中的表面活性劑的水平習慣上受臨床實踐限制；抗氧化劑，例如壞血酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、穀胱甘肽或含有半胱氨酸或甲硫氨酸的肽；甲硫氨酸，特別是L-甲硫氨酸，一般是非常合適的抗氧化劑。抗氧化劑一般以從大約0.1至大約2mg/ml的濃度混合；防腐劑(包括在製劑中以阻礙微生物生長，因而允許例如FVII多肽的「多重使用」包裝)，例如酚、苯甲醇、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)、苯扎氯銨或苯索氯銨。防腐劑一般以從大約0.1至大約2mg/ml的濃度混合；製劑中因子VII多肽的濃度能大大地不同，一般從大約0.01％w/w至大約2％w/w(即從大約0.1mg/ml至大約20mg/ml)，例如從大約0.05％w/w至大約1.5％w/w(即從大約0.5mg/ml至大約15mg/ml)，例如從大約0.05％w/w至大約1％w/w(即從大約0.5mg/ml至大約10mg/ml)，並將依據所選給藥的特定模式主要在液體體積、粘度等等的基礎上選擇。在因子VIIa的情況下，濃度經常表示為mg/ml或國際單位/ml(IU/ml)。1mg FVIIa通常相應於43000-56000IU或更多。
製備可非胃腸道給予的組合物的方法對本領域的技術人員將是已知的或明顯的，並在例如Remington氏藥物科學，第18版，Mack出版公司，Easton，PA(1990)中有更詳細的描述。
對於與故意幹預(例如手術程序)有關的治療，因子VII多肽一般將在進行幹預前大約24小時內給予，共7天或之後更長時間。作為凝血劑的給予能通過如此處描述的各種途徑。對於70kg的研究對象，作為負荷和維持劑量因子FVII多肽(例如rhFVIIa)的劑量依賴於研究對象的重量和病變的嚴重程度將通常在從大約0.05mg/天至500mg/天的範圍，優選地從大約1mg/天至大約200mg/天，更加優選地從大約10mg/天至大約175mg/天。
可以為了預防和/或治療而給予含有因子FVII多肽的組合物。在治療應用中，如上面描述地以足夠治癒、減輕或部分抑制病變及其併發症的量將組合物給予已經遭受病變的研究對象。足夠完成這個的量定義為「治療有效量」。如本領域技術人員理解地，對於這個目的有效的量將依賴於病變或損傷的嚴重程度以及研究對象的體重和一般身體狀態。
應當記住FVII多肽(例如rhFVIIa)的藥物組合物一般應用於威脅生命的或潛在地威脅生命的醫學病變或狀態，在這樣的情況下-鑑於與外源性物質最小量相關的一般優點並考慮人因子VII多肽的免疫源性的全面缺乏-治療醫師給予基本過量的討論的因子VII多肽是可能的並覺得是期望的。
在預防的應用中，為了增強研究對象自身的凝血能力，將含有因子VII多肽的組合物給予對疾病狀態或損傷敏感的或另外有疾病狀體或損傷危險的研究對象。為了這樣的目的採用的劑量(可以稱為「預防有效劑量」)將再次依賴於研究對象的體重和健康的一般狀態，但對於70公斤的研究對象將再次一般在從大約0.05mg/天至大約500mg/天的範圍內，更加普通地從大約1.0mg/天至大約200mg/天。
在特別是rhFVIIa給予人研究對象的情況下，劑量水平一般在每個劑量大約90-120μg/kg體重的範圍。然而，目前對稍微更高劑量優先選擇，例如超過150μg/kg體重的劑量，在一些情況下大約250-300μg/kg的劑量。
使用治療醫師選擇的劑量水平和劑量方案進行討論的製劑的一次或多次給予。對於需要每天維持水平的門診病人，通過例如使用攜帶泵系統的連續注入而給予因子FVII多肽。
通過噴霧、通過灌注、通過雙球插管或支架的使用、通過引入血管嫁接或支架、以水凝膠塗抹球插管的形式或通過其它已經很好建立的方法進行因子VII多肽的局部給予，例如局部應用。在任何事件中，討論的藥物組合物應當提供有效治療研究對象的足夠的因子VII多肽的量。
權利要求
1.選自如下的材料作為容器內壁材料的用途氧化矽塗層玻璃、矽氧烷塗層玻璃、非環形烯烴聚合物、環烯烴聚合物和環烯烴/線性烯烴共聚物；所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成所述壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有帶9-12個Gla殘基的氨基末端γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
2.固相材料作為容器內壁材料的用途，當在不超過40℃的溫度下與水或具有pH從大約3至大約8的水性溶液接觸溫育至少24個月時，所述材料釋放最多大約3μM三價金屬離子進入溶液；所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成所述壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有帶9-12個Gla殘基的氨基末端γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
3.根據權利要求2的用途，其中所述三價金屬離子是Al3+。
4.根據權利要求2或3的用途，其中當在不超過40℃的溫度下與水或具有pH從大約3至大約8的水性溶液接觸溫育至少24個月時，所述固相材料釋放最多大約3μM二價金屬離子進入溶液。
5.根據權利要求4的用途，其中所述二價金屬離子是Zn2+。
6.根據權利要求1-5中任何一個的用途，其中所述蛋白質是維生素K依賴性凝結酶原蛋白質或其激活形式。
7.根據權利要求6的用途，其中所述維生素K依賴性凝結酶原蛋白質選自凝血酶原、因子VII(FVII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)和蛋白質C。
8.根據權利要求1-7中任何一個的用途，其中所述製劑含有因子VII(FVII)或激活的因子VII(FVIIa)。
9.根據權利要求7或8的用途，其中所述FVII是重組人FVII(rhFVII)。
10.根據權利要求1-5中任何一個的用途，其中所述蛋白質是FVII相關多肽或其激活形式。
11.根據權利要求1-10中任何一個的用途，其中所述容器是包含閉合單元的小瓶或盒子，所述閉合單元包含針頭可穿透的自密封彈性隔膜。
12.根據權利要求11的用途，其中所述容器是進一步包含可替換的活塞單元的盒子，籍此所述容器中存在的液體可從所述容器中排出。
13.根據權利要求1-12中任何一個的用途，其中所述容器內壁材料是塗抹了二氧化矽(SiO2)的I型玻璃(歐洲藥典)。
14.根據權利要求13的用途，其中所述氧化矽塗層玻璃具有厚度在大約0.1μM至大約0.2μm的範圍內的基本上純的SiO2的表面層。
15.根據權利要求13或14的用途，其中所述SiO2層是用化學蒸汽沉積(CVD)所沉積的層。
16.根據權利要求1-12中任何一個的用途，其中所述容器內壁材料是由基本上100％的5-7元脂族環烴環組成的環烯烴聚合物。
17.根據權利要求1-16中任何一個的用途，其中所述製劑是液體水性製劑。
18.根據權利要求17的用途，其中所述水性製劑具有範圍大約3至大約8的pH值。
19.根據權利要求17或18的用途，其中所述液體水性製劑含有rhFVIIa並具有範圍從大約5.5至大約6.5的pH值。
20.根據權利要求1-16中任何一個的用途，其中所述製劑是用於在使用前溶於水或水性載體中的基本上的固體製劑。
21.根據權利要求1-20中任何一個的用途，其中所述內壁材料覆蓋了基本上100％的所述壁部分的內表面區域。
22.具有選自如下的材料作為容器內壁材料的至少部分填充的容器氧化矽塗層玻璃、矽氧烷塗層玻璃、非環形烯烴聚合物、環烯烴聚合物和環烯烴/線性烯烴共聚物；所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成所述壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有帶9-12個Gla殘基的氨基末端γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
23.具有固相材料作為容器內壁材料的至少部分填充的容器，當在不超過40℃的溫度下與水或具有pH從大約3至大約8的水性溶液接觸溫育至少24個月時，所述固相材料釋放最多大約3μM三價金屬離子進入溶液；所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成所述壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並且含有具有帶9-12個Gla殘基的氨基末端γ-羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質之製劑。
24.根據權利要求23的至少部分填充的容器，其中所述三價金屬離子是Al3+。
25.根據權利要求23或24的至少部分填充的容器，其中所述固相材料在不超過40℃的溫度下與水或具有pH從大約3至大約8的水性溶液接觸溫育至少24個月時，釋放最多大約3μM二價金屬離子進入溶液。
26.根據權利要求25的至少部分填充的容器，其中所述二價金屬離子是Zn2+。
27.根據權利要求22-26中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述蛋白質是維生素K依賴性凝結酶原蛋白質或其激活形式。
28.根據權利要求27的至少部分填充的容器，其中所述維生素K依賴性凝結酶原蛋白質選自凝血酶原、因子VII(FVII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)和蛋白質C。
29.根據權利要求22-28中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述製劑含有因子VII(FVII)或激活的因子VII(FVIIa)。
30.根據權利要求28或29的至少部分填充的容器，其中所述FVII是重組人FVII(rhFVII)。
31.根據權利要求22-26中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述蛋白質是FVII相關多肽或其激活形式。
32.根據權利要求22-31中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述容器是包含了閉合單元的小瓶或盒子，所述閉合單元包含針頭可穿透的自密封彈性隔膜。
33.根據權利要求32的至少部分填充的容器，其中所述容器是進一步包含可替換的活塞單元的盒子，籍此所述容器中存在的液體可從所述容器中排出。
34.根據權利要求22-33中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述容器內壁材料是塗抹了二氧化矽(SiO2)的I型玻璃(歐洲藥典)。
35.根據權利要求34的至少部分填充的容器，其中所述氧化矽塗層玻璃具有厚度在大約0.1μm至大約0.2μm的範圍內的基本上純的SiO2的表面層。
36.根據權利要求34或35的至少部分填充的容器，其中所述SiO2層是用化學蒸汽沉積(CVD)沉積的層。
37.根據權利要求22-33中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述容器內壁材料是由基本上100％的5-7元脂族環烴環組成的環烯烴聚合物。
38.根據權利要求22-37中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述製劑是液體水性製劑。
39.根據權利要求38的至少部分填充的容器，其中所述水性製劑具有範圍大約3至大約8的pH值。
40.根據權利要求38或39的用途，其中所述液體水性製劑含有rhFVIIa並具有範圍從大約5.5至大約6.5的pH值。
41.根據權利要求22-37中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述製劑是用於在使用前溶於水或水性溶劑中的基本上固體製劑。
42.根據權利要求22-41中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述內壁材料覆蓋了基本上100％的所述壁部分的內表面區域。
43.具有選自如下的材料作為容器內壁材料的至少部分填充的容器氧化矽塗層玻璃、矽氧烷塗層玻璃、非環形烯烴聚合物、環烯烴聚合物和環烯烴/線性烯烴共聚物；所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成所述壁部分的一部分的一個或多個閉合部分，並含有水或另一種水性載體。
44.具有固相材料作為容器內壁材料的至少部分填充的容器，當在不超過40℃的溫度下與水或具有pH從大約3至大約8的水性溶液接觸溫育至少24個月時，所述固相材料釋放最多大約3μM三價金屬離子進入溶液；所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成所述壁部分的一部分的一個或多個封閉部分，並含有水或另一種水性載體。
45.根據權利要求44的至少部分填充的容器，其中所述三價金屬離子是Al3+。
46.根據權利要求44或45的至少部分填充的容器，其中在不超過40℃的溫度下與水或具有pH從大約3至大約8的水性溶液接觸溫育至少24個月時，所述固相材料釋放最多大約3μM二價金屬離子進入溶液。
47.根據權利要求46的至少部分填充的容器，其中所述二價金屬離子是Zn2+。
48.根據權利要求43-47中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述容器是包含了閉合單元的小瓶或盒子，所述閉合單元包含針頭可穿透的自密封彈性隔膜。
49.根據權利要求48的至少部分填充的容器，其中所述容器是小瓶。
50.根據權利要求43-49中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述容器內壁材料是塗抹了二氧化矽(SiO2)的I型玻璃(歐洲藥典)。
51.根據權利要求50的至少部分填充的容器，其中所述氧化矽塗層玻璃具有厚度在大約0.1μm至大約0.2μm的範圍內的基本上純的SiO2表面層。
52.根據權利要求50或51的至少部分填充的容器，其中所述SiO2層是用化學蒸汽沉積(CVD)沉積的層。
53.根據權利要求43-49中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述容器內壁材料是由基本上100％的5-7元脂族環烴環組成的環烯烴聚合物。
54.根據權利要求43-53中任何一個的至少部分填充的容器，其中所述內壁材料覆蓋了基本上100％的所述壁部分的內表面區域。
55.包含根據權利要求41的至少部分填充的容器以及根據權利要求43-53中任何一個的至少部分填充的容器的醫學試劑盒。
全文摘要
選自氧化矽塗層玻璃、矽氧烷塗層玻璃、非環形烯烴聚合物、環烯烴聚合物和環烯烴/線性烯烴共聚物的材料作為容器內壁材料是有利的，所述容器包含(i)壁部分和(ii)不構成壁部分的一部分的一個或多個封閉部分，並且含有具有帶9－12個Gla殘基的氨基末端γ－羧基穀氨酸(Gla)結構域的蛋白質製劑。
文檔編號B65D1/02GK1780638SQ200480011224
公開日2006年5月31日 申請日期2004年5月21日 優先權日2003年5月23日
發明者M·B·詹森, B·L·漢森, T·科恩費爾特, K·K·雅克布森 申請人:諾和諾德醫療保健公司