抗呼吸道病毒轉移因子生產工藝的製作方法
2023-07-13 00:10:21
專利名稱：抗呼吸道病毒轉移因子生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於預防和治療常見呼吸道病毒感染的藥物生產工藝，特別涉及一種由呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、流感病毒及皰疹病毒提取的特異性抗原免疫哺乳動物而製備的抗呼吸道病毒轉移因子生產方法。
感冒是由病毒引起的上呼吸道感染，是人類最常見的疾病，且常由於該疾病引起多種嚴重的併發症，被認為是「百病之首」。全世界用於預防和治療感冒的費用驚人，以英國為例，雖僅有5千多萬人口，但每年用於預防及治療感冒及併發症的費用超過數百億美元。國內外現有的抗感冒藥物主要是減輕感冒症狀，預防併發症發生，並不能從病因學角度治癒上呼吸道感染。
本發明的目的在於克服上述現有技術的缺點，提出一種抗呼吸道病毒轉移因子藥物生產工藝，具有既可預防，又可治療，標本兼治的特點。
根據轉移因子分子量小，無免疫原性，且在哺乳動物間無種屬特異性的免疫學原理，本發明採用呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、流感病毒及皰疹病毒等常見的呼吸道病毒提取的特異性抗原，免疫哺乳動物，取其脾臟、淋巴結組織，用分子篩過濾及透析方法提取有效成份，研製出抗多種病毒特異性轉移因子。因為人體抗病毒主要是通過細胞免疫和體液免疫的特異性細胞及抗體識別，引起特異性的免疫反應，從而殺滅及清除體內病毒，轉移因子可以把通過特異性抗原免疫的具有針對病毒特異性的免疫信息傳遞給人體免疫細胞，從而引起人體特異和快速的免疫反應，殺滅及清除病毒。另外，呼吸道病毒侵害人體必須首先在上呼吸道找到合適的病毒受體，造成上皮細胞感染，然後侵入人體。本發明的抗呼吸道病毒轉移因子通過增強上呼吸道的免疫殺傷細胞特異性殺傷功能及調節黏膜免疫機制，起到預防及治療上述病毒感染的作用。
本發明的生產工藝如下首先，製備呼吸道病毒抗原將呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒及單純皰疹病毒，分別接種於已長成單層的Hep-2細胞或BHK細胞，37℃孵育，每天觀察細胞病變情況，當CPE出現+++或++++時，收集細胞及上清，放冰箱低溫冰凍保存。
流感病毒接種於10天齡雞胚尿囊液及羊膜腔，33℃ 48～72小時，收集尿囊液及羊水，以雞或豚鼠RBC測流感病毒HA。
其次，以不連續梯度密度離心純化病毒抗原呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒及單純皰疹病毒的感染細胞CPE+++或++++後，用少許培養液刮下細胞，裝厚壁小瓶子內，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清。裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖製備的不連續梯度密度離心管，超速離心，165000×g 3小時，根據不同病毒的分子量確定該病毒所在離心管位置，吸出備用。流感病毒接種後48～72小時，取雞胚尿囊液，超聲粉碎，取離心上清，不連續梯度密度離心提取病毒抗原，提取方法同上述其它病毒。
然後，用所提取的病毒抗原免疫動物挑選健康哺乳動物(羊體重30～50公斤，豬體重60～90公斤)，取上述製備的病毒抗原，免疫動物，共免疫5～6次。前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內或皮下多點注射免疫。第3次以後在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周。最後一次免疫7天後取動物靜脈血，以免疫螢光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價後，宰殺動物，取脾及淋巴結節組織，低溫冰箱冰凍保存備用。
最後，提取抗呼吸道病毒轉移因子病毒免疫的動物脾及淋巴結組織，去其表面的筋膜、脂肪等組織，滅菌生理鹽水反覆衝洗，剪碎，經組織勻漿機高速粉碎，反覆凍融4～6次，每次融化後均以組織勻漿機高速勻漿粉碎，然後以超濾或透析的方法提取。以透析方法提取時，透析液為0.9％生理鹽水，放4℃冰箱透析，放置24小時後收集透析液並以小於0.2μm的微孔濾膜過濾、除菌，放冰箱冰凍保存備用。
抗呼吸道病毒轉移因子的安全試驗①熱原試驗取健康成年兔子5隻，耳緣靜脈注射抗呼吸道病毒轉移因子2ml，分別於注射前、注射後30分鐘、1小時、2小時，肛門測體溫，平均升溫，不超過0.5℃。
②急性毒性實驗取健康小白鼠5隻尾靜脈注射抗呼吸道病毒轉移因子0.5ml,72小時內沒有死亡。
③過敏試驗取體重250～350g健康豚鼠5隻，連續3次隔日注射本品0.5ml,2周後，再自靜脈注射本品1ml，注射後15分鐘內，觀察動物沒明顯豎毛、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡等現象。
④無菌試驗將抗呼吸道病毒轉移因子，分別接種於需氧菌、厭氧菌及黴菌培養管內，30～35°培養5日內沒有細菌生長。
⑤活性測定採用活性淋巴細胞E-玫瑰花試驗，本品的淋巴細胞花結百分率比對照管高30％以上。
按本發明方法提取的抗呼吸道病毒轉移因子具有如下的理化性質1．本發明因含有少量次黃嘌呤，對光檢查外觀為無色或呈微黃色液體。
2．PH值為7.0～7.2。
3．紫外吸收光譜是本品的一個重要特性，因含有核苷酸，多肽類小分子物質成份，其中含有的嘌呤及嘧啶礆基都具有共軛的雙鍵結構，能強烈吸收250～255nm波長的紫外光，其最大吸收波長在252±2nm。
4．本發明因不含大分子蛋白成份，以紫外吸收光譜OD值260nm/280nm≥2.0作為製劑的純度指標。
5．多肽含量測定，按Lowry法進行(中國生物製品規格，1990年版第一部301頁)；多肽含量每ml≥500μg。
6．核糖含量測定(按中國生物製品規格1990年版第一部321頁)，核糖含量每ml≥50μg。
抗呼吸道病毒轉移因子對上呼吸道病毒感染不但具有預防作用，還具有治療功效。經藥理學、毒理學等實驗證明無毒、副作用，並經臨床驗證適用於急性上呼吸道病毒感染，反覆呼吸道感染、急性咽炎、喉咽、支氣管炎以及病毒性眼結膜炎，並可預防感冒。尤其對兒童、老年人及肌體抵抗力低下的患者，能起到增強免疫功能預防感冒的功效。
實施例1．抗呼吸道病毒轉移因子霧化滴鼻液按上述方法製備的抗呼吸道病毒轉移因子每ml加入8000單位慶大黴毒或其他可局部應用的廣譜抗生素。
呼吸道病毒感染首先是病毒感染呼吸道上皮細胞並在局部繁殖或其代謝產生擴散入血造成全身症狀，同時破壞局部黏膜功能，造成局部菌群失調及致病菌侵入，引起繼發感染。抗呼吸道轉移因子霧化滴鼻液所含的抗呼吸道病毒轉移因子可起到特異性增強人體T淋巴細胞識別及殺滅病毒能力，阻止病毒在人體進一步擴散，同時所含的抗生素成份可抑制或殺滅局部致病菌的繁殖，防止繼發感染，減輕或消除臨床症狀。用法滴鼻成人每次4～5滴，小兒每次2～3滴，每日4～5次。
滴眼每次1～2滴，每日3～4次。
霧化每次2ml，每日1～2次(可與化痰藥物及抗生素聯用)。貯藏及有效期貯於4℃冰箱或冰凍(勿反覆凍融)，有效期18個月。
2．抗呼吸道病毒轉移因子注射液上述方法製備的抗呼吸道病毒轉移因子經除菌過濾後，無菌分裝安瓿內，每支2ml，火燃封口。
抗呼吸道病毒轉移因子注射液可直接將較大劑量的活性抗病毒轉移因子注入肌體內，能快速高效調動人體免疫系統，增強抗病毒能力。用法肌肉注射，兒童每次1～2ml，成人每次2～4ml，每日或隔日注射一次。貯藏及有效日期4℃冰箱或冰凍保存(勿反覆凍融)有效期18個月。
權利要求
1．抗呼吸道病毒轉移因子生產工藝，其特徵在於，首先製備呼吸道病毒抗原，其次以不連續梯度密度離心純化病毒抗原，然後用所提取的病毒抗原免疫動物，最後從免疫動物中提取抗呼吸道病毒轉移因子。
2．根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於，將呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒及單純皰疹病毒，分別接種於已長成單層的Hep-2細胞或BHK細胞，37℃孵育，每天觀察細胞病變情況，當CPE出現+++或+++++後，用少許培養液刮下細胞，裝厚壁小瓶子內，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清，裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖製備的不連續梯度密度離心管，超速離心，165000×g 3小時，根據不同病毒的分子量確定該病毒所在離心管位置，吸出備用。
3．根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於，將流感病毒接種於10天齡雞胚尿囊液及羊膜腔，33℃下48～72小時，取雞胚尿囊液，超聲粉碎，取離心上清，然後不連續梯度密度離心提取病毒抗原。
4．根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於，挑選健康哺乳動物取製備的病毒抗原，免疫動物，共免疫5～6次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內或皮下多點注射免疫，第3次以後在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最後一次免疫7天後取動物靜脈血，以免疫螢光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價後，宰殺動物，取脾及淋巴結節組織。
5．根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於，將病毒免疫的動物脾及淋巴結組織，去其表面的筋膜、脂肪等組織，滅菌生理鹽水反覆衝洗，剪碎，經組織勻漿機高速粉碎，反覆凍融4～6次，每次融化後均以組織勻漿機高速勻漿粉碎，然後以超濾或透析的方法提取。
6．根據權利要求1、5所述的生產工藝，其特徵在於，以透析方法提取時，透析液為0.9％生理鹽水，放4℃冰箱透析，放置24小時後收集透析液並以小於0.2μm的微孔濾膜過濾、除菌即可。
全文摘要
一種抗呼吸道病毒轉移因子生產工藝,首先製備呼吸道病毒抗原,其次以不連續梯度密度離心純化病毒抗原,然後用所提取的病毒抗原免疫動物,最後從免疫動物中提取抗呼吸道病毒轉移因子,可以製備成注射液或滴鼻液藥物,具有既可預防,又可治療,標本兼治的特點。
文檔編號A61P31/00GK1234276SQ99115750
公開日1999年11月10日 申請日期1999年4月12日 優先權日1999年4月12日
發明者許東亮, 張國成 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院