檢測細胞參數變化和篩選小分子文庫所用的多參數facs分析的製作方法

2023-07-13 06:59:21 1

專利名稱：：檢測細胞參數變化和篩選小分子文庫所用的多參數facs分析的製作方法
技術領域：
：本發明涉及使用螢光-激活的細胞分選(FACS)儀檢測細胞參數變化，尤其是篩選能結合靶分子的小分子文庫，如有機分子的組合化學文庫，包括肽和其它化學文庫的新方法。可用多種方法篩選這些文庫，其中一個方法包括與玻珠結合併用染料顯示；例見Neslter等，生物有機藥物化學通訊，6(12):1327(1996)。另一種方法利用了玻珠和螢光激活的細胞分選(FACS)；例見Needles等，PNASUSA90:10700(1993)和Vetter等，生物綴合物化學，6:319(1995)。螢光激活的細胞分選(FACS)也稱作流式細胞計量術，被用於根據光學特性(例如螢光)來分選各個細胞。該方法一般較為快速，可在相對較短的時間內篩選大的細胞群體。在很多情況下，快速和經濟的篩選(如FACS篩選)特別有意義，其中一個應用領域是細胞周期分析。細胞周期由M期開始，經過多個生長階段，其間會發生有絲分裂和胞質分裂。M期之後是G1期，其中細胞恢復高速生物合成和生長。S期始於DNA合成，當核的DNA含量加倍時結束。然後細胞進入G2期，當有絲分裂開始時G2期結束，出現凝聚染色體即是G2期結束的信號。終末分化的細胞停滯於G1期，不再進行細胞分裂。惡性腫瘤細胞的標誌是毫無控制的增殖。該表型是通過積累基因突變而獲得的，其中的大多數突變促進通過細胞周期進行傳代。癌細胞不受生長調節信號的控制，一直進行著細胞分裂。典型的致癌基因，如ras導致細胞周期由G1期不恰當地轉變為S期，酷似增殖的細胞外信號。細胞周期的關卡控制確保基因組能正確地複製和分離。細胞周期關卡控制的缺乏導致基因組的不穩定性，大大加快了驅動惡性腫瘤轉化之突變的積累。因此，關卡調節劑，如p53和ATM(共濟失調-毛細管擴張症突變的)也能用作腫瘤抑制劑。因此，用治療劑調製細胞周期關卡途徑可以利用正常和腫瘤細胞之間的差異，既能改善放射性-和化學療法的選擇性，也能導致產生新的癌症療法。因此，本發明的目的是提供可用於篩選細胞周期關卡調節之調製劑的組合物和方法。特別適於使用快速篩選法的另一個領域是檢測胞吐作用的領域。胞吐是分泌小泡與細胞質膜的融合作用，它具有兩個主要的功能。一個是將小泡內容物卸至胞外間隙，另一個是使新蛋白質和脂質摻入質膜本身。胞吐可分為兩類組成型和調節型。所有真核細胞都表現出組成型胞吐，其標誌是在形成之後能持續融合分泌小泡。調節型的胞吐僅局限於某些細胞，包括外分泌，內分泌和神經元細胞。調節型胞吐導致與質膜融合的分泌小泡的積累，所述融合只在接收到適當信號後才會發生，所述信號通常為(但不總是)胞質中游離Ca2+濃度的增加。調節型胞吐對很多特化細胞起著關鍵性的作用，特定的細胞經常由相同的胞吐顆粒釋放出多種介體，這些介體共同作用以在靶細胞中產生相互協作的生理反應。這些調節型胞吐細胞包括神經元(釋放神經遞質)，腎上腺嗜鉻細胞(分泌腎上腺素)，胰腺腺泡細胞(分泌消化酶)，胰腺β-細胞(分泌胰島素)，肥大細胞(分泌組胺)，乳房細胞(分泌乳蛋白)，精細胞(分泌酶)，卵細胞(產生受精包膜)和脂肪細胞(將葡萄糖轉運蛋白插入質膜)。另外，目前的理論表明從酵母到哺乳動物的腦，小泡停靠和融合的基本機理是保守的。另外，與胞吐有關的疾病是已知的。例如，由肥大細胞釋放的炎症介體可導致多種疾病，包括哮喘。僅在美國，就有超過5000萬的人患有哮喘，鼻炎或一些其它形式的變態反應。變態反應的治療仍局限於阻斷由肥大細胞釋放的介體(抗-組胺)，而非特異性的抗炎症劑，如類固醇和肥大細胞穩定劑僅在抑制變態反應症狀學方面勉強有效。類似地，Chediak-Higashi症候群(CHS)是一種罕見的常染色體隱性疾病，其中嗜中性白細胞，單核細胞和淋巴細胞以及大多數細胞含有大的胞質顆粒。在小鼠，水貂，牛，貓和逆戟鯨中也描述了類似的疾病，其中，描述最詳盡的是CHS的鼠同系物(也稱為beige或bg)，例見Perou等，生物化學雜誌，272(47):29790(1997)和Barbosa等，自然，382:262(1996)(皆列入本文作為參考)。另外，人們普遍相信神經遞質胞吐和介體重新攝取之間的不平衡可引起很多種神經病。已設計了大量藥物，所述藥物主要通過阻斷胞吐介體的受體來特異性幹擾胞吐介體。然而，該方法受以下事實的限制即單個受體阻斷劑不能克服很多種不同介體的影響。因此，本發明的目的是提供篩選胞吐變化的方法，尤其是篩選能介導這種胞吐的藥劑的方法。本發明的另一個目的是提供檢測背景降低，特異性增加的上述篩選方法。發明簡述根據上述目的，本發明提供了篩選生物活性劑的方法，所述生物活性劑能改變或調製細胞表型的變化。所述方法一般包括將至少一種候選生物活性劑與細胞群體混合，通過在至少3個，4個或5個細胞參數的基礎上分離細胞以在FACS儀上分選細胞。候選藥劑可以是含有編碼候選生物活性劑之融合核酸的分子文庫的一部分。另一方面，本發明提供了在不同條件下或與不同生物活性劑聯合篩選細胞群體或單個細胞中的胞吐變化的方法。所述方法包括通過檢測至少3個特性的變化以在FACS儀上分選細胞，所述特性選自光散射，螢光染料攝取，螢光染料釋放，膜聯蛋白顆粒結合，表面顆粒酶活性和顆粒特異性蛋白質的量。本發明還提供了篩選能調製細胞胞吐的生物活性劑的方法。所述方法包括混合候選生物活性劑和細胞群體，使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件之下。通過檢測至少3個特性的變化以在FACS儀上分選細胞，所述特性選自光散射，螢光染料攝取，螢光染料釋放，膜聯蛋白顆粒結合，表面顆粒酶活性和顆粒特異性蛋白質的量。與未暴露於候選生物活性劑的細胞相比，至少一個所述特性的變化表明所述生物活性劑能調製胞吐。在篩選生物活性劑之方法的優選實施方案中，所選擇的特性包括選自下列的至少一種特性螢光染料釋放，膜聯蛋白顆粒結合，表面顆粒酶活性和顆粒特異性蛋白質的量。當檢測到螢光染料攝取時，優選染料是苯乙烯染料。當檢測到螢光染料釋放時，染料可以是低pH濃度的染料或苯乙烯染料。在優選實施方案中，通過原位酶學分析或通過基於群體的酶分析可檢測到表面顆粒酶活性。酶底物可以是任何可測的底物，優選酶底物與FRET構建體偶聯。FRET構建體包括兩個由蛋白酶位點分開的螢光蛋白。此時，蛋白酶位點特異於顆粒蛋白酶。在優選的實施方案中，檢測到顆粒特異性蛋白質。顆粒特異性蛋白質可以是任何可測的蛋白質。在一個實施方案中，顆粒特異性蛋白質是含有顆粒特異性蛋白質和可測分子的融合蛋白，所述可測分子可以是FRET構建體。在另一個優選的實施方案中，提供了篩選能調製細胞胞吐的生物活性劑的方法，其中所述方法包括使至少一種候選生物活性劑與各含有融合核酸的細胞群體混合，所述融合核酸含有編碼顆粒特異性蛋白質和標記物的核酸。使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件之下，並檢測標記物量的變化。標記物量的變化表示該生物活性劑能調製胞吐。優選標記物是表位標記或螢光分子。在優選的實施方案中，螢光分子是FRET構建體。另一方面，本發明提供了篩選胞吐調製劑的方法，所述方法包括使候選生物活性劑，含有編碼可測顆粒特異性蛋白質之核酸的細胞和檢測該蛋白質的試劑相混合。使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件之下，並測定是否存在蛋白質。在另一個優選的實施方案中，提供了篩選能調製細胞胞吐的生物活性劑的方法，所述方法包括將至少一種候選生物活性劑與細胞群體混合。使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件之下，並加入螢光膜聯蛋白。評估細胞表面螢光膜聯蛋白量的變化。在另一個優選的實施方案中，提供了篩選能調製細胞胞吐的生物活性劑的方法，所述方法包括提供細胞群體，其中細胞吸收了低pH濃度的染料。將荷載有低pH濃度染料的細胞與至少一種候選生物活性劑混合，並使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件之下。檢測低pH濃度染料的釋放，所釋放染料的量的變化表示該生物活性劑能調製胞吐。在另一個優選的實施方案中，提供了篩選能調製細胞胞吐的生物活性劑的方法，所述方法包括將至少一種候選生物活性劑與細胞群體混合。使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件之下，並加入特異於顆粒酶的螢光底物。檢測特異於顆粒酶的螢光底物，其中螢光底物量的變化表示該生物活性劑能調製胞吐。在優選的實施方案中，底物包括FRET構建體。另一方面，本發明提供了篩選能調製細胞中的細胞周期調節的生物活性劑的方法和組合物。所述方法包括混合候選生物活性劑文庫和細胞群體，通過至少在細胞生活力試驗，增殖試驗和細胞期試驗的基礎上分離細胞以在FACS儀上分選細胞。另一方面，本發明的方法包括在細胞文庫中表達融合核酸文庫。融合核酸含有編碼候選生物活性劑和可測組成成分的核酸。通過分離細胞以在FACS儀上分選細胞；當細胞表型是細胞周期時，至少在細胞生活力試驗，表達試驗，增殖試驗和細胞期試驗的基礎上分選細胞。圖2A,2B,2C和2D顯示了實施例1的實驗結果。圖2A表示利用正面和側面散射的生活力試驗。收集的是表現出特徵性比例的細胞。圖2B顯示了載體的GFP螢光。圖2C圖示了包含染料PKH26在增殖試驗中的用途；含有已知能抑制細胞的蛋白質p21的細胞仍能發出明亮的螢光，而對照細胞繼續增殖，從而稀釋了染料並失去螢光。圖2D表示Hoechst33342在細胞期試驗中的用途。圖3顯示了AraC處理對經p21(使細胞停滯在G1期的藥劑)感染的Jurkat細胞的影響。AraC是對分裂中的細胞有毒的核苷酸類似物。因此，那些細胞周期停滯的細胞存活下來。下線表示不含p21插入物的Jurkat細胞，上線表示含有p21插入物的Jurkat細胞。圖4A和4B為條形圖，圖中顯示出基於群體的胞吐酶的胞吐活性試驗結果。圖4A顯示出混有DMSO(-)或離子黴素(+)的細胞上清液中的葡糖醛酸酶或氨基己糖苷酶活性。圖4B顯示出經用不同量的IgE抗-DNP致敏並用增加量的抗原BSA-DNP刺激的細胞的上清液中的氨基己糖苷酶活性。圖5A-5F顯示了在流式細胞儀上觀察到的RBL-2H3細胞(圖5A和5D)和MC-9細胞(圖5B,5C,5E和5F)的胞吐光散射變化圖，所述圖是側面散射對正面散射的雙變量直方圖。用離子載體刺激之後，在0分鐘(圖5A和5C)，5分鐘(圖5E)，10分鐘(圖5D)和30分鐘(圖5B和5F)時觀察細胞。圖6A-6E顯示了通過FACS檢測胞吐的苯乙烯染料試驗結果圖。在FM4-64(圖6A和6B)或FM1-43(圖6C,6D和6E)的存在下將細胞與DMSO(左峰)或離子黴素(右峰)混合。圖6A和6C顯示出螢光信道1中檢測的細胞，圖6B和6D顯示出螢光信道3中檢測的細胞。圖6E為條形圖，圖中顯示出在流式細胞儀的螢光信道1中檢測到的通道轉變平均值，其中在施用離子載體(方框1-4)或DMSO(方框5)之前，在FM1-43的存在下將細胞與不同劑量的P1-3激酶抑制劑渥曼青黴素預保溫。圖7A-7D顯示了通過FACS檢測胞吐的膜聯蛋白-V檢測試驗的結果圖。將細胞與DMSO(圖7A和7B)或離子黴素(圖7C和7D)混合，然後用碘化丙錠(圖7A和7C)和膜聯蛋白-V-FITC(圖7B和7D)染色。圖8A-8C顯示了經FACS觀察到的胞吐細胞原位酶學試驗結果圖。將細胞與DMSO(圖8A)或離子黴素(圖8B和8C)混合，然後染色顯示原位葡糖醛酸酶活性。圖8C顯示了細胞表面酶活性的pH分布圖，其中條形圖表示最大信號的百分比，該百分比是通過流式細胞儀中觀察到的通道轉變平均值計算出來的。圖9是通道1中檢測到的螢光強度的直方圖，其中的細胞上荷載有LYSOTRACKERGREENTM，並與DMSO(左)或離子黴素(右)混合，在流式細胞儀中進行觀察。圖10A-10H顯示了包括檢測LYSOTRACKERGREENTM，膜聯蛋白-V-APC和正面散射與側面散射的多參數分析的結果。圖10A-10D和10E-10H各自顯示了用增加劑量的離子黴素處理並在流式細胞儀中同時用4個參數進行觀察的細胞。細胞上荷載有低pH濃度染料，刺激後用膜聯蛋白-V-APC染色。圖10A-10D顯示了側面光散射對正面光散射的雙變量直方圖，圖10E-10H顯示了膜聯蛋白-V-APC對低pH濃度染料信號的雙變量直方圖。圖11顯示了在FM1-43的存在下被刺激並經膜聯蛋白-V-APC染色的細胞圖。在經離子黴素刺激後的不同時間點，通過流式細胞儀分析細胞，並分析上清液(細胞上清液)中的酶活性。將相對於各個參數的最大反應的正面散射，FM-143，膜聯蛋白-V-APC和氨基己糖苷酶的參數作於圖上。對於鈣信號傳遞而言，使獨立管中的細胞荷載有Fluo-3並進行相同的操作。發明詳述本發明涉及通過使用螢光激活的細胞分選(FACS)儀評價或分析多個細胞參數以檢測細胞表型的變化，所述表型如細胞周期調節，胞吐，小分子毒性，細胞表面受體表達，酶表達等。可測定多個參數以檢測多個細胞表型的變化，這一點將在下文中更詳細地描述。通過依次或優選同時分析多個這些參數，可以進行快速和準確的篩選。在優選的實施方案中，使用本文所述的方法篩選細胞表型的調製劑。可以測定的細胞表型包括但不限於細胞凋亡，包括細胞周期調節，胞吐，對小分子的毒性，包括受體(尤其是細胞表面受體)，粘附分子的很多組成成分的表達，細胞因子分泌，蛋白質-蛋白質相互作用等。在優選的實施方案中，使用本文所述的方法評價細胞周期調節。在此實施方案中，優選的細胞參數或試驗是細胞生活力試驗，測定細胞是否在特定的細胞周期階段停滯的試驗(「細胞增殖試驗」)和測定細胞在哪個細胞期停滯的試驗(「細胞期試驗」)。通過分析或測定上述的一個或多個參數，不僅可以檢測細胞周期調節的變化，而且可以檢測細胞周期調節途徑的不同步驟的變化。通過上述試驗可評價天然細胞，例如定量腫瘤細胞類型的攻擊力，或者評價所檢測的候選藥劑對細胞周期調節的影響。通過這種方法可快速而準確地篩選候選藥劑，從而鑑定出能調製細胞周期調節的藥劑。因此，本發明的方法可用於鑑定導致細胞群體從一個生長期進入另一個生長期或使細胞停滯於某個生長期的生物活性劑。在一些實施方案中，細胞停滯於特定的生長期，必需使它們脫離該生長期或者進入一個新的生長期。或者，必需使細胞停滯於某個生長期，如G1期，而不是繼續完成整個細胞周期。類似地，在某些情況下，需要使未停滯但生長緩慢的細胞群體快一些進入下一細胞期或完成整個細胞周期，或者使下一個生長期延遲開始。例如，可以改變對引發細胞期變化有貢獻的某些酶的活性，所述酶如激酶，磷酸酶，蛋白酶或遍在蛋白化酶。在優選的實施方案中，對那些未停滯於G1期的細胞實施本文所述的方法；即所述細胞快速或不受控制地生長和複製，例如腫瘤細胞。通過此方法評價候選藥劑以找到能改變細胞周期調節，即導致細胞停滯於細胞周期關卡，如G1期(但也可以停滯於其它細胞期，如S,G2或M)的藥劑。或者，可評價候選藥劑以找到能導致細胞群體增殖，即使通常停滯於G1期的細胞重新開始增殖的藥劑；所述細胞如外周血細胞，終止分化的細胞，培養中的幹細胞等。因此，在優選的實施方案中，本發明提供了篩選細胞群體之細胞周期調節變化的方法。本文所述的「變化」和「調製」(在本文中可以互換使用)包括所測定參數或表型的增加和降低。對細胞周期調節而言的「變化」或「調製」通常指的是兩種情況中的一種，即要麼增加，要麼降低。在優選的實施方案中，相對於另一個細胞或不同條件下的相同細胞而言，變化導致細胞的細胞周期發生改變，即處於增殖中的細胞停滯於任何一個生長期，或停滯的細胞脫離其停滯的生長期，重新開始細胞周期。或者，細胞渡過任何特定生長期的進程發生變化；即細胞渡過特定生長期的時間變短或變長。例如，細胞渡過G1期的時間通常為幾小時；加入藥劑可延長G1期。可進行測定，其中每次測定的所有條件都相同，或在加或不加生物活性劑的不同條件下，或者在細胞周期進程的不同階段進行測定。例如，可在存在或缺乏候選生物活性劑的情況下測定細胞群體的細胞周期調節。在另一個例子中，可在不同於其它細胞群體的條件或環境下測定某一細胞群體的細胞周期調節。例如，可在存在或缺乏生理信號時評價細胞，所述生理信號如激素，抗體，肽，抗原，細胞因子，生長因子，動作電位，藥劑(即化學治療劑等)，或其它細胞(即細胞-細胞接觸)。在另一個例子中，在細胞周期進程的不同階段測定細胞周期調節。在另一個例子中，在相同條件下測定細胞周期調節，所測定的變化是一個細胞或細胞群體與另一個細胞或細胞群體之間的變化。本文所述的「細胞群體」或「細胞文庫」或「多個細胞」指的是至少兩個細胞，優選至少約103個細胞，尤其優選至少約106個細胞，特別優選至少約108至109個細胞。群體或樣品可含有得自原代或繼代培養物的不同細胞類型的混合物，但優選樣品僅含有一種細胞類型，例如，樣品可得自細胞系，尤其是腫瘤細胞系(尤其是下文所述的腫瘤細胞系中的一個)。細胞可處於任何細胞期，可以同步也可以不同步，包括M,G1,S和G2期。在優選的實施方案中，使用正在複製或增殖的細胞；這樣就可以使用逆轉錄病毒載體導入候選生物活性劑。或者，也可使用非複製的細胞，此時可使用其它載體(如腺病毒和慢病毒載體)。另外，儘管不是必需的，細胞與染料和抗體相容。本發明優選使用的細胞類型隨欲調製的細胞表型的不同而不同。適當細胞包括但不限於哺乳動物細胞，包括動物(嚙齒類動物，包括小鼠，大鼠，倉鼠和沙土鼠)，靈長類動物和人細胞，尤其包括所有類型的腫瘤細胞，包括乳腺癌，皮膚癌，子宮頸癌，結腸癌，白血病，腦瘤等的細胞。如上文所述，也可使用其它細胞類型篩選胞吐。在優選的實施方案中，細胞周期調節法包括通過在FACS儀中分析幾個不同的細胞參數，包括但不限於細胞生活力，細胞增殖和細胞期來分選細胞。在優選的實施方案中，分析了細胞生活力以確保細胞變化的缺乏是由實驗條件(即導入候選生物活性劑)而不是細胞死亡引起的。可以使用多種適當的細胞生活力試驗，包括但不限於光散射，生活力染料染色和排斥染料染色。在優選的實施方案中，將本領域眾所周知的光散射試驗用作生活力試驗。當在FACS中觀察時，通過測定其正面和90°(側面)光散射特性，細胞顯示出特殊的特徵。這些散射特性描述了細胞的大小，形狀和顆粒含量。這些特性將測定的兩個參數計算為生活力的讀數。簡單地說，正在死亡或已死亡的細胞的DNA通常是凝聚的，這改變了90°散射；類似地，膜上起泡也能改變正面散射。光散射強度或細胞-折射率的變化表示生活力的變化。因此，一般說來，為了進行光散射分析，可評價特定細胞類型的活的細胞群體以測定其正面和側面散射特性。籍此建立散射標準待隨後使用。在優選的實施方案中，生活力試驗利用了生活力染料。有很多已知的生活力染料可以染色已死亡或正在死亡的細胞，但不會染色正在生長的細胞。例如，膜聯蛋白V是顯示出以依賴於二價離子的方式特異性結合磷脂(磷脂醯絲氨酸)的蛋白質家族的成員。該蛋白質被廣泛用於測定細胞凋亡(編程性細胞死亡)，因為細胞表面露出磷脂醯絲氨酸是細胞凋亡過程的標誌性早期信號。適當的生活力染料包括但不限於膜聯蛋白，乙錠(ethidium)同型二聚體-1,DEADRed，碘化丙錠，SYTOXGreen等和本領域已知的其它染料；例見螢光探針和研究用化合物的分子探針手冊，Haugland，第6版，列入本文作為參考；尤其參見第285頁的細胞凋亡分析和第16章。測定細胞生活力的生活力染料染色方法是已知的，例見MolecularProbes目錄，文獻同上。在此實施方案中，直接或間接標記諸如膜聯蛋白的生活力染料，然後與細胞群體混合。膜聯蛋白可以商購，即購自PharMingen,SanDiego,California，或CaltagLaboratories,Millbrae,California。優選以溶液的形式提供生活力染料，其中染料濃度約為100ng/ml至約500ng/ml，更優選約為500ng/ml至約1μg/ml，最優選約為1μg/ml至約5μg/ml。在優選的實施方案中，直接標記生活力染料，例如用諸如異硫氰酸螢光素(FITC),Alexa染料，TRITC,AMCA,APC，三-色(tri-color)，Cy-5的螢光染料和本領域已知的或可商購的其它螢光染料標記膜聯蛋白。在另一個優選的實施方案中，用諸如半抗原(如生物素)的第一個標記物標記生活力染料，另外還使用第二個螢光標記物，如螢光鏈黴抗生物素蛋白。本領域技術人員應理解，也可使用其它第一和第二標記對。一旦加入生活力染料，使其與細胞保溫一段時間，必要時進行洗滌。然後按下文所述分選細胞以除去未存活的細胞。在優選的實施方案中，將排斥染料染色用作生活力試驗。排斥染料是被活細胞排斥在外的染料，即它們不能被被動吸收(它們不能穿透活細胞的細胞膜)。然而，由於已死亡或正在死亡的細胞的可穿透性，它們能被死亡細胞吸收。排斥染料通常，但不總是經由例如嵌入結合DNA。優選排斥染料在缺乏DNA時不能發螢光或僅能發出很弱的螢光；這樣就無需洗滌步驟。或者，也可以使用需要使用第二標記物的排斥染料。優選的排斥染料包括但不限於溴化乙錠；乙錠同型二聚體-1；碘化丙錠，SYTOX綠色核酸染色劑；CalceinAM,BCECFAM；二乙酸螢光素；TOTO和TO-PROTM(得自MolecularProbes；文獻同上，見第16章)和本領域已知的其它染料。測定細胞生活力的排斥染料染色方法是已知的，例見MolecularProbes目錄，文獻同上。通常，在細胞中加入的排斥染料的濃度約為100ng/ml至約500ng/ml，更優選約為500ng/ml至約1μg/ml，最優選約為0.1μg/ml至約5μg/ml，特別優選約為0.5μg/ml。將細胞與排斥染料保溫一段時間，必要時進行洗滌。然後按下文所述分選細胞以從細胞群體中除去未存活的細胞。另外，也可使用其它細胞生活力試驗，包括例如酶試驗，該試驗可測定活細胞(即分泌的蛋白酶等)或死細胞(即培養基中胞內酶的存在，例如胞內蛋白酶，線粒體酶等)的胞外酶活性。例見螢光探針和研究用化合物的分子探針手冊，Haugland，第6版，列入本文作為參考；尤其參見第16章。在優選的實施方案中，至少進行一個細胞生活力試驗，優選至少進行兩個不同的細胞生活力試驗，其中螢光劑是相容的。當僅進行一個生活力試驗時，優選實施方案利用了光散射試驗(正面和側面散射)。當進行兩個生活力試驗時，優選實施方案利用了光散射和染料排斥，也可利用光散射和生活力染料染色，在某些情況下也可進行這3個試驗。因此，生活力試驗可以將活細胞與非存活的或正在死亡的細胞分開。除了細胞生活力試驗外，優選實施方案還利用了細胞增殖試驗。本文所述的「增殖試驗」指的是可測定細胞群體在增殖，即複製還是不在複製的試驗。在優選的實施方案中，增殖試驗是染料包含試驗。染料包含試驗依賴於區分細胞期的稀釋效果。簡單地說，將染料(通常為下文所述的螢光染料)導入細胞並被細胞吸收。染料一旦被吸收即陷入細胞，而不會滲出。由於細胞群體的分裂，染料也成比例地稀釋。即導入包含染料之後，將細胞保溫一段時間，逐漸失去螢光的細胞是正在分裂的細胞，保持螢光的細胞則停滯於非生長期。一般說來，可以兩種方法中的一種導入包含染料。任一種染料都不能被動進入細胞(例如帶電的染料)，必須處理細胞以吸收染料；例如通過使用電脈衝。或者，染料可被動進入細胞，但吸收後即被修飾使得其不能滲出細胞。例如，對包含染料進行酶修飾可使其帶電，從而不能滲出細胞。例如，MolecularProbesCellTrackerTM染料是可自由滲入細胞的螢光氯甲基衍生物，穀胱甘肽S-轉移酶介導的反應產生了不能透過膜的染料。適當的包含染料包括但不限於可得自MolecularProbes的CellTrackerTM染料系列，包括但不限於CellTrackerTM藍，CellTrackerTM黃-綠，CellTrackerTM綠，CellTrackerTM橙黃，PKH26(Sigma)和本領域已知的其它染料；參見分子探針手冊，文獻同上；尤其參見第15章。通常，給細胞提供的包含染料的濃度約為100ng/ml至約5g/ml，優選約為500ng/ml至約1μg/ml。洗滌步驟可用可不用。在優選的實施方案中，將候選生物活性劑與本文所述的細胞混合。將細胞與包含染料保溫一段時間以使細胞分裂，從而使染料被稀釋。保溫時間的長度取決於特定細胞的細胞周期時間；通常，優選至少進行約2次細胞分裂，特別優選至少進行約3次細胞分裂，尤其優選至少進行約4次細胞分裂。然後按下文所述分選細胞以產生正在複製和不在複製的細胞群體。本領域技術人員應懂得，在某些情況下，例如當篩選抗增殖劑時，需收集發光(即螢光)的細胞；在其它實施方案中，例如篩選增殖劑時，需收集低螢光的細胞。通過測定不同時間點或不同細胞群體中的螢光，並將檢測結果與另一個結果或標準結果相比較即可測定變化。在優選的實施方案中，增殖試驗是抗代謝物試驗。一般說來，當需要導致細胞停滯於G1或G2靜息期的藥劑時，抗代謝物試驗最為有用。在抗代謝物的增殖試驗中，使用能殺死分裂細胞的有毒抗代謝物會導致只有非分裂的細胞才能存活。適當的抗代謝物包括但不限於標準的化學治療劑，如氨甲蝶呤，順式鉑氨，紅豆杉醇，羥基脲，核苷酸類似物，如AraC等。另外，抗代謝物試驗可包括使用通過表達導致細胞死亡的基因。所加入的抗代謝物濃度取決於特定抗代謝物的毒性，本領域技術人員容易確定該濃度。加入抗代謝物，一般將細胞保溫一段時間；精確的保溫時間取決於抗代謝物的特徵和特性以及特定細胞群體的細胞周期時間。通常，保溫時間足以發生至少一次細胞分裂。在優選的實施方案中，至少進行一次增殖試驗，優選進行一次以上的增殖試驗。因此，增殖試驗導致產生增殖細胞群體和停滯細胞群體。在優選的實施方案中，在上文所述的一次或多次增殖試驗之後或同時還進行了至少一次細胞期試驗。「細胞期」試驗可測定細胞停滯於哪個細胞期，是M,G1,S還是G2期。在優選的實施方案中，細胞期試驗是DNA結合染料試驗。簡單地說，DNA結合染料被導入細胞和被動吸收。一旦進入細胞，DNA結合染料一般通過嵌入與DNA結合，但在某些情況下，染料可以是主要的或次要的溝結合化合物。因此，染料的量與細胞中的DNA量直接相關，而DNA的量隨細胞期的不同而變化；G2和M期細胞的DNA含量兩倍於G1期細胞，S期細胞的DNA含量據中，這取決於細胞處於S期的哪個點。適當的DNA結合染料是可穿透的，其包括但不限於Hoechst33342和33258，丫啶橙，7-AAD,LDS751,DAPI和SYTO16，分子探針手冊，文獻同上；尤其參見第8和16章。通常，所加入的DNA結合染料的濃度約為1μg/ml至約5μg/ml。在細胞中加入染料保溫一段時間；保溫時間的長度部分取決於所選擇的染料。在一個實施方案中，在加入染料之後立即進行測定。然後按下文所述分選細胞以產生含有不同量染料，因此含有不同量DNA的細胞群體；通過這種方法，可將正在複製的細胞與不在複製的細胞分開。本領域技術人員應懂得，在某些情況下，例如當篩選抗增殖劑時，可將具有最少螢光(因此含有單拷貝基因組)的細胞與正在複製因此含有一拷貝以上基因組DNA的細胞分開。通過測定不同時間點或不同細胞群體中的螢光，並將檢測結果與另一個結果或標準結果相比較即可測定變化。在優選的實施方案中，細胞期試驗是細胞周期蛋白破壞試驗。在此實施方案中，在篩選之前(一般在導入下文所述候選生物活性劑之前)將融合核酸導入細胞。融合核酸含有編碼細胞周期蛋白破壞盒的核酸和編碼可測分子的核酸。「細胞周期蛋白破壞盒」是本領域已知的，它是在特定的細胞期階段，經由含有所述破壞盒的蛋白質的遍在蛋白化途徑導致破壞的序列。例如，G1細胞周期蛋白在G1期是穩定的，但在S期就會因G1細胞周期蛋白破壞盒的存在而被分解。因此，通過將細胞周期蛋白破壞盒與可測分子(例如綠色螢光蛋白)連接，觀察是否存在可測分子即可鑑定細胞群體的細胞期。在優選的實施方案中，使用了多個盒，優選每個盒具有不同的螢光劑以檢測細胞期。本領域已知多個細胞周期蛋白破壞盒，例如，細胞周期蛋白A具有含有序列RTVLGVIGD的破壞盒；細胞周期蛋白B1的破壞盒含有序列RTALGDIGN，例見Glotzer等，自然，349:132-138(1991)。其它破壞盒也是已知的YMTVSIIDRFMQDSCVPKKMLQLVGVT(大鼠細胞周期蛋白B)；KFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNSCVPKK(小鼠細胞周期蛋白B)；RAILIDWLIQVQMKFRLLQETMYMTVS(小鼠細胞周期蛋白B1)；DRFLQAQLVCRKKLQVVGITALLLASK(小鼠細胞周期蛋白B2)；和MSVLRGKLQLVGTAAMLL(小鼠細胞周期蛋白A2)。編碼細胞周期蛋白破壞盒的核酸與編碼可測分子的核酸可操作相連。通過本領域已知的方法構建融合蛋白。例如，將編碼破壞盒的核酸與編碼可測分子的核酸相連接。本文所述的「可測分子」指的是能使含有可測分子的細胞或化合物與不含有可測分子的細胞或化合物區分開的分子，即表位，有時也稱為抗原TAG，特異性酶或螢光分子。優選的螢光分子包括但不限於綠色螢光蛋白(GFP)，藍色螢光蛋白(BFP)，黃色螢光蛋白(YFP)，紅色螢光蛋白(RFP)和包括螢光素酶和β-半乳糖苷酶的酶。當使用抗原TAG時，優選實施方案利用了細胞表面抗原。優選表位是任何可測的肽，所述肽不是胞質膜上常見的肽，但在某些情況下，如果表位是細胞上常見的肽，即可檢測到增加，但一般不優選這種情況。類似地，也可使用酶可測分子，例如，可使用能產生新的或顯色產物的酶。因此，細胞期試驗之後的分選結果一般導致產生至少兩個處於不同細胞期的細胞群體。在優選的實施方案中，使用本發明的方法篩選能調製細胞周期調節的候選生物活性劑，所述方法包括激活或抑制細胞周期關卡途徑和改良關卡缺陷。可在細胞群體外部環境中加入候選生物活性劑，或者按下文所述將候選生物活性劑導入細胞中。本文所用術語「候選生物活性劑」或「外源化合物」描述了任何分子，例如蛋白質，小的有機分子，糖(包括多糖)，多核苷酸，脂質等。通常以不同的生物活性劑濃度平行進行多個試驗以得到對不同濃度的差異反應。一般說來，將其中一個濃度用作陰性對照，即0濃度或檢測水平以下的濃度。另外，可使用陽性對照。例如，在細胞周期試驗中，可使用已知能改變細胞周期的生物活性劑。例如，p21是已知能通過結合G1細胞周期蛋白-CDK複合物而將細胞停滯於G1細胞期的分子。類似地，為了檢測胞吐，可使用已知能誘導胞吐的化合物，這一點將在下文中詳細描述。候選藥劑包含多個化學類別，但它們一般是有機分子，優選為分子量大於100小於約2500道爾頓的小的有機化合物。候選藥劑含有與蛋白質發生結構相互作用(尤其是氫鍵鍵合)所必需的功能基團，一般至少包括胺，羰基，羥基或羧基，優選至少包括兩個功能性的化學基團。候選藥劑經常含有被上述一個或多個功能基團取代的碳環或雜環結構和/或芳香或多芳香結構。候選藥劑也可以是生物分子，其包括肽，多糖，脂肪酸，類固醇，嘌呤，嘧啶，以及它們的衍生物，結構類似物或其組合。特別優選的是肽。候選藥劑可得自多個來源，包括合成或天然化合物文庫。例如，可使用多種方法隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子，包括表達隨機化的寡核苷酸。或者，也可得到或容易地產生細菌，真菌，植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，可通過常規的化學，物理和生物化學的方法容易地修飾天然或合成產生的文庫和化合物。可對已知藥劑進行定向或隨機化學修飾，如醯化，烷基化，酯化，醯胺化以產生結構類似物。在優選的實施方案中，候選生物活性劑是蛋白質。本文所述的「蛋白質」指的是至少兩個共價結合的胺基酸，其包括蛋白質，多肽，寡肽和肽。蛋白質可由天然胺基酸和肽鍵或合成的肽模擬結構構成。因此，本文所述的「胺基酸」或「肽殘基」指的是天然和合成的胺基酸。例如，高-苯丙氨酸，瓜氨酸和正亮氨酸也是可用於本發明的胺基酸。「胺基酸」還包括亞胺基酸殘基，如脯氨酸和羥脯氨酸。側鏈可以是(R)或(S)構型。在優選的實施方案中，胺基酸是(S)或L-構型。如果使用的是非天然側鏈，則可使用非胺基酸取代基以防止或延遲體內降解。也可加入化學封閉基團或其它化學取代基。在優選的實施方案中，候選生物活性劑是天然蛋白質或天然蛋白質的片斷。因此，可使用例如含蛋白質的細胞提取物，或含蛋白質之細胞提取物的隨機或定向消化物。通過這種方法，可在本文所述的系統中製備原核和真核蛋白質文庫以用於篩選。在此實施方案中，特別優選的是細菌，真菌，病毒和哺乳動物的蛋白質文庫，優選哺乳動物蛋白質文庫，尤其優選人蛋白質文庫。在優選的實施方案中，候選生物活性劑是約5至約30個胺基酸，優選為約5至約20個胺基酸，特別優選為約7至約15個胺基酸的肽。肽可以是上文所述的天然蛋白質的消化物，隨機肽或「偏性」隨機肽。本文所述的「隨機化」或其同義詞指的是每個核酸和肽分別由基本上隨機的核苷酸和胺基酸組成。由於這些隨機肽(或下文將要討論的核酸)一般是化學合成的，它們可在任何位置處摻入任何核苷酸或胺基酸。可設計合成方法以產生隨機化的蛋白質或核酸，從而形成所有或大多數可能的序列長度組合，以形成隨機化的候選生物活性蛋白質藥劑文庫。在一個實施方案中，文庫是完全隨機化的，在任何位置處都沒有序列優先或保持不變的序列。在優選的實施方案中，文庫是有偏好的。即序列的某些位置要麼保持不變，要麼選自有限數目的可能性。例如，在優選的實施方案中，確定類型的核苷酸或胺基酸殘基，例如疏水性胺基酸，親水性殘基，對空間有偏好(或小或大)的殘基被隨機化，以產生半胱氨酸用於交聯，產生脯氨酸用於SH-3結構域，產生絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸或組氨酸用於磷酸化位點等，或者嘌呤被隨機化等。在優選的實施方案中，候選的生物活性劑是核酸。本文所述的「核酸」或「寡核苷酸」或其同義詞指的是至少兩個共價連接的核苷酸。本發明的核酸一般含有磷酸二酯鍵，但是，如下文所述，在某些情況下，上述核酸也包括具有另一種骨架的核酸類似物，其含有例如磷酸醯胺(Beaucage等，四面體，49(10):1925(1993)和其中提及的參考文獻；Letsinger，有機化學雜誌，35:3800(1970)；Sprinzl等，歐洲生物化學雜誌，81:579(1977)；Letsinger等，核酸研究，14:3487(1986)；Sawai等，化學通訊，805(1984),Letsinger等，美國化學協會雜誌，110:4470(1988)；和Pauwels等，ChemicaScripta,26:141(1986))，硫代磷酸酯(Mag等，核酸研究，19:1437(1991)；和美國專利5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，美國化學協會雜誌，111:2321(1989)),O-甲基亞磷醯胺連鍵(見Eckstein，寡核苷酸和類似物操作方法，牛津大學出版社)，和肽核酸骨架和連鍵(見Eghoim，美國化學協會雜誌，114:1895(1992)；Mejer等，Chem.Int.Ed.Engl,31:1008(1992)；Nielsen，自然，365:566(1993)；Carisson等，自然，380:207(1996)，皆列入本文作為參考)。其它類似物核酸包括具有正骨架(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6097(1995))；非離子型骨架(美國專利5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English,30:423(1991)；Letsinger等，美國化學協會雜誌，110:4470(1988)；Letsinger等，核苷核苷酸，13:1597(1994)；ASC專題討論會叢書580「反義修飾糖類的研究」的第2和3章，Y.S.Sanghui和P.DanCook編；Mesmaeker等，生物有機化學藥物化學通訊，4:395(1994)；Jeffs等，生物分子NMR雜誌，34:17(1994)；四面體通訊，37:743(1996))和非-核糖骨架(包括描述於美國專利5,235,033和5,034,506，以及ASC專題討論會叢書580「反義修飾糖類的研究」的第6和7章(Y.S.Sanghui和P.DanCook編)中的骨架)的核酸。核酸的定義中還包括含有一個或多個碳環糖的核酸(見Jenkins等，化學協會評論(1995)p169-176)。Rawls,CENews,June2,1997,p35中描述了幾個核酸類似物。上述所有參考文獻都列入本文作為參考。可對核糖-磷酸骨架進行這些修飾以便於添加其它組成成分(如標記)，或者增加該分子在生理環境中的穩定性和半壽期。另外，可製備天然核酸和類似物的混合物。或者，可製備不同核酸類似物的混合物，和天然核酸和類似物的混合物。按照說明，核酸可以是單鏈或雙鏈，或含有部分雙鏈或單鏈序列。核酸可以是DNA(基因組DNA和cDNA),RNA或雜合體，其中核酸含有任意組合的脫氧核糖-和核糖-核苷酸，和任意組合的鹼基，包括尿嘧啶，腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鳥嘌呤，肌苷，xathaninehypoxathanine，異胞嘧啶(isocytosine)，異鳥嘌呤(isoguanine)等。如上文對蛋白質所作的一般性描述一樣，核酸候選生物活性劑可以是天然核酸，隨機核酸，或「偏性」隨機核酸。例如，如上文對蛋白質所作的描述一樣，可以使用原核或真核基因組的消化物。在優選的實施方案中，候選生物活性劑是有機化學組成成分，其中的很多成分已在文獻中描述過。在優選的實施方案中，使用了不同候選生物活性劑的文庫。優選文庫應提供在結構上足夠多樣化的隨機化生物活性劑群體以獲得儘可能多的機會來結合特定的靶。因此，相互作用的文庫應儘可能大以使其中的至少一個成員具有與靶有親和力的結構。儘管難以估計相互作用文庫所需的絕對大小，但免疫應答給我們提供了一個暗示107-108個不同抗體的多樣性提供了至少一個具有足夠的親和力以與生物體面臨的大多數潛在抗原相互作用的組合。已知的體外選擇技術顯示出大小為107-108的文庫足以篩選到與靶具有親和力的結構。本文一般性建議的長度為7至20個胺基酸的肽的所有組合文庫具有編碼207(109)至2020的潛力。因此，具備107-108個不同分子的文庫，本發明方法允許7個胺基酸在理論上完全的相互作用文庫的「工作」子集，和2020文庫的外形子集。因此，在優選的實施方案中，使用本發明方法同時分析至少106，優選至少107，更優選至少108和最優選至少109個不同的序列。優選方法使文庫大小和多樣性最大化。在細胞或細胞群體中混合或加入候選生物活性劑。不同實施方案的適當細胞類型如上所述。使候選生物活性劑和細胞混合。本領域技術人員應懂得，使用多種方法中的任何一種或多種都可實現此目的，所述方法包括在細胞表面，在含有細胞的培養基中，或在細胞生長或接觸的表面加入候選藥劑；通過例如使用可將藥劑導入細胞中的載體將藥劑加入細胞中(即當藥劑是核酸或蛋白質時)。在優選的實施方案中，候選生物活性劑是使用載體(包括病毒載體)導入宿主細胞的核酸或蛋白質(此意義上的蛋白質包括蛋白質，寡肽和肽)。載體，優選為病毒載體的選擇取決於細胞類型。當細胞正在複製時，可使用逆轉錄病毒載體，這一點將在下文詳細描述。當細胞不在複製時(即停滯於某個生長期)，可使用其它病毒載體，包括慢病毒和腺病毒載體。在優選的實施方案中，細胞正在複製或可經誘導而複製，可使用逆轉錄病毒載體將候選生物活性劑導入細胞，PCTUS97/01019和PCTUS97/01048(皆列入本文作為參考)中一般性地描述了上述方法。通常，使用逆轉錄病毒包裝細胞系製備逆轉錄病毒載體文庫，所述細胞係為輔助細胞缺損的細胞系，它能產生所有必需的反式蛋白質，包括gag,pol和env，以及順式具有ψ包裝信號的RNA分子。簡單地說，在逆轉錄病毒構建體骨架中產生文庫；使用本領域眾所周知的技術進行標準的寡核苷酸合成以產生候選藥劑或編碼蛋白質(例如隨機肽)的核酸。產生DNA文庫之後，將文庫克隆至第一個引物中。第一個引物可用作「盒」，將該盒插入逆轉錄病毒構建體中。第一個引物一般含有多個元件，包括例如必需的調節序列(如翻譯，轉錄，啟動子等)，融合配對物，限制性內切核酸酶(克隆和亞克隆)位點，終止密碼子(優選在所有3個框內)，與第二條引發鏈互補的區域(優選位於終止密碼子區域的末端，因為在隨機區域中可能會出現小的缺失或插入)等。然後加入第二個引物，該引物一般由一些或所有互補區域(用於引發第一個引物)和任選的第二個唯一的限制性位點(用於亞克隆)的必需序列組成。加入DNA聚合酶以製備雙鏈寡核苷酸。按下述用適當的亞克隆限制性內切核酸酶裂解雙鏈寡核苷酸，然後亞克隆至靶逆轉錄病毒載體。可使用很多適當逆轉錄病毒載體。通常，逆轉錄病毒載體包括下文將要詳細描述的選擇標記基因；相對於5』LTR而言被置於有義或反義方向的，用於驅動第二個基因表達的啟動子；CRU5(合成的LTR)，SIN中的四環素調節元件，細胞特異性啟動子等。優選的逆轉錄病毒載體包括基於鼠幹細胞病毒(MSCV)(見Hawley等，基因治療，1:136(1994))和經修飾的MFG病毒(Rivere等，遺傳學，92:6733(1995))的載體和pBABE(見PCTUS97/01019)。逆轉錄病毒可含有表達候選藥劑所用的誘導型和組成型啟動子。例如，在某些情況下，僅在選定過程的某個時期，或僅在某個細胞期(即使用生長期特異性的啟動子，如E2F反應啟動子，p53反應啟動子，細胞周期蛋白啟動子等)必需誘導肽表達。多種誘導型和組成型的啟動子是已知的。另外，可設計逆轉錄病毒載體以在將單個載體轉化至靶細胞之後能誘導表達逆轉錄病毒插入物；重要的是，整個系統包含在單個逆轉錄病毒中。經設計，在四環素-誘導型逆轉錄病毒中摻入了3』LTR增強子/啟動子逆轉錄病毒缺失突變體的自我滅活(SIN)特徵(Hoffman等，PNASUSA93:5185(1996))。在四環素或其它活性類似物的存在下在細胞中表達該載體是肉眼觀察不到的。然而，缺乏四環素時，在誘導後48小時之內表達達到最高水平，攜有誘導型逆轉錄病毒的整個細胞群體的表達均一地增加，這表明被感染的細胞群體內的表達受到均一地調節。類似地，相關系統使用了突變的四環素DNA-結合結構域使其在存在四環素時能結合DNA，而在缺乏四環素時可被除去。其中的任一種系統都是合適的。在優選的實施方案中，候選生物活性劑與融合配對物連接。本文所述的「融合配對物」或「功能性基團」指的是與候選生物活性劑相連的序列，它可賦予該類文庫的所有成員以共同的功能或能力。融合配對物可以是異源的(即不是宿主細胞天然具有的)或合成的(不是任何細胞所天然具有的)。適當的融合配對物包括但不限於a)呈遞結構，如下文所述，該結構可提供構象受限制的或穩定形式的候選生物活性劑；b)靶向序列，如下文所述，該序列可使候選生物活性劑定位於亞細胞的或細胞外的區室內；c)獲救序列，如下文所述，該序列可以純化或分離候選生物活性劑或編碼它們的核酸；d)穩定性序列，該序列可賦予候選生物活性劑或編碼它們的核酸以穩定性或防止它們降解，例如賦予它們對蛋白酶解的抗性；e)二聚體化序列，該序列可以使肽二聚體化；或f)a),b),c),d)和e)的任何組合以及所需的接頭序列。在優選的實施方案中，融合配對物是呈遞結構。本文所述的「呈遞結構」及其同義詞指的是序列，當該序列與候選生物活性劑融合時，會導致候選生物活性劑成為構象受限的形式。蛋白質主要通過構象受限的結構域而相互作用。儘管具有自由旋轉的氨基和羧基末端的小肽具有本領域已知的潛在功能，但將該肽結構轉變為藥劑是困難的，因為無法預測合成模擬肽時的側鏈位置。因此，呈遞具有構象受限之結構的肽有利於以後產生藥物，也可能導致肽與靶蛋白質之間較高親和力的相互作用。在細菌噬菌體系統中使用生物產生的短肽，在組合文庫產生系統中驗證了上述事實。很多研究人員已構建了小結構域分子，其中可能提供了隨機化的肽結構。儘管候選生物活性劑可以是核酸或肽，但優選使用含有肽候選藥劑的呈遞結構。因此，合成的呈遞結構，即人工多肽能將隨機化的肽呈遞為構象受限的結構域。這種呈遞結構一般含有與隨機化肽的N末端相連的第一部分和與肽的C末端相連的第二部分；即肽被插入呈遞結構中，但如下文所述，也可以進行改變。為了增加隨機化表達產物的功能性分離，可選擇或設計呈遞結構以使其在靶細胞中表達時具有最低的生物活性。優選的呈遞結構通過將肽呈遞至外部環上而儘可能地靠近肽，因此，適當的呈遞結構包括但不限於小體結構，β-摺疊轉角上的環和捲曲螺旋莖結構上的環(其中對結構不是至關重要的殘基被隨機化)，鋅指結構域，半胱氨酸-連接的(二硫鍵)結構，轉穀氨醯胺酶連接的結構，環肽，β-環結構，螺旋筒或螺旋束，亮氨酸拉鏈基元等。在優選的實施方案中，呈遞結構是捲曲螺旋結構，該結構可使隨機化的肽被呈遞至外部環上。例見Myszka等，生物化學，33:2362-2373(1994)(列入本文作為參考)。研究人員使用該系統分離出能與適當靶以高親和力相互作用的肽。通常，捲曲螺旋結構允許有6至20個隨機化位置。優選的捲曲螺旋呈遞結構如下MGCAALESEVSALESEVASLESEVAALGRGDMPLAAVKSKLSAVKSKLASVKSKLAACGPP。下劃線區域表示上文所述的捲曲螺旋亮氨酸拉鏈區域(見Martin等，EMBOJ.13(22):5303-5309(1994)，列入本文作為參考)。黑體的GRGDMP區域表示環結構，當被隨機化的肽(即候選生物活性劑，本文中一般以(X)n表示，其中X是胺基酸殘基，n是至少為5或6的整數)適當取代時其長度可變。通過在下劃線區域編碼限制性內切核酸酶位點有利於取代黑體區域，這樣就可以在這些位置處直接摻入隨機化的寡核苷酸。例如，優選實施方案在雙劃線的LE位點產生了XhoⅠ位點，在雙劃線的KL位點產生了HindⅢ位點。在優選的實施方案中，呈遞結構是小體結構。「小體」實質上由小的抗體互補區域組成。小體呈遞結構一般提供了兩個隨機化區域，在摺疊的蛋白質中，該小體沿著四級結構的單一表面被呈遞。例見Bianchi等，分子生物學雜誌，236(2):649-59(1994)和其中提及的參考文獻(皆列入本文作為參考)。研究人員已證明這一小結構域在溶液中是穩定的，並在組合文庫中使用噬菌體選擇系統選擇出小體，該小體具有的肽區域對促炎細胞因子IL-6表現出高親和力，Kd=10-7。優選的小體呈遞結構如下MGRNSQATSGFTFSHFYMEWVRGGEYIAASRHKHNKYTTEYSASVKGRYIVSRDTSQSILYLQKKKGPP。黑體，下劃線的區域是可以隨機化的區域。第一個隨機化區域中的斜體苯丙氨酸必須是不變的。將整個肽克隆至捲曲螺旋實施方案的3-寡核苷酸變異處，從而使兩個不同的隨機化的區域能同時摻入。該實施方案利用了末端的非-回文BstⅪ位點。在優選的實施方案中，呈遞結構是一般含有兩個半胱氨酸殘基的序列，從而形成二硫鍵，導致構象受限的序列。當使用分泌靶向序列時，特別優選此實施方案。本領域技術人員應懂得，含有或不含有間隔序列或連接序列的很多隨機序列的側翼都可具有半胱氨酸殘基。在其它實施方案中，通過隨機區域本身可產生有效的呈遞結構。例如，可在隨機區域中摻入半胱氨酸殘基，在適當的氧化還原作用條件下可產生類似於呈遞結構的具有高度交聯結構的構象。類似地，可控制隨機化區域以含有一些殘基，所述殘基可賦予β-摺疊或α-螺旋結構。在優選的實施方案中，融合配對物是靶向序列。本領域技術人員應懂得，細胞中的蛋白質定位是增加有效濃度和測定功能的簡單方法。例如，當RAF1位於線粒體膜時可抑制BCL-2的抗細胞凋亡作用。類似地，與膜結合的Sos可誘導T淋巴細胞中由Ras介導的信號傳遞。據認為這些機理依賴於限制配體搜尋空間的原理，也就是說，蛋白質在質膜上的定位將對其配體的搜尋局限在膜附近有限維的空間而不是胞質的三維空間。或者，蛋白質的濃度也可簡單地通過定位的特徵而增加。將蛋白質穿梭至核中可使它們局限於較小的空間從而增加濃度。最終，配體或靶可簡單地定位於特定的區室，而抑制劑必須適當地定位。因此，適當的靶向序列包括但不限於能導致表達產物與預定分子或分子類結合而同時能保持表達產物的生物活性的結合序列(例如通過使用酶抑制劑或底物序列靶向一類相關酶)；能發出選擇性降解其自身或共結合的蛋白質之信號的序列；和能將候選表達產物組成型定位於預定細胞區域的信號序列，所述定位包括a)亞細胞定位，如高爾基體，內質網，核，核仁，核膜，線粒體，葉綠體，分泌小泡，溶酶體和細胞膜；和b)經由分泌信號在細胞外定位。特別優選的是定位於亞細胞位置或經由分泌定位於細胞外部。在優選的實施方案中，靶向序列是核定位信號(NLS)。NLS一般是短的，帶正電(鹼性)的區域，它們出現在細胞核中可用於介導整個蛋白質的定位。已報導了多個NLS胺基酸序列，包括單個鹼性NLS，如SV40(猴病毒)大T抗原的NLS(ProLysLysLysArgLysVal),Kalderon(1984)等，細胞，39:499-509；人視黃酸受體β核定位信號(ARRRRP)；NFkBp50(EEVQRKRQKL；Ghosh等，細胞，62:1019(1990))；NFkBp65(EEKRKRTYE；Nolan等，細胞，64:961(1991))；和其它NLS(例見Boulikas，細胞生物化學雜誌，55(1):32-58(1994)，列入本文作為參考)和兩個鹼性NLS，例如非洲爪蟾蛋白質核質蛋白的NLS(AlaValLysArgProAlaAlaThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLysLysLysLeuAsp,Dingwall等，細胞，30:449-458,1982和Dingwall等，細胞生物學雜誌，107:641-849；1988)。多項定位研究表明摻入合成肽或移植到一般不會靶向細胞核的報導蛋白上的NLS會導致這些肽和報導蛋白在核中濃縮。例見Dingwall和Laskey，細胞生物學年評，2:367-390,1986；Bonnerot等，Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA,84:6795-6799,1987；Galileo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:458-462,1990。在優選的實施方案中，靶向序列是膜錨著信號序列。該序列特別有用，因為除了很多細胞內事件源於質膜的這一事實外，很多寄生蟲和病原體也與膜結合。因此，與膜結合的肽文庫可用於鑑定這些過程中的重要元件以及用於發現有效的抑制劑。本發明提供了將隨機化的表達產物呈遞至細胞外或胞質空間的方法；見圖3。為了呈遞至細胞外，可在肽呈遞結構的羧基末端提供膜錨著區域。在細胞表面表達隨機化表達產物區域並呈遞至細胞外間隙，以使其能結合其它表面分子(以實現其功能)或細胞外基質中存在的分子。這種分子的結合能賦予細胞表達與分子結合之肽的功能。胞質區域可以是中性的，或可含有結構域，當胞外隨機化表達產物區域被結合時，該結構域可賦予細胞功能(激活激酶，磷酸酶，結合其它細胞成分以實現功能)。類似地，胞質區域中可含有含-隨機化表達產物的區域，跨膜區和胞外區域保持不變或具有確定的功能。膜錨著序列是本領域眾所周知的，它以哺乳動物跨膜分子的遺傳幾何學為基礎。根據信號序列(本文稱之為ssTM)將肽插入膜，所述肽需要疏水性跨膜結構域(本文稱之為TM)。將跨膜蛋白質插入膜以使編碼跨膜結構域5』端的區域位於細胞外，而序列3』端位於細胞內。當然，如果這些跨膜結構域位於可變區的5』端，它們可用於將其錨著為胞內結構域，這在某些實施方案中是必需的。多種膜結合蛋白的ssTM和TM是已知的，因此可將這些序列用作特定蛋白質的配對物，或將這些序列與得自不同蛋白質的各個成分一起使用，或者，序列可以是合成的，並作為人工傳遞結構域完全得自共有序列。本領域技術人員應懂得，對多種蛋白質而言，包括ssTM和TM的膜錨著序列是已知的，它們中的任一種都可以使用。特別優選的膜錨著序列包括但不限於得自CD8,ICAM-2,IL-8R,CD4和LFA-1的膜錨著序列。有用的序列包括得自下列蛋白質的序列1)Ⅰ類膜內在蛋白，如IL-2受體β-鏈(殘基1-26是信號序列，241-265是跨膜殘基；例見Hatakeyama等，科學，244:551(1989)和vonHeijne等，歐洲生物化學雜誌，174:671(1988))和胰島素受體β-鏈(殘基1-27是信號序列，957-959是跨膜結構域，960-1382是胞質結構域；例見Hatakeyama等，文獻同上和Ebina等，細胞40:747(1985))；2)Ⅱ類膜內在蛋白，如中性內肽酶(殘基29-51是跨膜結構域，2-28是胞質結構域；例見Malfroy等，生物化學與生物物理研究通訊，144:59(1987))；3)Ⅲ型蛋白質，如人細胞色素P450NF25(Hatakeyama，文獻同上)；和4)Ⅳ型蛋白質，如人P-糖蛋白(Hatakeyama，文獻同上)。特別優選的是CD8和ICAM-2。例如，得自CD8和ICAM-2的信號序列位於轉錄物5』末端最靠外的位置。對CD8而言，這構成了胺基酸1-32(MASPLTRFLSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP；Nakauchi等，PNASUSA82:5126(1985))，對ICAM-2而言，這構成了胺基酸1-21(MSSFGYRTLTVALFTLICCPG；Staunton等，自然(倫敦)339:61(1989))。這些前導序列將構建體傳遞至膜，而位於隨機候選區域3』末端的疏水性跨膜結構域可用於將構建體錨著於膜中。這些跨膜結構域由CD8的胺基酸145-195(PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSR；Nakauchi，文獻同上)和ICAM-2的胺基酸224-256(MVIIVTVVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR；Staunton，文獻同上)構成。或者，膜錨著序列包括GPI錨，例如，該錨在DAF中可導致分子和脂質雙層之間經由糖基磷脂醯肌醇鍵的共價鍵(PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT，黑體的絲氨酸即為錨著位點；例見Homans等，自然333(6170):269-72(1988)和Moran等，生物化學雜誌，266:1250(1991))。為了做到這一點，可將Thy-1的GPI序列插入可變區的3』端以取代跨膜序列。類似地，十四烷基化的序列可用作膜錨著序列。已知c-src的十四烷基化可使其被吸收到質膜上。假設該蛋白質的前14個胺基酸僅負責此功能MGSSKSKPKDPSQR(例見Cross等，分子細胞生物學，4(9):1834(1984)；Spencer等，科學262:1019-1024(1993)，皆列入本文作為參考)，這就是一個簡單而有效的膜定位方法。已證明該基元能有效定位報導基因，並可用於錨著TCR的θ鏈。將該基元置於可變區的5』端以使構建體定位於質膜。可使用諸如十六醯化的其它修飾將構建體錨著於質膜；例如，得自與G蛋白-偶聯的受體激酶GRK6序列的十六醯化序列(LLQRLFSRQDCCGNCSDSEEELPTRL，黑體的半胱氨酸被十六醯化；Stoffel等，生物化學雜誌，269:27791(1994))；得自視紫紅質的十六醯化序列(KQFRNCMLTSLCCGKNPLGD；Barnstable等，分子神經科學雜誌，5(3):207(1994))；和p21H-ras1蛋白(LNPPDESGPGCMSCKCVLS；Capon等，自然302:33(1983))。在優選的實施方案中，靶向序列是溶酶體靶向序列，包括例如溶酶體降解序列，如Lamp-2(KFERQ；Dice,Ann.N.Y.Acad.Sci.674:58(1992))或Lamp-1的溶酶體膜序列(MLIPIAGFFALAGLVLIVLIAYLIGRKRSHAGYQTI,Uthayakumar等，細胞分子生物學研究，41:405(1995))或Lamp-2的溶酶體膜序列(LVPIAVGAALAGVLILVLLAYFIGLKHHHAGYEQF,Konecki等，生物化學與生物物理研究通訊，205:1-5(1994)，兩個序列中的斜體都表示跨膜結構域，下劃線的是胞質靶向信號)。或者，靶向序列可以是線粒體定位序列，包括線粒體基質序列(如酵母的醇脫氫酶Ⅲ；MLRTSSLFTRRVQPSLFSRNILRLQST；Schatz，歐洲生物化學雜誌，165:1-6(1987))；線粒體內膜序列(酵母細胞色素c氧化酶亞單位Ⅳ；MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL；Schatz，文獻同上)；線粒體膜間間隙序列(酵母細胞色素c1；MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAEAMTA；Schatz，文獻同上)或線粒體外膜序列(酵母70kD外膜蛋白；MKSFITRNKTAILATVAATGTAIGAYYYYNQLQQQQQRGKK；Schatz，文獻同上)。靶序列也可以是內質網序列，包括得自鈣網蛋白的序列(KDEL；Pelham,RoyalSocietyLondonTransactionsB；1-10(1992))或得自腺病毒E3/19K蛋白的序列(LYLSRRSFIDEKKMP；Jackson等，EMBOJ,9:3153(1990))。另外，靶向序列也包括過氧化物酶體序列(例如，螢光素酶的過氧化物酶體基質序列；SKL；Keller等，PNASUSA4:3264(1987))；法尼基化序列(例如，P21H-ras1；LNPPDESGPGCMSCKCVLS，黑體的半胱氨酸被法尼基化；Capon，文獻同上)；香葉基香葉基化序列(例如，蛋白質rab-5A；LTEPTQPTRNQCCSN，黑體的半胱氨酸被香葉基香葉基化；Farnsworth,PNASUSA91:11963(1994))；或破壞序列(細胞周期蛋白B1；RTALGDIGN；Klotzbucher等，EMBOJ,1:3053(1996))。在優選實施方案中，靶向序列是能影響候選翻譯產物分泌的分泌信號序列。有很多已知的分泌信號序列位於肽可變區的5』端，從肽區域上裂解下該序列可使肽分泌至胞外間隙中。分泌信號序列及其轉移至不相關的蛋白質的能力是眾所周知的，例見Silhavy等(1985)，微生物學評論，49,398-418。這對產生能結合至不是宿主細胞的靶細胞(如表達肽的細胞)表面或影響靶細胞的生理學的肽特別有用。在優選的方法中，成形的融合產物依次含有分泌信號肽-呈遞結構-隨機化表達產物區域-呈遞結構。通過這種方法，在導致表達肽文庫的細胞附近生長的靶細胞周圍含有分泌的肽。通過多種選擇方案中的任一種定位對肽的存在作出反應(例如通過肽與表面受體的結合或通過肽的內部化和與胞內靶的結合)而表現出生理學變化的靶細胞和分泌細胞，並測定導致反應的肽。例舉的反應包括設計細胞因子(即能導致造血幹細胞分裂並維持其全能性的幹細胞因子)，導致癌細胞自發性細胞凋亡的因子，與靶細胞細胞表面結合併特異性標記靶細胞的因子等的不同反應。適當的分泌序列是已知的，包括得自IL-2的信號(MYRMQLLSCIALSLALVTNS；Villinger等，免疫學雜誌，155:3946(1995))，生長激素的信號(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPT；Roskam等，核酸研究，7:30(1979))；得自前胰島素原的信號(MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN；Bell等，自然，284:26(1980))；和流感病毒HA蛋白的信號(MKAKLLVLLYAFVAGDQI；Sekiwawa等，PNAS80:3563)，在未下劃線-下劃線的連接處裂解。特別優選的分泌信號序列是分泌型細胞因子IL-4的信號前導序列，其含有IL-4的前24個胺基酸MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHG。在優選的實施方案中，融合配對物是獲救序列。獲救序列是可用於純化或分離候選藥劑或編碼候選藥劑的核酸的序列。因此，例如，肽的獲救序列包括純化序列，例如與Ni親和柱一起使用的His6標記物和用於檢測，免疫沉澱或FACS(螢光激活的細胞分選)的表位標記。適當的表位標記包括myc(與商購的9E10抗體一起使用)，細菌酶BirA,flu標記，lacZ和GST的BSP生物素化靶序列。或者，獲救序列可以是獨特的寡核苷酸序列，該序列可用作探針的靶位點以快速而容易地經由PCR，相關技術或雜交分離逆轉錄病毒構建體。在優選的實施方案中，融合配對物是賦予候選生物活性劑或其編碼核酸以穩定性的穩定序列。因此，例如，通過在起始甲硫氨酸之後摻入甘氨酸(MG或MGG0)，保護肽使其不會按照perVarshavskyN-EndRule遍在蛋白化，從而使肽穩定化，在胞質中的半壽期延長。類似地，C末端的兩個脯氨酸使肽對羧肽酶作用的抗性大大增強。脯氨酸前面存在兩個甘氨酸會增加柔性，並可防止二-脯氨酸中的結構導入事件蔓延至候選肽結構中。因此，優選的穩定序列如下MG(X)nGGPP，其中X是任何胺基酸，n是至少為4的整數。在一個實施方案中，融合配對物是二聚體化的序列。二聚體化的序列可以使一個隨機肽與另一個隨機肽非共價連接，其結合親和力足以使兩個隨機肽在正常生理條件下保持連接。如果每個細胞產生兩個肽，然後二聚體化以形成108(104×104)有效文庫的話，就可以使小的隨機肽文庫(例如104)有效地變成大的文庫。必要時也可形成較長的隨機肽，或結構更加複雜的隨機肽分子。二聚體可以是同二聚體或異二聚體。二聚體化的序列可以是自我聚集的單個序列，或者是兩個序列，每個序列在不同的逆轉錄病毒構建體中產生。即核酸編碼具有二聚體化序列1的第一個隨機肽和具有二聚體化序列2的第二個隨機肽，通過將核酸導入細胞並表達核酸，二聚體化序列1與二聚體化序列2連接形成新的隨機肽結構。適當的二聚體化序列包含多個序列。很多的蛋白質-蛋白質相互作用位點都是已知的。另外，使用標準方法，如酵母雙雜合系統，傳統的生物化學親和結合研究或甚至使用本發明的方法也可闡明二聚體化序列。只要生物學和活性允許，可將融合配對物置於結構中的任何位置處(即N末端，C末端，內部)。在優選的實施方案中，融合配對物包括PCTUS97/01019中一般性描述的接頭或限制序列，它們可以使候選藥劑與潛在的不受妨礙的靶相互作用。例如，當候選生物活性劑是肽時，有用的接頭包括甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括例如(GS)n,(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少為1的整數)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-絲氨酸聚合物和本領域技術人員已知的多種其它柔性接頭。優選甘氨酸-絲氨酸聚合物，因為這兩種胺基酸相對不成結構，因此能用作組分之間的中性限制序列。第二，絲氨酸是親水的，因此能溶解球狀甘氨酸鏈。第三，類似的鏈顯示出能有效連接重組蛋白質(如單鏈抗體)的亞單位。另外，可以使包括呈遞結構的融合配對物被修飾，隨機化和/或成熟化以改變隨機化表達產物的呈遞方向。例如，可以修飾環底部的決定簇以稍微修飾內部環的肽四級結構，而所述結構仍保持隨機化的胺基酸序列。在優選的實施方案中，使用的是融合配對物組合，因此，例如，可以使用呈遞結構，靶向序列，獲救序列和穩定序列的多種組合，同時還可以使用或不使用接頭序列。因此，候選藥劑可以包括這些組分，然後可用於產生各含有不同隨機核苷酸序列的片斷文庫，所述核苷酸序列編碼不同的肽。然後用連接產物轉化細菌，例如大腸桿菌，從所得文庫中製備DNA，例見Kitamura,PNASUSA92:9146-9150(1995)(列入本文作為參考)。將文庫DNA傳遞至逆轉錄病毒包裝系統導致其轉變為感染性病毒。適當的逆轉錄病毒包裝系統細胞系包括但不限於WO94/19478,Soneoka等，核酸研究，23(4):628(1995),Finer等，血液，83:43(1994)中所述的Bing和BOSC23細胞系；Pheonix包裝細胞系，如下文所述的PhiNX-eco和PhiNX-ampho；292T+gag-pol和逆轉錄病毒包膜；PA317；和Markowitz等，病毒學，167:400(1988),Markowitz等，病毒學雜誌，62:1120(1988),Li等，PNASUSA93:11658(1996),Kinsella等，人類基因治療，7:1405(1996)(皆列入本文作為參考)中所述的細胞系。優選系統包括PhiNX-eco和PhiNX-ampho或PCTUS97/01019中描述的類似細胞系。當細胞不在複製時，可使用其它病毒載體，包括逆轉錄病毒載體，豬免疫病毒(FIV)載體等。在優選的實施方案中，當使用病毒載體將候選藥劑導入細胞中時，候選肽藥劑與可測分子連接，本發明的方法至少包括一個表達試驗。表達試驗是測定候選生物活性劑是否表達，即細胞中是否存在候選肽藥劑的試驗。因此，通過將候選藥劑的表達與可測分子(如標記物)的表達相連接，即可測定是否存在候選肽藥劑。因此，在此實施方案中，候選藥劑與可測分子可操作相連。通常，通過產生融合核酸可實現此目的。融合核酸包括編碼候選生物活性劑的第一個核酸(它可包括上文所述的融合配對物)，和編碼可測分子的第二個核酸。術語「第一個」和「第二個」不是指相對於融合核酸的5』至3』方向的序列方向。例如，假定融合序列為5』至3』方向，第一個核酸可以位於第二個核酸的5』方向，也可以位於第二個核酸的3』方向。此實施方案中的優選的可測分子包括但不限於螢光蛋白，包括GFP,YFP,BFP和RFP，尤其優選前者。通常，在有利於藥劑-靶相互作用的反應條件下將候選藥劑加入細胞(如上文所述，加入胞外或胞內)。所述條件一般是生理條件。可在有利於最佳活性的任何溫度下進行保溫，一般為4至40℃之間。選擇保溫時間以得到最佳活性，但也可使保溫時間最優化以有利於快速的高物料流通量的篩選。一般保溫0.1至1小時就足夠了。一般應除去或洗去過量試劑。試驗中可包括多種其它試劑，其中包括鹽，中性蛋白質(如白蛋白)，去汙劑等試劑，使用這些試劑有利於最佳的蛋白質-蛋白質結合和/或降低非特異性的或背景相互作用。也可使用能改善試驗效率的試劑，如蛋白酶抑制劑，核酶抑制劑，抗微生物劑等。可以能提供所需結合的任何次序添加組分混合物。本領域技術人員知道應對細胞進行不同次數的洗滌或浸洗，其中還包括使用過濾和離心。當使用第二個標記組成成分(本文也稱之為「第二標記物」)時，優選在除去過量的非結合靶分子之後加入該成分以降低非特異性結合；然而，在某些情況下，可同時加入所有成分。在優選的實施方案中，使用螢光激活的細胞分選(FACS)分選細胞。在本發明中，通過導致背景降低和特異性更強的多個參數評價細胞周期調節。相反，過去人們使用FACS是為了同時評價兩個不同的或不相關的特徵，這樣可以鑑定具有這兩個特徵的細胞，但不能降低組合特徵的背景。因此，根據一個或多個試驗在FACS中分選或富集細胞，所述試驗包括細胞生活力試驗，增殖試驗，細胞期試驗和(當候選藥劑與可測的組成成分一起表達時)表達試驗。將一個或多個上述試驗的結果與未暴露於候選生物活性劑的細胞或導入候選藥劑之前的相同細胞相比較。這些結果的變化表示所述藥劑可調製細胞周期調節。本發明的優點是可在細胞文庫中檢測候選藥劑文庫，因為本發明的方法可以以極高的特異性分選單個細胞，從而檢測出很少發生的事件。使用多個雷射通道可使106中的分選準確率為1，準確率大於70％。另外，本發明除了可鑑定多個細胞周期調節特性外，還可以鑑定其它細胞特性。例如，通過使用表示鈣反應的染料Indo-1可測定並選擇反映細胞健康狀況的參數。本領域技術人員可常規鑑定的其它細胞參數包括但不限於細胞大小，細胞形狀，氧化還原作用狀態，DNA含量，核酸序列，染色質結構，RNA含量，總蛋白，抗原，脂質，表面蛋白，胞內受體，氧化代謝，DNA合成和降解和胞內pH。在優選的實施方案中，由單個細胞同時測定各個檢測結果，因為該細胞穿過多個雷射的光束通道，或者，可依次測定各個檢測結果。通過使用一個以上的參數檢測細胞周期調節或細胞周期調節中的變化，背景降低而特異性增加。可從不符合所需參數的細胞中物理分選出符合所需特性之參數的細胞，或者可通過該細胞在細胞群體中的百分比來鑑定該細胞。通常，優選KDs≤1μM以使FACS分選中存在的剪切力可保留結合。在優選的實施方案中，以很高的速度分選細胞，例如以大於約5,000個分選事件/秒的速度，優選以大於約10,000個分選事件/秒的速度，特別優選以大於約25,000個分選事件/秒的速度，尤其優選以大於約50,000至100,000個分選事件/秒的速度分選細胞。經刺激和染色處理的細胞一般被置於緩衝液中，並在進行細胞計數之前過濾。可使用FACSCAN(BectonDickinson公司，雷射線路488nm)或Mo-Flo(Cytomation公司，雷射線路350nM寬帶(UV),488nm和647nm)細胞計數器分析細胞。必要時可使用Mo-Flo分選細胞。當通過顯微術分析細胞時，一般將經刺激或染色後的細胞置於玻片上並蓋上蓋玻片；通過在使用標準的BFP,FITC或TRITC(例如)成套濾光片的倒置顯微鏡(即TE300,Nikon)中經明視野和螢光顯微術可直接觀察細胞。利用使用標準的FTTC和TRITC(例如)成套濾光片的倒置共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss公司，Bio-Rad公司)也可得到影像。分選導致產生具有所需特性的細胞群體。在優選的實施方案中，設置參數以鑑定至少一個可調製細胞周期調節的候選生物活性劑。在優選的實施方案中，鑑定了生物活性劑。本領域技術人員應知道如何進行鑑定，所述方法一般包括分析生物活性劑的結構，特性，結合親和力和功能。通常，一旦鑑定出生物活性劑，可重新合成該生物活性劑，並使其與靶細胞混合以在不同條件下和存在或缺乏其它多種藥劑時證實細胞周期調節的調製作用。可製備治療有效量的生物活性劑以調製細胞周期調節並與適當的藥物載體混合。在優選的實施方案中，可使細胞群體經受含和不含候選藥劑的多種實驗條件。條件的變化包括但不限於pH，溫度，緩衝液或鹽濃度等的變化。在優選的實施方案中，pH有所變化，一般是增加或降低pH，通常使pH變化約0.5至約3個pH單位。或者可改變溫度，優選將溫度增加或降低約5℃至約30℃。類似地，也可改變鹽濃度，優選將鹽濃度增加或降低約0.1M至約2M。本領域技術人員應理解本文所提供的分析步驟可以一定的次序改變。然而，也應理解儘管本文提供了多個選擇(對化合物，選定特性或步驟順序的選擇)，也可單獨提供各個選擇，並將其中的每一個選擇與本文所提供的其它選擇分開。另外，本領域顯而易見的和已知的能增加分析的敏感性的步驟也包括在本發明的範圍之內。例如，還可包括洗滌步驟，或分離步驟。另外，應懂得在某些情況下檢測在細胞中進行，但也可在培養基中進行檢測，反之亦然。在優選的實施方案中，細胞表型是胞吐，本發明的方法和組合物涉及使用FACS儀檢測胞吐的變化。可評價或分析多個參數以檢測胞吐途徑的變化，所述參數包括但不限於光散射，螢光染料攝取，螢光染料釋放，顆粒暴露，表面顆粒酶活性和顆粒特異性蛋白質的量。通過分析或測定一個或多個這些參數，不僅可以檢測胞吐的變化，還可以檢測胞吐途徑不同步驟的變化。另外，多參數分析還可以降低檢測到的背景，或「錯誤的陽性結果」。通過這種方法，可快速而準確地篩選候選藥劑以鑑定出調製胞吐的藥劑。在優選的實施方案中，本發明提供了篩選細胞群體胞吐變化的方法。對胞吐而言的「變化」或「調製」指的是與另一個細胞或不同條件下的相同細胞相比，一個細胞中的胞吐量降低或增加。可進行檢測，其中每次檢測的所有條件都相同，或在含或不含生物活性劑的不同條件下進行檢測，或在胞吐過程的不同階段進行檢測。例如，可在存在或缺乏候選生物活性劑的情況下測定細胞群體的胞吐。在另一個例子中，可在不同於其它細胞群體的條件或環境下測定某一細胞群體的胞吐。例如，可在存在或缺乏生理信號時評價細胞，所述生理信號如胞吐誘導物(即Ca++，離子黴素等)，激素，抗體，肽，抗原，細胞因子，生長因子，動作電位，或其它細胞(即細胞-細胞接觸)。在另一個例子中，在胞吐過程的不同階段測定胞吐。在另一個例子中，在相同條件下測定胞吐，所測定的變化是一個細胞或細胞群體與另一個細胞或細胞群體之間的變化。本文所述的「細胞群體」指的是上文所述的細胞樣品。在此實施方案中，優選細胞(但不是必須)快速生長，可被逆轉錄病毒感染，並可與染料和抗體相容。用於此實施方案的優選細胞類型包括但不限於肥大細胞，神經元，腎上腺嗜鉻細胞，嗜鹼性粒細胞，內分泌細胞，包括胰腺β-細胞，胰腺腺泡細胞，包括外泌細胞，嗜中性白細胞，單核細胞，淋巴細胞，乳房細胞，精細胞，卵細胞和PMN白細胞，內皮細胞，脂肪細胞和肌肉細胞。胞吐方法包括在FACS儀中通過分析至少3個特性的變化來分選細胞，所述特性選自光散射，螢光染料攝取，螢光染料釋放，顆粒暴露，表面顆粒酶活性和顆粒特異性蛋白質的量。在優選的實施方案中，由單個細胞同時測定各個檢測結果，因為該細胞穿過多個雷射的光束通道，或者，可依次測定各個檢測結果。通過使用一個以上的參數檢測胞吐或胞吐的變化，背景降低而特異性增加。可從不符合所需參數的細胞中物理分選出符合所需特性之參數的細胞，或者可通過該細胞在細胞群體中的百分比來鑑定該細胞。在優選的實施方案中，分析光散射的變化以測定細胞群體胞吐的變化。當在FACS中觀察時，通過測定其正面和90°(側面)光散射特性，細胞顯示出特殊的特徵。這些散射特性描述了細胞的大小，形狀和顆粒含量。通過用促-胞吐的刺激物激活細胞，細胞的正面和側面散射特性有相當大的改變。這些特性將測定的兩個參數計算為胞吐事件的讀數。這些特性的變化與細胞的胞吐程度成比例，也取決於胞吐事件的時程。光散射強度或細胞-折射率的變化表示相同細胞在不同時間的胞吐變化，或者與含或不含候選生物活性劑的不同條件下的相同細胞相比，或與不同細胞或細胞群體細胞相比的胞吐變化。在本文提供的一個實施方案中，將細胞群體與已知能刺激胞吐的藥劑混合併測定光散射特性。鑑定和/或分選具有表示所需胞吐活性之光散射特性的細胞。本文所用胞吐活性包括缺乏活性。在優選的實施方案中，在加入胞吐刺激物之前或加入的同時使候選生物活性劑與細胞群體混合，這一點將在下文中詳細描述。在此實施方案中，下列兩組物質之間的光散射特性有所不同a)細胞群體與已知的胞吐刺激物和候選生物活性劑混合，和b)細胞群體與已知的胞吐刺激物混合，其中缺乏候選生物活性劑，可以測定候選生物活性劑能調製胞吐。在某些情況下也需要包括胞吐抑制劑或排除胞吐刺激物以鑑定能誘導胞吐的生物活性劑。優選在測定光散射特性的同時還測定至少一個，優選為兩個可表示胞吐活性的其它特性。光散射測定的一般方法學進一步描述於Perretti等，藥學方法雜誌，23(3):187-194(1990)和Hide等，細胞生物學雜誌，123(3):585-593(1993)(皆列入本文作為參考)。通常，優選相對於基線而言變化至少約5％，更優選變化至少約25％，特別優選變化至少約50％，尤其優選變化至少約75至100％。此時的基線一般指的是細胞經胞吐刺激之前的光散射特性。在本文所提供的每種情況下，也可為任何控制參數設置基線。例如，可在測定特定細胞，不同條件下的類似細胞或胞吐過程中的特定時間點的類似細胞的胞吐時設置基線。在另一個優選的實施方案中，評價了螢光染料攝取的變化。優選的螢光染料包括苯乙烯染料，它表示相對於胞吞的胞吐活性，有時也稱作偶聯胞吞。有關偶聯胞吞的理論是經受胞吐的細胞必須也經受胞吞以維持細胞體積和膜的完整性。因此，通過胞吐刺激，胞吞也有所增加，通過確定所攝取的苯乙烯染料的量即可以間接測定胞吐。在本文提供的一個實施方案中，將細胞置於苯乙烯染料的溶液中，並用促胞吐的刺激物進行刺激，然後測定染料的量。優選在胞吐刺激之後離心細胞，抽吸並重新懸浮於新鮮的緩衝液中。在優選的實施方案中，按本文所述混合候選生物活性劑和細胞。在某些情況下，在含有胞吐抑制劑或不含促胞吐刺激物時混合候選生物活性劑和細胞。優選在細胞群體中加入促胞吐刺激物，這會顯著增加染料的螢光信號。增加的與細胞相關的信號是由苯乙烯染料的偶聯胞吞引起的，它在時間和強度上與胞吐反應成比例。相反，當胞吐被抑制或未被誘導時，信號未增加。通過測定不同時間點或不同細胞群體中的螢光，並與其它或標準的測定結果相比較即可測定變化。通常，優選相對於基線而言變化至少約50％，更優選變化至少約75％至100％，特別優選變化至少約250％，尤其優選變化至少約1000-2000％。此時基線指的是細胞在胞吐刺激之前的苯乙烯染料攝取。優選的苯乙烯染料包括但不限於FM1-43,FM4-64,FM14-68,FM2-10,FM4-84,FM1-84,FM14-27,FM14-29,FM3-25,FM3-14,FM5-55,RH414,FM6-55,FM10-75,FM1-81,FM9-49,FM4-95,FM4-59,FM9-40及其組合。諸如FM1-43的優選染料在水中僅發出微弱的螢光，但當與膜結合時可發出很強的螢光，從而使染料攝取易於分辨。適當的染料可以商購，即MolecularProbes公司，Eugene,Oregon，「螢光探針和研究用化合物手冊」，第6版，1996，尤其參見第17章，特別是第17章的第2節(包括參照的相關章節)(列入本文作為參考)。優選在溶液中提供染料，其中染料濃度約為25至1000-5000nM，優選約為50至約1000nM，特別優選約為50至250nM。苯乙烯染料的使用進一步描述於Betz等，神經生物學最新觀點，6:365-371(1996)(列入本文作為參考)。優選在測定螢光染料攝取的同時還測定至少一個，優選為兩個其它的胞吐活性指示參數。在另一個優選的實施方案中，評價螢光染料釋放的變化。本發明部分涉及發現低pH濃度的染料，該染料一般用於染色溶酶體，在低pH下也可染色胞吐顆粒。通常，這些染料可被細胞被動吸收，並在顆粒中濃縮；然而，細胞經誘導後可通過偶聯胞吞吸收染料。在優選的實施方案中，將細胞群體置於低pH濃度的染料中以使染料被細胞吸收。優選洗滌細胞。可將細胞暴露於促-胞吐的刺激物和/或抑制劑中。在優選的實施方案中，將候選生物活性劑與細胞群體混合，優選加入促-胞吐的刺激物。評價螢光。細胞之間或相同細胞在不同時間點的螢光染料釋放變化表示胞吐的變化。優選變化發生在細胞之間，最優選發生在加入了不同生物活性劑的細胞之間。優選相對於基線而言變化至少約5％，更優選變化至少約25％，特別優選變化至少約50％，尤其優選變化至少約100％。此時基線指的是刺激前細胞中的染料量。在此實施方案中，優選低pH濃度染料。這種低pH濃度染料包括但不限於丫啶橙，LYSOTRACKERTM紅，LYSOTRACKERTM綠和LYSOTRACKERTM藍。這種染料可以商購，即得自MolecularProbes，文獻同上，尤其包括第17章，第17章第4節，和參照的「相關章節」，即第23章。在優選的實施方案中，使用的是溶液形式的染料，其中染料濃度約為50nM至約25μM，優選染料濃度約為5μM至約25μM，特別優選染料濃度約為1至5μM。低pH濃度染料的使用一般描述於(關於溶酶體的研究)Haller等，細胞鈣，19(2):157-165(1996)(列入本文作為參考)。在評價螢光染料釋放之變化的另一個實施方案中，評價的是釋放至上清液中的螢光。在此實施方案中，使用能可逆標記胞吞膜的苯乙烯染料或低pH濃度染料。在此實施方案中，將細胞群體置於染料中以使細胞被動吸收染料，或通過誘導來吸收染料。然後優選洗滌細胞。可將細胞暴露於促-胞吐刺激物和/或抑制劑中，任選加入候選生物活性劑。暴露於促-胞吐刺激物中的細胞會將染料釋放至胞外介質中。可測量或檢測介質中的螢光。該方法有時被稱作使細胞脫色。任選加入能改進和便於檢測介質中的染料的試劑。例如，可形成微膠粒的去汙劑，如3-[(3-膽醯胺丙基)-二乙銨]-丙磺酸(CHAPS)能增加螢光，從而可檢測少量胞吐活性。染料釋放的變化表示相同細胞，細胞之間，最優選為加入了不同生物活性劑的細胞之間的胞吐變化。通常，優選相對於基線而言變化至少約5％，更優選變化至少約25％，特別優選變化至少約50％，尤其優選變化至少約100％。此時基線指的是胞吐刺激前染料的釋放。當測定介質中的染料釋放時，優選同時評價至少一個其它胞吐指示參數。在優選的實施方案中，測定的是顆粒暴露的變化。在胞吐過程中將顆粒暴露於介質中，即顆粒與細胞膜融合併暴露/釋放其內容物。因此，顆粒暴露是胞吐活性的指徵，它的缺乏是胞吐尚未被誘導或已被抑制的指徵。優選通過特異性結合顆粒的可測試劑檢測顆粒暴露。本文所用可測試劑的例子是膜聯蛋白V，膜聯蛋白V是顯示出以依賴於二價離子的方式特異性結合磷脂(磷脂醯絲氨酸)的蛋白質家族的成員。該蛋白質被廣泛用於測定細胞凋亡(編程性細胞死亡)，因為細胞表面露出磷脂醯絲氨酸是細胞凋亡過程的標誌性早期信號。令人驚奇地是，本文已測定當膜聯蛋白V在分泌過程中暴露於細胞表面時可特異性結合胞吐顆粒；而細胞內部的顆粒未被標記。本文使用了膜聯蛋白V的這一特性來根據其依賴於胞吐的結合產生單個胞吐分析。通過對細胞進行胞吐刺激，細胞的膜聯蛋白結合和螢光信號的增加與時間和胞吐反應的強度成正比。在此實施方案中，直接或間接標記膜聯蛋白，然後與細胞群體混合。膜聯蛋白可以商購，即購自PharMingen,SanDiego,California，或CaltagLaboratories,Millbrae,California。優選以溶液的形式提供膜聯蛋白，其中膜聯蛋白的濃度約為100ng/ml至約500ng/ml，更優選約為500ng/ml至約1μg/ml，最優選約為1μg/ml至約5μg/ml。在優選的實施方案中，直接標記膜聯蛋白，例如用諸如異硫氰酸螢光素(FITC),Alexa染料，TRITC,AMCA,APC，三-色(tri-color),Cy-5的螢光染料和本領域已知的或可商購的其它螢光染料標記膜聯蛋白。在另一個優選的實施方案中，用諸如半抗原(如生物素)的第一個標記物標記膜聯蛋白，另外還使用第二個螢光標記物，如螢光鏈黴抗生物素蛋白。本領域技術人員應理解，也可使用其它第一和第二標記對。在優選的實施方案中，使細胞經受一般會導致胞吐的條件。任選在細胞中加入候選生物活性劑。在某些情況下，需要包括胞吐抑制劑以測定候選藥劑是否能逆轉抑制，或者加入不含胞吐刺激物的候選生物活性劑以測定藥劑是否能誘導胞吐。優選洗滌細胞，並在顯微鏡或流式細胞儀中檢測螢光。膜聯蛋白結合之檢測結果的變化表示相同細胞，或不同細胞之間，在相同或不同的條件下和/或在其中加入藥劑時胞吐的變化。通常，優選相對於基線而言變化至少約25％，更優選變化至少約50％，特別優選變化至少約100％，尤其優選變化至少約500％。此時的基線一般指的是經胞吐刺激之前的膜聯蛋白結合量。在另一個優選的實施方案中，通過諸如小檗鹼或釕紅的陽離子染料檢測顆粒暴露。所述陽離子染料特異性染色分泌的顆粒。因此，當胞吐發生時，分泌的顆粒暴露在細胞表面，可檢測到螢光的增加。在優選的實施方案中，在存在或缺乏胞吐刺激物和/或抑制劑時，和任選在存在或缺乏候選生物活性劑時將陽離子染料與細胞群體混合。在特別優選的實施方案中，將小檗鹼與細胞和胞吐刺激物和候選生物活性劑混合以測定候選生物活性劑是否能調製胞吐活性。優選洗滌細胞，然後測定螢光。在優選的實施方案中，在評價陽離子染料的同時還評價至少一個其它的胞吐指示參數。本領域已知如何將染料與細胞混合。描述小檗鹼的一般方法學描述於Berlin和Enerback,Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.,73(3):256-262(1984)(列入本文作為參考)。通常，優選相對於基線而言變化至少約5％，更優選變化至少約25％，特別優選變化至少約50％，尤其優選變化至少約100％。此時的基線一般指的是刺激之前的染料量。類似地，可使用ConA-FITC，因為它以類似於本文所述的方式與顆粒蛋白質上的糖結合。在另一個優選的實施方案中，測定的是表面顆粒酶活性的變化。分泌的顆粒含有諸如蛋白酶和糖苷酶的酶，這些酶作為胞吐過程的一部分被釋放出來。由於pH值低，這些酶在顆粒內通常是無活性的，但通過暴露於生理pH下的胞外介質，這些酶可被激活。將產色或產螢光底物用作胞外介質的組分可測定這些酶的活性。這樣就可以用多種方法檢測胞吐細胞。在一個實施方案中，本文有時也稱之為基於群體的酶試驗，可以定量介質中經由產色或產螢光底物的裂解而產生的信號。即介質中可測反應產物的量與存在的酶量相關，從而與胞吐的量相關。在此實施方案中，可以檢測的是介質而不是細胞。在優選的實施方案中，在細胞中加入胞吐刺激物，任選加入候選生物活性劑。在介質中加入產色或產螢光底物，由於酶裂解了胞外底物，即可評價信號的變化。在有時也稱為「原位酶學試驗」的另一個優選實施方案中，使用了通過裂解而沉澱的產螢光底物。即通過胞吐，大量酶活性仍與細胞/顆粒相關，並可使用在活性位點沉澱的螢光底物進行觀察。例如，葡糖醛酸酶的底物，如ELF-97葡糖苷酸沉澱於胞吐細胞而不是靜息細胞上，因此，細胞顯示出增加的螢光。螢光是胞吐的直接測定結果，螢光依賴於pH，反映了胞吐酶的最適pH。該方法也提供了根據其酶分布圖區分不同的顆粒亞型的方法。在優選的實施方案中，在細胞群體中加入胞吐刺激物，然後與可測底物保溫。任選加入候選生物活性劑。洗滌細胞，然後在顯微鏡或流式細胞儀上進行觀察。優選的顆粒酶包括但不限於食糜酶(chymase)，胰蛋白酶，芳基硫酸酯酶A，β-氨基己糖苷酶，β-葡糖醛酸酶和β-D-半乳糖苷酶。底物包括ELF-97葡糖苷酸，N-乙醯基β-D-葡糖苷酸，與肽偶聯的ELF-97等，其中的很多是可以商購的，即得自MolecularProbes，文獻同上，尤其是第10章，特別是第10章第2節，和參照的「相關章節」。可測底物指的是底物含有本文詳細描述的螢光分子，或者可用特異於底物或裂解底物的螢光分子，即螢光抗體進行檢測。在優選的實施方案中，底物含有由兩個螢光蛋白，即藍色和綠色螢光蛋白(BFP和GFP)形成的可測分子和其它類似的分子。本領域已知在很靠近的位置處攜有這兩個蛋白質的GFP和BFP構建體能進行螢光共振能轉移(FRET)，即GFP的激發光譜覆蓋了BFP的發射光譜。因此，激發BFP導致GFP發射。如果在GFP和BFP之間插入蛋白酶裂解位點以形成「FRET構建體」，通過將FRET構建體暴露於能裂解構建體的活性蛋白酶，GFP和BFP分子即可分開。因此，激發GFP導致BFP發射和BFP發射的損失。在FRET構建體的兩個螢光蛋白之間插入的依賴於蛋白酶的裂解位點優選特異於顆粒特異性酶。因此，可使用FRET構建體檢測特異於FRET構建體之裂解位點的顆粒特異性蛋白酶。在此實施方案中，與細胞或介質混合的蛋白酶底物包括FRET構建體。FRET系統可以檢測裂解和非裂解狀態的可測分子，並區分這兩種分子。該系統進一步描述於Xu等，核酸研究，26(8):2034(1998)；和Miyawaki等，自然388(6645):882-887(1997)(皆列入本文作為參考)。在細胞或介質中加入的底物的量部分取決於酶的比活性及其底物，當一般約為250nM至約1mM，優選約為1μM至約100μM，特別優選約為1μM至約10μM。通常，優選相對於基線而言變化至少約5％，更優選變化至少約25％，特別優選變化至少約100％，尤其優選變化至少約1000％。此時的基線一般指的是誘導胞吐之前的底物裂解量。在優選的實施方案中，測定了顆粒特異性蛋白質的量的變化。分泌的顆粒含有蛋白質，這些蛋白質的特性使其能特異性靶向顆粒區室。通過胞吐誘導，顆粒特異性蛋白質暴露於表面，檢測該蛋白質。在優選的實施方案中，將可測的顆粒特異性蛋白質與細胞群體混合，並使其處於已知能誘導胞吐的條件之下。任選將候選生物活性劑與細胞群體和可測的顆粒特異性蛋白質混合，檢測顆粒特異性蛋白質。顆粒特異性蛋白質包括但不限於VAMP和突觸結合蛋白。顆粒特異性蛋白質的定義中還包括胞吐過程中釋放的介體，包括但不限於5-羥色胺，組胺，肝素，激素等。可用幾種方法定量顆粒蛋白質。在一個實施方案中，使用的是針對顆粒特異性蛋白質的經標記的抗體(例如螢光抗體)。在另一個實施方案中，細胞經改造後含有融合蛋白，該融合蛋白含有顆粒蛋白質和可測分子。在優選的實施方案中，在細胞中加入可測分子以進行檢測。例如，可使用直接或間接標記的抗體。優選的實施方案使用第一個標記抗體，優選的是螢光標記，另一個實施方案使用第一個和第二個標記物，例如，經標記的第二抗體。通常，此實施方案可使用特異性結合顆粒蛋白質的任何試劑或能直接或間接被標記的化合物。在優選的實施方案中，將標記物插入細胞。例如，將重組蛋白質導入細胞群體，所述蛋白質是顆粒特異性蛋白質和可測分子的融合蛋白。一般而言，通過用編碼融合蛋白的融合核酸轉化細胞可以實現此目的，所述融合蛋白含有顆粒特異性蛋白質和可測分子。本領域技術人員知道怎麼做，這取決於細胞類型。通常，對哺乳動物細胞而言，優選使用逆轉錄病毒載體和方法。通過本領域已知的方法構建融合蛋白。例如，將編碼顆粒特異性蛋白質的核酸與編碼可測分子的核酸連接。本文所述的可測分子指的是能使含有可測分子的細胞或化合物與不合有可測分子的細胞或化合物區分開的分子，即表位，有時也稱為抗原TAG，或螢光分子。優選的螢光分子包括但不限於GFP,BFP,YFP，和包括螢光素酶和β-半乳糖苷酶的酶。可製備這些構建體使得通過胞吐，顆粒內部的表位可暴露於細胞表面，然後檢測這些表位。優選表位是任何可測的肽，所述肽不是胞質膜上常見的肽，但在某些情況下，如果表位是細胞上常見的肽，即可檢測到增加，但一般不優選這種情況。在優選的實施方案中，使含有融合蛋白或可測的顆粒特異性蛋白質的細胞群體處於胞吐條件下。任選加入候選生物活性劑和/或胞吐抑制劑。優選洗滌細胞。檢測細胞上的螢光。通常，優選相對於基線而言變化至少約5％，更優選變化至少約25％，特別優選變化至少約50％，尤其優選變化至少約100％。此時的基線一般指的是刺激胞吐之前的螢光量。在本發明中，通過導致背景降低和特異性更強的多個參數評價相同的胞吐特性。相反，過去人們使用FACS是為了同時評價兩個不同的或不相關的特徵，這樣可以鑑定具有這兩個特徵的細胞，但不能降低組合特徵的背景。然而，本發明除了可鑑定多個胞吐特性之外，還可同時鑑定上述其它細胞參數。在優選的實施方案中，使細胞處於一般可導致胞吐的條件之下。促胞吐試劑包括離子黴素，Ca++，離子載體(離子黴素，AZ3187)，化合物48/80,P物質，補體C3a/C5a，胰蛋白酶，類胰蛋白酶，胰島素，白細胞介素-3，特異性的IgE，變應原，抗-IgE或抗-IgG受體抗體。本領域技術人員應知道，所提供試劑的濃度取決於化合物，一般為1皮摩爾至10μM。在某些情況下，需要將細胞與胞吐抑制劑混合。胞吐抑制劑包括但不限於Wortmannin和Genestein，以及本領域已知的其它藥劑。在優選的實施方案中，使用本發明的方法篩選能調製胞吐的候選生物活性劑。在刺激胞吐之前，之中或之後，優選在刺激胞吐之前使候選生物活性劑與細胞群體混合。在某些情況下，需要測定候選生物活性劑(本文也稱之為「候選藥劑」)對細胞的作用，所述細胞中的胞吐未被誘導或其中的胞吐被抑制。在細胞群體的外部環境中加入候選生物活性劑，或按本文所述將其導入細胞。在優選的實施方案中，與上述細胞周期試驗一樣，也使用了不同的候選生物活性劑文庫。如上所述，在細胞或細胞群體中混合或加入候選生物活性劑；如上所述，優選的實施方案利用核酸候選藥劑和融合配對物；優選使用逆轉錄病毒構建體。當候選藥劑是核酸時，可使用本領域已知的方法，如磷酸鈣，電穿孔和注射法將其導入細胞。一般在生理條件下將胞吐刺激物與細胞混合。保溫可在有利於最佳活性的任何溫度下進行，一般為4至40℃。選擇保溫時間以得到最佳活性，但也可最優化保溫時間以便於快速進行高物料流通量的篩選。如上所述，試驗中可包括多種其它試劑，按上述分選細胞。分選導致產生具有所需胞吐特性的細胞群體。在優選的實施方案中，設置參數以鑑定至少一種可調製胞吐的候選生物活性劑。在優選的實施方案中，鑑定了生物活性劑。本領域技術人員應知道如何進行鑑定，所述方法一般包括分析生物活性劑的結構，特性，結合親和力和功能。通常，一旦鑑定出生物活性劑，可重新合成該生物活性劑，並使其與靶細胞混合以在不同條件下和存在或缺乏其它多種藥劑時證實胞吐調製作用。可製備治療有效量的生物活性劑以調製胞吐並與適當的藥物載體混合。在優選的實施方案中，可使細胞群體經受含和不含候選藥劑，用或不用胞吐刺激或抑制的多種實驗條件。條件的變化包括但不限於pH，溫度，緩衝液或鹽濃度等的變化。在優選的實施方案中，pH有所變化，一般是增加或降低pH，通常使pH變化約0.5至約3個pH單位。或者可改變溫度，優選將溫度增加或降低約5℃至約30℃。類似地，也可改變鹽濃度，優選將鹽濃度增加或降低約0.1M至約2M。在優選的實施方案中，被調製的細胞表型是小分子(或其它候選藥劑)的毒性。所述毒性在上文所述的細胞生活力試驗中有所描述。通過將細胞與最大的功能反應相比較，然後回過頭來看是否有更大或更小的毒性與那些細胞相關也可以比較小分子劑量反應。在優選的實施方案中，細胞表型包括細胞表面受體的表達或活性；可同時跟蹤16個，優選為6個細胞表面標記。可通過直接和間接綴合的抗體檢測任何特定細胞表面標記的存在或缺乏，所述抗體針對的是任何細胞表面蛋白質，其細胞表面表達反映了與所研究細胞相關的重要功能參數。可針對單個或多個標記檢測候選藥劑，如小分子的效果。在優選的實施方案中，細胞表型包括酶的表達或活性，例如基於螢光的報導系統，該報導系統可報導與主要的檢測同時發生或身為主要檢測之結果的生物事件。該報導系統可以是在胞質中具有活性的上遊信號轉導途徑的讀數，或者是核仁轉錄或翻譯事件的讀數，以及從核或細胞中輸出事件的讀數。在優選的實施方案中，細胞表型包括蛋白質-蛋白質相互作用(或其它結合配體之間的相互作用)，如二聚體化，所述相互作用可被候選藥劑破壞。通過兩個經標記的結合配體之間FRET的出現或消失可測定這些事件。下列實施例更完整地描述了使用上述發明的方式，並闡明了實施本發明之不同方面的最佳模式。應理解提供這些實施例只是為了闡明本發明，而不以任何方式限制本發明真正的範圍。本文提及的所有參考文獻都全文列入本文作為參考。實施例1使用p21作為陽性對照的細胞周期分析材料和方法載體構建用覆蓋起始甲硫氨酸(5』-GATCGGATCCACCACCATGGGCTCAGAACCGGCTGGGGATGTC)和C-末端(5』-GATCCCAATTTAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGTTTG)的上遊引物，通過PCR由JurkatcDNA克隆p21基因的編碼區。將單一PCR產物通過引物中的旁側BstX1位點定向克隆到CRU5-GFP逆轉錄病毒載體(Rigel公司)中。得到的構建體，CRU5-GFP-p21F(圖1)，編碼與位置2插入一個Gly，C-末端具有FLAG-表位的人p21蛋白質融合(讀框內)的GFP。將p21的C-末端24個胺基酸通過PCR引物中的旁側BstX1位點克隆到GRU5-GFP逆轉錄病毒載體(Rigel公司)中，所述PCR引物為5′GATCCCACCACCATGGGCAAACGGCGGCAGACCAGCATGACAGATTTCTACCACTCCAAACGCCGGCTGATCTTCTCCAA；5′GATCCCAATTTAAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGTTTG.得到的構建體，CRU5-GFPp21C(圖1)，編碼讀框內融合KRRQTSMTDFYHSRRLIFSKRKP和C-末端融合FLAG-表位的GFP。將具有三個丙氨酸突變的p21的C-端24個胺基酸通過PCR引物中的旁側BstX1位點克隆到CRU5-GFP逆轉錄病毒載體中，所述PCR引物為5′ATCGGATCCACCACCATGGGCAAACGGCGGCAGACCAGCGCCACAGCTGCCTACCACTCC；5′GATCCCAATTTAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGTTTG.得到的構建體，CRU5-GFPp21Cmut(圖1)，編碼讀框內融合KRRQTSATAAYHSRRLIFSKRKP(突變用下劃線標出)和C-末端融合FLAG-表位的GFP。逆轉錄病毒的轉導將PhoenixE細胞以每1.5ml完全-DMEM(DMEM+10％FBS+Pen/Strep)106個細胞的濃度在6-孔培養板中鋪板，在37℃保溫16小時。於37℃，在存在50μM氯喹的條件下，用CRU5-IRES-GFP載體或CRU5-p21F-IRES-GFP克隆進行CaCl2-沉澱傳染(2μlDNA(1μg/μl),30.5μl2MCaCl2,217.5μlH2O,0.5ml2×HBS)8小時。除去轉染培養基，加入2ml完全-DMEM，使細胞於37℃進一步培養16小時。將培養基換成1.5ml完全RPMI(RPMI+10％FBS+Pen/Strep)，於32℃培養48小時。過濾(0.45μm)轉染培養板的病毒上清液，轉移到6-孔培養板中。將表達親嗜性受體(JurkatE)的JurkatT-細胞的100μl等分試樣(5×106個細胞)加入各孔。加入終濃度為5μg/ml的Polybrene。用石蠟膜密封培養板，於32℃,2500RPM下離心90分鐘。除去石蠟膜，使培養板在37℃保溫過夜。16小時後將培養基換成4ml完全-RPMI，於37℃保溫72小時。細胞周期FACS-分析沉澱逆轉錄病毒載體-轉導的細胞，以106個細胞/ml在完全-RPMI中重懸浮。將一體積(1ml)4μMPKH26細胞示蹤染料(Sigma)加入細胞，在25℃保溫5分鐘。將懸浮液稀釋5倍，在25℃,400×g下沉澱細胞10分鐘。用6ml完全RPMI進一步洗滌細胞兩次，以3×105個細胞/ml在6-孔培養板中保溫72小時。沉澱標記細胞，以106個細胞/ml在含有5μg/mlHoechst33342(MolecularProbes)的完全-RPMI中重懸浮，於37℃保溫2小時。沉澱被染色的細胞，以＞106個細胞/ml的濃度重懸浮於FACS緩衝液(PBS/0.5％FCS/5μg/mlHoechst33342)。將細胞在裝備有三束雷射的MoFlo細胞計數儀(Cytomation)上進行流式細胞計數分析。用488nm-系氬雷射激發正面和側面散射，用正面散射檢測儀和488nm帶通濾波器收集散射光。用488nm-系氬雷射激發GFP，通過530nm-帶通濾波器收集發射光。用533nm-系HeNe-雷射激發PKH26細胞示蹤染料，通過570nm-帶通濾波器收集發射光。用UV-光激發Hoechst33342染料，通過450nm-帶通濾波器收集發射光。結果用編碼與GFP融合的人p21(Gp21)，或與PCNA結合的C-末端的24個胺基酸(Gp21C)(圖1)的逆轉錄病毒載體轉導JurkatT-細胞。將p21C-端24個胺基酸的非-PCNA結合突變型(Gp21Cmut,Cayrol等，癌基因16:311(1998))用作陰性對照。轉導的p21的表達可以通過用FLAG-表位進行Western印跡(未顯示)與內源性蛋白質區別開來。據報導，在FACS中通過GFP螢光發現融合蛋白的表達(圖2B)。用細胞示蹤化合物，pkh26脈衝標記轉導細胞，其可通過選擇性分配(partioning)將帶紅色螢光的脂肪性分子摻入細胞膜中，使細胞周期和螢光強度之間存在相關性停滯細胞保持細胞示蹤染料的光亮，處於細胞周期中的細胞稀釋了信號變得暗淡。如圖2C所示，控制GFP的活GFP-p21-表達細胞，證明比表達顯著GFP水平的載體轉導細胞(指示細胞周期被抑制)具有較強的紅色螢光。在Gp21C表達細胞中看到類似作用，然而，Gp21-Cmut與非表達細胞相同。相同GFP-控制細胞的DNA含量如圖2D所示。Gp21表達細胞在細胞周期的G1期被抑制，Gp21C-表達細胞表明G1和G2關卡累積，這與以前的結果一致(WadeHarper，等，1993；Cayrol等，1998)。Gp21Cmut表達細胞表現正常的細胞周期分布。活的、被抑制的表達細胞(滿足三個初始參數)按照DNA含量分成獨立區段左偏斜，G1；右偏斜，G2。實施例2基於群體的胞吐酶活性檢測材料所有化學試劑均得自SigmaChemical公司。染料和葡糖苷酸得自MolecularProbes公司。細胞系MC-9和RBL-2H3得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。細胞培養試劑得自FisherScientific，分子生物學試劑得自Clontech公司。細胞培養將MC-9細胞在裝有加L-精氨酸(116mg/ml)，L-天冬氨酸(36mg/ml)，丙酮酸鈉(1mM)，非必需胺基酸(0.1mM)，葉酸(6mg/ml)，2-巰基乙醇(0.05mM)，L-穀氨醯胺(2mM)，熱滅活胎牛血清(10％)的DMEM，和10％T-stim條件培養基(CollaborativeResearch,Inc.)的搖瓶中作為懸浮培養物維持培養。維持細胞密度在0.25和2×106/ml。在通過錐蟲藍排除法確定細胞存活率大於95％的細胞上進行實驗。使RBL-2H3細胞在裝有加2mML-穀氨醯胺和Earl＇sBSS,15％熱滅活胎牛血清的EaglesMEM培養基的未塗布(被處理的組織培養物)搖瓶中作為粘附培養物維持生長。傳代細胞(0.05％胰蛋白酶)，以使它們保持一天以上不凝聚。胞吐刺激方案在由NaCl(137mM),KCl(2.7mM),CaCl2(1.8mM),MgCl2(1mM)，葡萄糖(5.6mM),Hepes(20mM,pH7.4)，和牛血清白蛋白(0.1％)組成的改進tyrodes緩衝液(MT)中進行實驗。在400×g下離心MC-9cells，對培養基進行抽吸。然後用MT清洗細胞，再離心/抽吸，以5×106個細胞/ml的密度分散於MT中。然後用DMSO或離子載體處理細胞30分鐘(或者如果是一個耗時過程則調整時間)。然後使細胞沉澱，收集的上清液用於酶分析；在某些情況下，之後對細胞進行流式細胞計數。所有刺激均在37℃進行。對RBL-2H3細胞的刺激則在MT中洗滌粘附細胞一次，然後加入含有刺激物的保溫MT(1ml/106個細胞)中進行。細胞在37℃保溫30分鐘，收穫上清液進行進一步的分析。在某些實施例中(實施例4-6)，染色培養板結合細胞中的膜聯蛋白，然後用No-Zyme(CollaborativeResearch公司)從搖瓶中分離出來，用於進一步的流式細胞計數。為了刺激與抗原交聯的RBL-2H3細胞，將細胞與完全培養基中的濃度為50ng/ml的IgE抗-DNP(SigmaChemical公司)一同保溫過夜。第二天用MT洗滌一次，如上述進行刺激，除了用100ng/ml偶聯於DNP的牛血清白蛋白作為刺激物。基於群體的酶分析對細胞上清液和沉澱進行酶分析，然後進行胞吐刺激刺激後收穫細胞上清液，在冰面上冷卻，加速5000×g離心，收集上清液進行酶活性分析。同樣，收集細胞沉澱，在含0.1％tritonX-100的MT中使細胞溶解，加速5000×g離心，收集上清液進行酶活性分析。對於每次分析，將100μl細胞溶解液或上清液與100μl含2mM底物(4-甲基傘形酮基(methylumbelliferyl)β-D葡糖苷酸[葡糖醛酸酶底物]or4-甲基傘形酮基N-乙醯β-D氨基葡糖苷[氨基己糖苷酶底物]的反應緩衝液(40mM檸檬酸鹽，pH4.5)在純黑色96孔培養板(Costar公司)上混合，在37℃保溫15分鐘。在螢光培養板讀數儀(Wallac,Inc.)上用激發380nm/發散440nm濾波器每3分鐘記錄培養板一次，共記錄5次，得到酶解速率；分析重複三次。流式細胞計數將經刺激和染色的細胞懸浮於冰面上的MT中，通過100μm濾器過濾，然後進行細胞計數。用FACSCAN(BectonDickinson公司，雷射線458nm)或Mo-Flo(Cytomation公司，雷射線350nM寬帶(UV),488nm，和647nm)細胞計數儀分析細胞。分選細胞，必要時使用Mo-Flo。結果結果如圖4所示。測定各種條件下MC9(A)和RBL2H3(B)細胞上清液中的酶活性。A)MC-9細胞在存在DMSO(-)或2μm離子黴素(+)的條件下刺激30分鐘。收集上清液，分析葡糖醛酸酶和氨基己糖苷酶活性。經刺激後顆粒釋放的酶活性是明顯的。B)用不同量的IgE抗-DNP使RBL-2H3細胞致敏16小時，暴露於增加量的抗原BSA-DNP刺激胞吐。在測定的上清液氨基己糖苷酶活性中抗體和抗原的劑量反應是明顯的。實施例3肥大細胞胞吐光散射變化如實施例2的描述製備細胞，測定光散射特性。結果結果如圖4所示。RBL-2H3細胞(A、D)和MC-9細胞(B、C、E、F)的流式細胞計數觀察到的光散射變化(側面散射對正面散射)被描繪成雙變量直方圖。用離子載體A23187(0.5μg/ml)刺激細胞，在不同時間點觀察。時間依賴型散射變化是明顯的，這兩個細胞系在前10分鐘內均發生顯著改變，代表這些細胞中的大塊胞吐物。實施例4在FACS中用苯乙烯染料檢測肥大細胞胞吐苯乙烯染料染色如上述製備細胞。將苯乙烯染料(FM143orFM4-64；MolecularProbes公司)在MT中稀釋到終濃度為250nM，然後加入刺激緩衝液(參見實施例2)。完成刺激後，使細胞沉澱下來，抽吸並重懸浮於新鮮的冰冷MT中。然後準備對細胞進行流式細胞計數分析(參見實施例2)。結果結果如圖6所示。在存在FM4-64(A,B)或FM1-43(C,D,E)的條件下刺激MC-9細胞(藍色=DMSO，紅色=2μM離子黴素)。A)FM4-64標記細胞在流式細胞儀的1號螢光信道中檢測。B)FM4-64標記細胞在流式細胞儀的3號信道中檢測。C)FM1-43標記細胞在流式細胞儀的1號信道中檢測。D)FM1-43標記細胞在流式細胞儀的3號信道中檢測。用這兩種染料進行的刺激依賴性螢光密度增加是明顯的FM4-64大多數向紅移，主要在3號信道中檢測，而FM1-43表現更廣泛的螢光，在1號和3號中均可檢測。E)MC-9細胞與不同劑量的PI-3激酶抑制劑渥曼青黴素(1μM-柱1,100nM-柱2,10nM-柱3，和0nM-柱1和2)預保溫，然後在存在FM1-43的情況下，用A23187(0.5μg/ml，柱1-4)或DMSO(柱5)刺激。在流式細胞儀螢光信道1中檢測到的平均信道移動被描繪成直方圖。渥曼青黴素，一種已知的肥大細胞胞吐抑制劑，導致FM1-43信號的劑量依賴性降低，說明FM1-43信號反映了MC-9肥大細胞系的脫粒程度。實施例5在FACS中通過膜聯蛋白-V染色檢測肥大細胞胞吐材料膜聯蛋白-V生物素，膜聯蛋白-VFITC和鏈黴抗生物素蛋白APC從CaltagLaboratories得到。可以應用其它實施例，特別是實施例2的其它材料和方法。膜聯蛋白-V染色經胞吐刺激後的細胞用MT以1/100稀釋的膜聯蛋白-PITC在室溫下染色10分鐘。然後用MT清洗細胞一次，懸浮於MT中，然後在流式細胞儀中或顯微鏡下觀察。對於間接標記，在刺激過程中向MT中加入稀釋度為1/200的膜聯蛋白-生物素。然後在冰冷的MT中沉澱細胞，離心，抽吸、然後懸浮於含有稀釋度為1/200抗生蛋白鏈菌素-APC的冰冷MT中，在冰面上保持15分鐘。沉澱細胞，抽吸鏈黴抗生物素蛋白-APC之後，將細胞重懸浮於MT，在流式細胞儀中觀察。在一些實驗中，應用不同的第二步，例如鏈黴抗生物素蛋白-alexa488或594(MolecularProbes公司)，用於在顯微鏡下觀察。結果結果如圖7所示。用DMSO(圖A和B)或2μm離子黴素(圖C和D)刺激MC-9細胞，然後用碘化丙錠[PI](圖A和C)和膜聯蛋白-V-FITC(圖B和D)染色。正如胞吐細胞中PI染色無顯著增強所證實，用該劑量離心黴素刺激不能損害細胞質膜。與圖D和B比較可以看出脫粒導致膜聯蛋白的結合顯著增強。實施例6經共聚焦顯微鏡檢觀察膜聯蛋白-V-FITC染色的MC-9細胞的胞吐顆粒顯微鏡檢將刺激或染色後的細胞置於載玻片上並蓋上蓋玻片；採用標準的BFP,FITC或TRITC濾光片的倒置顯微鏡(TE300,Nikon)直接經亮視野和螢光顯微鏡檢觀察這些細胞。採用標準FITC和TRITC濾光片的倒置共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss,Inc.,Bio-Rad,Inc.)獲得了某些圖象。結果用2μm離子黴素或DMSO刺激MC-9細胞並用膜聯蛋白-V-FITC將其染色，製片進行共聚焦顯微鏡檢(未顯示數據)。所有活的未激活細胞均顯示出低的膜聯蛋白結合，沒有細胞表面顆粒著色。實施例7在用抗原交聯刺激的RBL-2H3細胞中用膜聯蛋白-V-FITC染色胞吐顆粒除非以下另有說明，用於本實施例的方法同前。結果用IgE致敏RBL-2H3細胞，並用MT緩衝液或BSA-DNP抗原(100ng/ml)刺激細胞使其進行胞吐，然後用膜聯蛋白V-FITC染色。在用抗原刺激過的細胞中有很多細胞表面顆粒著色，與MC9-細胞中見到的情形類似。活的未激活細胞顯示出細微的膜聯蛋白V著色(未顯示數據)。實施例8在FACS目測到的胞吐細胞的原位酶學原位酶學如上所述刺激MC-9cells進行胞吐，然後於370C在含有底物ELF-97葡糖苷酸(250(M)的酶底物緩衝液(BSA無MT,pH4.3-7.4)中溫育15分鐘。將細胞在MT中洗一次，然後在顯微鏡或流式細胞儀中觀察。其他方法在前面的實施例中已有描述。結果結果示於圖8。用DMSO(圖A)或A3187(0.5(g/ml-圖B和C)刺激MC-9細胞然後染色檢測原位葡萄糖醛酸酶活性。A)ELF-97檢測的流式細胞儀直方圖指示細胞表面酶的沉澱。在DMSO處理的細胞中信號非常低。B)ELF-97檢測的流式細胞儀直方圖指示細胞表面酶的沉澱。在用離子載體刺激分泌作用時可見信號顯著升高。C)細胞表面酶活的pH曲線。用在不同pH製備的MT緩衝液做流式細胞儀中信號的pH曲線。條形圖代表觀察到的最大信號(用流式細胞儀中平均信道移位來衡量)的百分比。酶活是pH依賴性的，在pH6以下有一個峰；這與由酸性分泌顆粒得到的酶活一致。實施例9胞吐時從肥大細胞顆粒中釋放LysotrackerGreen並可經FACS檢測Lysotracker染料染色通過將細胞在完全培養基中稀釋至終濃度1(M並於370C在有lysotracker染料(藍、綠和紅色)的情況下將細胞保溫60分鐘以便使染料填充到細胞中。填充後，在MT中將細胞洗兩次，以待進一步分析或刺激。其他方法在前面的實施例中已有描述。結果結果示於圖9。MC-9細胞用Lysotrackergreen填充1小時，然後用DMSO或離子黴素(2(M)刺激，在流式細胞儀中觀察。所示為1道中檢測到的螢光強度直方圖；與DMSO對照相比，離子載體刺激的樣品中信號顯著缺損，這反映出從分泌顆粒中釋放出了lysotrackergreen染料。實施例10多參數分析-LysotrackerGreen、膜聯蛋白-V-APC、正面和側面散射除非以下另有描述，使用在前實施例中描述的方法。結果結果示於圖10。用不同劑量的離子黴素(0(M-A.E；1(M-B、F；2(M-C、G；和3(M-D、H)處理MC-9細胞，在流式細胞儀中同時用四種參數觀察。細胞用lysotrackergreen填充1小時，然後進行刺激並用膜聯蛋白-VAPC染色。圖A-D側面對正面光散射的雙變量直方圖。注意從左至右隨著正面散射的增高和側面散射降低，兩個參數均有劑量依賴性變化。圖E-H膜聯蛋白-VAPC對Lysotrackergreen信號的雙變量直方圖。隨著胞吐增加(從左至右)膜聯蛋白信號變大，而lysotracker信號降低。這反映出暴露到胞外環境時，膜聯蛋白V結合到細胞表面顆粒上，而lysotracker從這些顆粒上釋放。實施例11多參數分析-FM1-43、膜聯蛋白-V-APC、正面和側面散射除非以下另有說明，此處使用上面描述的方法。結果用DMSO或離子黴素(2(M)處理MC-9cells，在流式細胞儀中同時用四種參數觀察。在有FM143的情況下刺激細胞，並用膜聯蛋白-V-APC染色(數據未顯示)。在30分鐘的時間點，兩個參數中均有刺激依賴性變化。兩種信號均有刺激依賴性變化。所述變化反映出膜聯蛋白-V結合到細胞表面顆粒上，同時發生的FM143染料胞吞到MC9細胞中。實施例12與基於群體的酶讀數相關聯的FACS的同步多參數測量鈣信號檢測MC-9或RBL-2H3細胞在MT中洗一次，於370C在MT中填充Ca++敏感性探針Fluo-3(1(M,MolecularProbes公司)20分鐘。將細胞在溫MT中洗一次，然後用上面描述的方案刺激。用流式細胞儀(見下文)、螢光顯微鏡或者在螢光板閱讀器(Wallac,Inc.)上讀出來以目測胞內Ca++濃度升高所形成的信號。用含有0.1％tritonⅩ-100的MT釋放胞內染料來確定細胞填充情況。除非以下另有說明，此處採用上面描述的方法。結果結果示於圖11。在有FM143的情況下如以上方法的描述刺激MC-9細胞，並用膜聯蛋白-V-APC染色。離子黴素刺激後，在各時間點將細胞置冰上，經流式細胞儀分析或者測酶活(細胞上清液)。將正面散射、FM143、膜聯蛋白-V-APC以及氨基己糖苷酶等參數相對每個參數最大反應來繪製圖形。對於鈣信號，單獨一試管細胞填充Fluo-3，並進行相同的操作。基於細胞儀的參數的時程表明它們與通過氨基己糖苷酶釋放測量到的胞吐相關性很好。在本實施例中，正面散射顯示出隨時間即有正態變化又有負變的效果。實施例12VAMP-GFP和VAMP-FRET構建體的表達cDNA構建體VAMP-GFP構建體將大鼠VAMP-2cDNA(得自R.Scheller,StanfordUniversity)作PCR修飾以便導入(1)分別編碼有助於表達和體內穩定性的共有Kozaka序列和甘氨酸插入(a.a.2)的5』BstⅪ位點；(2)3』末端具有BamHⅠ位點的絲氨酸-甘氨酸接頭。對得自CdimGFP(Clontech公司)的GFP編碼序列進行PCR修飾以導入編碼終止密碼子的3』BstⅪ位點。通過絲氨酸-甘氨酸接頭中的共有的BamHⅠ位點連接經修飾的rVAMP和GFPPCR片斷以產生具有下列序列的框內融合蛋白，從而構建VAMP-GFP融合蛋白MGSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFSTGSGSGSGSGSGPVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ下劃線的是VAMP序列，斜體的是絲氨酸-甘氨酸接頭，規範的字母表示GFP序列。將VAMP-GFP融合序列克隆至具有定向BstⅪ位點的96.7逆轉錄病毒載體以產生pVG。通過測定兩個方向上的序列來驗證序列。通過Western分析和螢光顯微鏡檢證實轉染和感染細胞中的適當表達。Trp-FRET構建體對得自cGFP(Clontech公司)的GFP編碼序列進行PCR修飾以產生(1)分別編碼有助於表達和體內穩定性的共有Kozaka序列和甘氨酸插入(a.a.2)的5』BstⅪ位點；(2)編碼C末端之Ala228的3』末端SacⅡ位點。對得自cBFP(Clontech公司)的BFP編碼序列進行PCR修飾以產生(1)編碼Ser2的5』BamHⅠ位點；(2)編碼終止密碼子的3』末端BstⅪ。使用編碼Ⅹ因子和類胰蛋白酶蛋白酶裂解位點的SacⅡ-BamHⅠ轉變接頭(其側翼為GSGS間隔序列(GSGSIEGRLRKQGSCS))融合GFP和BFP以產生具有下列序列的框內融合蛋白MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGSGSIEGRLRKQGSGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ下劃線的是GFP序列，斜體的是Ⅹ因子/類胰蛋白酶位點接頭，規範的字母是BEP序列。將VAMP-GFP融合序列克隆至逆轉錄病毒載體96.7的BamHⅠ和BstⅪ位點以產生pGX/TB。通過測定兩個方向上的序列來驗證序列。通過Western分析和螢光顯微鏡檢證實轉染和感染細胞中的適當表達。對VAMP-GFP編碼序列進行PCR修飾以產生編碼C末端之Ala228的3』末端SacⅡ位點。用XhoⅠ和SacⅡ裂解此片斷並克隆至pGX/TB的XhoⅠ/SacⅡ位點以產生pVGX/TB(Trp-FRET)，該載體編碼具有下列序列的rVAMP-2-BFP-Ⅹ因子/類胰蛋白酶位點-GFP融合蛋白GSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEWDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFSTGSGSGSGSGSGPVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGFGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGSGSIEGRRKLQGSGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKIFCTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDEL下劃線的是VAMP序列，斜體的是絲氨酸-甘氨酸接頭，黑體的是Ⅹ因子/類胰蛋白酶位點接頭，規範字母表示的是GFP和BFP序列。通過測定兩個方向上的序列來驗證rVAMP-2-BFP-Ⅹ因子/類胰蛋白酶位點-GFP融合蛋白的序列。通過Western分析和螢光顯微鏡檢和FACS分析證實轉染和感染細胞中的適當表達。轉染和感染為了用表達Vamp構建體的重組逆轉錄病毒感染MC-9和RBL-2H3細胞，可實施下列方案，在第1天，將PhoenixE或A細胞(可得自G.Nolan,Stanford大學)以8×10E5細胞/1.5ml培養基(DMEM,10％FBS)的濃度鋪於6孔培養板中。第2天，在50(M氯喹存在下使用磷酸鈣沉澱法將5微克DNA轉染至細胞中。37℃將沉澱物與細胞保溫8小時，每次需除去培養基，用新鮮培養基洗滌一次，並更換新鮮的MC-9或RBL-2H3培養基；然後將細胞置於32℃保溫48至72小時。以1000×g的轉速將Phoenix細胞的上清液(病毒上清液)離心10分鐘，加入魚精蛋白硫酸鹽至終濃度為5(g/ml；將該上清液加入6孔培養板中經新鮮胰蛋白酶消化的MC-9或RBL-2HS細胞中(5×10E5細胞/孔)，室溫下，以1000×g的轉速將混合物離心90分鐘。然後將細胞置於32℃保溫16小時。除去病毒上清液，加入新鮮培養基；在感染後24小時觀察到靶基因的表達。權利要求1．篩選能改變細胞表型的生物活性劑的方法，所述方法包括a)使至少一種候選生物活性劑與細胞群體混合；和b)在FACS儀中通過在至少5個細胞參數的基礎上分離所述細胞以分選所述細胞。2．根據權利要求1的方法，其中使候選生物活性劑文庫與所述細胞群體混合。3．篩選能改變細胞表型的生物活性劑的方法，所述方法包括a)將各編碼候選生物活性劑的核酸文庫導入細胞群體；和b)在FACS儀中通過在至少3個細胞參數的基礎上分離所述細胞以分選所述細胞。4．根據權利要求3的方法，其中所述文庫是逆轉錄病毒文庫。5．根據權利要求3或4的方法，其中所述細胞表型是胞吐，所述細胞參數選自光散射，螢光染料攝取，螢光染料釋放，膜聯蛋白顆粒結合，表面顆粒酶活性和顆粒特異性蛋白質的量。6．根據權利要求5的方法，其進一步包括使所述細胞處於一般會導致胞吐的條件下。7．根據權利要求3或4的方法，其中所述細胞表型是細胞周期調節，所述細胞參數包括細胞生活力，增殖和細胞期。8．根據權利要求3,4,5,6或7的方法，其中所述核酸包括融合核酸，該融合核酸含有a)編碼所述候選生物活性劑的所述核酸；和b)可測的組成成分。9．根據權利要求1,2,3,4,5,6,7或8的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。10．根據權利要求8的方法，其中所述可測的組成成分是螢光蛋白。全文摘要本發明涉及通過使用多參數分析和螢光－激活的細胞分選(FACS)儀檢測細胞或細胞群體中的細胞周期調節變化和篩選能調製細胞周期調節之藥劑的新方法。文檔編號C12Q1/70GK1304489SQ99807090公開日2001年7月18日申請日期1999年4月16日優先權日1998年4月17日發明者J·費舍爾,J·勞倫斯,D·帕嚴,A·羅西申請人:裡格爾製藥公司