含有貴金屬微粒的藥品的製作方法
2023-07-12 20:55:21 2
專利名稱：含有貴金屬微粒的藥品的製作方法
技術領域：
本發明涉及含貴金屬微粒，預防及/或治療肌肉萎縮性側索硬化症等神經變性疾病、風溼性疾病、局部缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂的藥品。
背景技術：
肌肉萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis下面在本發明的說明書中有時簡略為「ALS」)是從大腦皮層到脊髓的上位運動神經元及從脊髓到肌肉的下位運動神經元，選擇性紊亂的進行性神經變性疾病。ALS的發病率高，在日本也有許多患者。臨床特徵是肌肉萎縮和肌力下降，病情一旦發展，因肌力下降，會發生語言障礙、吞咽障礙、呼吸障礙等。病勢進展比較迅速，若不用人工呼吸器等，許多人維持2～4年就會死亡。但是由於ALS沒有根治的辦法，因此，關於這種疾病，包括對患者的護理，成為社會性的大問題。ALS從其發病的形態上分為獨發性和家族性兩種。大家知道家族性的ALS有顯性和隱性遺傳性。近年來，作為顯性遺傳性ALS1型的起源基因，被鑑定出活性氧的代謝酶Cu/Zn Superoxide Dismutase(銅·鋅超氧化歧化酶；SOD1)。ALS的大多數是獨發性的，遺傳性的不到20％。由於ALS1佔全部ALS中的比例為2％以下，所以在弄清ALS發病的分子機構和治療法的開發方面期待著發現SOD1基因之外的ALS起源基因。然而作為採取隱性遺傳形式的ALS2型的起源基因，又被分離、鑑定出ALS2CR6基因。而在關於ALS等神經變性疾病中，活性氧發生的機理方面，因變種等變異的蛋白凝集，而引起活性氧發生的學說是有權威的(Current Topic in Medical Chemistry 1507-517，2001)。
對於ALS尚未確立包括藥物治療在內的根本治療法。藥物中使ALS延緩發展的藥劑，被採用的是利魯唑(リルテツク)，除此之外還採用了肌肉馳緩劑、鎮痛劑、鎮定藥、安眠藥、維生素B劑等，但全都只不過是針對症狀的藥物療法。
風溼病是以因結締組織炎症、變性或代謝紊亂造成的種種異常為特徵的疾病，是關節、肌肉、骨骼、韌帶等運動器官受損，伴有疼痛和僵硬的疾病。典型的風溼病是類風溼性關節炎，由於全身的結締組織變化引起膠原病的全身性紅斑狼瘡(SLE)和自體免疫疾病也包含在風溼病之內。
對於類風溼性關節炎(RA)沒有根治的辦法，憑經驗進行對症治療。治療方法除了藥物治療之外，進行基礎治療(休養、患者教育及理療等)、手術治療等。但治療原則是藥物治療。作為藥物治療，為了抑制因RA引起的滑膜炎，減輕疼痛而廣泛應用阿斯匹林、消炎痛、雙氯芬酸等非甾體性消炎藥(NSAID)。但在重病例中也有使用強的松龍等甾體劑的情形。另外，為了改正RA的免疫異常而延緩骨骼損傷的進程，經常使用抗風溼藥。抗風溼藥，例如使用金製劑(金蘋果酸鈉和金諾芬等)和甲氨喋呤等免疫抑制劑。
由於心臟的冠狀動脈粥樣硬化等引起血管狹窄或閉塞，因冠狀動脈血流減少引起心功能失調，叫作由心肌缺血狀態導致的缺血性心臟病。具有代表性的缺血性心臟病是心絞痛及心肌梗塞。心肌梗塞是因血栓造成持續缺血而引起心肌壞死，有時甚至至死。比較輕的一時性的心絞痛則在發作時發生劇烈的胸痛。
心絞痛的藥物治療使用亞硝酸異戊酯、硝酸甘油、硝酸異山梨醇等亞硝酸劑、β阻斷劑、鈣拮抗劑、潘生丁等冠狀動脈舒張劑。對於心肌梗塞，急性期使用末梢血管擴張劑、尿激酶等血栓溶解劑、肝素鈉等血液凝固阻止劑、阿斯匹林和噻氯匹定等抗血小板劑等。但是特別在心肌梗塞的急性期尚未提供能有效抑制心肌壞死的藥劑。
另外，就應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂病，也進行了應用種種藥品的嘗試，但是幾乎不能提供可以有滿意治療效果的藥品，而期待著開發新的藥品。
另一方面，大家知道鉑膠體分解活性氧的一種過氧化氫(特開平10-68008號公報，0040段)。可是，在此公報中並沒有表明鉑膠體在治療及/或預防ALS等神經變性疾病、風溼性疾病、缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化或高血脂方面的有效性。
發明內容
本發明的目的是提供一種預防及/或治療ALS和阿耳茨海默病(早老性痴呆)等神經變性疾病、類風溼性關節炎等風溼性疾病、心肌梗塞等缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂的藥品。本發明者們銳意研究的結果，發現給與鉑膠體等金屬膠體可以預防及/或治療上述各種疾病。本發明是在上述想法的基礎上完成的。
也就是說，本發明提供預防及/或治療選自神經變性疾病、風溼性疾病、缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂病的藥品，含有貴金屬或貴金屬的合金微粒作為有效成分。
由上述發明優選，提供神經變性疾病例如肌肉萎縮性側索硬化症、阿耳茨海默病或帕金森氏病的上述藥品；以及神經變性疾病例如肌肉萎縮性側索硬化症的上述藥品；風溼性疾病例如類風溼性關節炎的上述藥品；缺血性心臟病例如急性期的心肌梗塞的上述藥品；應激性潰瘍例如應激性胃潰瘍或應激性十二指腸潰瘍的上述藥品。
另外，由上述發明更優選，提供貴金屬為選自釕、銠、鈀及鉑的一種或兩種以上的上述藥品；貴金屬為鉑的上述藥品；貴金屬微粒平均粒徑為10nm以下鉑膠體的上述藥品。
從另一觀點，是提供預防及/或治療選自神經變性疾病、風溼性疾病、缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂病的方法，提供對包括人類在內的哺乳類動物給與貴金屬微粒的方法。而且，本發明還提供為了製造上述藥品而使用的貴金屬微粒。
圖1表示對患有肌肉萎縮性側索硬化症的試驗用小鼠，給與本發明的藥品，用紅外線傳感器測定小鼠運動量的結果示意圖。○表示正常小鼠的結果；■表示本發明的藥品給與組(0.5μg/kg)的結果；●表示非給藥組(病態小鼠)的結果。
圖2為本發明的藥品對例4中的浮腫率顯示效果的示意圖。○表示對照組(生理鹽水給與組)的結果；●表示本發明的藥品給與組(5μmol/kg/day)的結果。
圖3為本發明的藥品對例4中的骨骼損傷顯示效果的示意圖。
圖4為表示例7中用UVA(20J/cm2)照射第10天的小鼠耳廓狀態的照片。左邊表示陽性對照結果，右邊表示塗敷本發明藥品小鼠的結果。
具體實施例方式
本發明的藥品是預防及/或治療選自神經變性疾病、風溼性疾病、缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂病的藥品，其特徵是含有效成分貴金屬微粒。貴金屬種類沒有特別限制，可以使用金、釕、銠、鈀、鋨、銥或鉑的任何種類。但優選釕、銠、鈀或鉑。貴金屬微粒可以包含兩種以上的貴金屬。還可以使用至少含一種貴金屬的合金微粒，或者含有一種或兩種以上的貴金屬微粒與貴金屬之外的一種或兩種以上的金屬微粒的混合物。例如也可以使用金和鉑構成的合金。其中優選的是鉑或含鉑的合金。特別優選的是鉑。
貴金屬微粒，優選可以形成比表面積大、表面反應性優良的膠體狀態的微粒。微粒的粒徑沒有特別的限制，可使用平均粒徑為50nm以下的微粒，優選平均粒徑為20nm以下的，更優選平均粒徑為10nm以下的，特別優選平均粒徑為1～6nm左右的微粒。還可以使用更細小的微粒。
熟悉的貴金屬微粒製造方法有許多種(例如特公昭57-43125號公報、特公昭59-120249號公報，以及特開平9-225317號公報；特開平10-176207號公報、特開2001-79382號公報、特開2001-122723號公報等)，從事該行業者可以參照這些方法，容易地製造微粒。貴金屬微粒製造方法，可以利用，例如稱為沉澱法或金屬鹽還原反應法的化學方法；或者稱為燃燒法的物理方法等。作為本發明藥品的有效成分，使用哪種方法製造的微粒都可以，但是從製造的便利性和質量方面考慮，優選使用金屬鹽還原反應方法製造的微粒。
金屬鹽還原反應方法中，例如可以調製水溶性或有機溶媒可溶性貴金屬鹽溶液，或者貴金屬絡合物的水溶液或有機溶媒溶液，在此溶液中加入水溶性高分子後，把溶液的pH調節到9～11，在非活性氣氛下，經加熱回流而還原，獲得金屬微粒。貴金屬的水溶性或有機溶媒可溶性鹽的種類，沒有特別限定，例如可以使用醋酸鹽、氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽等，也可以用它們的絡合物。
金屬鹽還原反應方法中使用的水溶性高分子的種類，沒有特別限制，例如可以使用聚乙烯吡喀烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、環糊精、氨基果膠、甲基纖維素等，也可以把它們兩種以上搭配使用。可以優選使用聚乙烯吡喀烷酮，還可以更優選使用聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)。另外，還可以取代水溶性高分子，或與水溶性高分子同時使用各種表面活性劑，如陰離子性、非離子性或脂溶性等表面活性劑。當還原使用醇的情況下，使用乙醇、n-丙醇、n-丁醇、n-戊醇、或者乙二醇等。不過，貴金屬微粒的製造方法不限定於上述說明的方法。
本發明的藥品可以用於預防及/或治療選自神經變性疾病、風溼性疾病、缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂的疾病。
作為神經變性疾病，例如可以用肌肉萎縮性側索硬化病、阿耳茨海默病、帕金森氏病等作示例，但並不限定於這些。本發明藥品優選應用對象是肌肉萎縮性側索硬化病。
作為風溼性疾病，例如可以用類風溼性關節炎、幼年性風溼性關節炎、紅斑狼瘡(盤狀狼瘡、全身性紅斑狼瘡、與用藥有關的狼瘡等)、硬皮症、瀰漫性筋膜炎、多發性肌炎、壞死性脈管炎及其它血管病、斯耶格倫氏綜合症(乾燥綜合症)、重疊綜合症等瀰漫性結締組織異常、伴有脊髓炎的關節炎、變性關節病(骨關節病、變形性關節病)、伴有感染病原體的關節炎、伴有風溼病症狀的代謝性及內分泌性疾病、腫瘤(腫瘍)、神經·血管異常、骨及軟骨病、關節外疾病、有關節症狀的各種疾病等作為示例(Decker J.L.等，Arth.Rheum.，26(8)，1983)，但並不限定於這些。本發明藥品優選的應用對象是類風溼性關節炎。
在本說明書中使用的缺血性心臟病術語，至少包含心絞痛及心肌梗塞，分別包含各種病型。例如心絞痛中有勞力性心絞痛及自發性心絞痛(海老原等編，「心絞痛與β阻斷劑-臨床藥理與臨床應用-」，臨床醫學研究教會，1989)、也有分類為勞力性心絞痛和不穩定心絞痛的情形(American HealthAssociation)。心肌梗塞一般是引起冠狀動脈大分支閉塞，在其供血的範圍產生廣範圍的壞死。缺血性心臟病也有分類為勞力性心絞痛、心肌梗塞(包括急性及陳舊性)、中間型、及無痛性缺血性心臟病(包括無症狀性及慢性心肌損傷)的情形(安部等編，「心絞痛」，金原出版，1985)。進而，大家知道，心肌梗塞的治療採取的PTCA(Percutaneous Transluminal CoronaryAngioplasty)中，在進行氣球或導管處置後，血管再狹窄或再閉塞的發生率高。而伴有由這些處置引起的血管再狹窄或再閉塞的心臟病也包括在缺血性心臟病中。本說明書中使用的缺血性心臟病的術語，應該最廣義地解釋為包括所有的這些疾病，而在任何意義上都不能作局限性解釋。
應激性潰瘍中包括消化性潰瘍，更具體的是包括胃潰瘍及十二指腸潰瘍。大家知道作為消化性潰瘍的初次病因，應激成為外因性的病因，本發明的藥品可以適用於成為主要病因的潰瘍。本發明的藥品除了明確病因是應激的情況之外，也可以應用於懷疑其存在的情況下。
皮炎中，例如除接觸毒性化學物質和光，引起接觸性皮炎(暫時刺激性接觸皮炎、變應性接觸皮炎、光毒性接觸皮炎、光變應性接觸皮炎等，大城戶編、皮膚科治療手冊、南山堂、1989)之外，還包括溼疹組(急性溼疹及慢性溼疹等)、特應性皮炎(新生兒至乳兒期、幼兒至學齡期及成人期間的特應性皮炎等)、脂溢性皮炎、自體致敏性皮炎、藥疹等。本發明的藥品除全身給藥之外，也可以針對皮炎部位局部給藥。
動脈硬化是表現為動脈壁改變、硬化及功能降低的局限性動脈病變的總稱，包括中膜硬化、小動脈硬化及粥樣(アテロ一ム)硬化等病態。本發明藥品的提供對象動脈硬化可以是其中任何一種，動脈的部位也沒有特別限定，例如冠狀動脈、主動脈、腎動脈及四肢動脈等任何部位都可以。而且，本發明藥品的適用對象可以是動脈硬化初期的血管內皮細胞的泡沫細胞化、泡沫細胞的細胞壞死及脂肪堆積於動脈硬化病灶等任何病變時期的動脈硬化。本發明藥品的提供對象除了完全動脈硬化之外，還包含動脈硬化形成過程中的病變，需要從最廣義來解釋。本發明藥品還有降低血中脂肪的作用，可以用於高血脂病的預防及/或治療。
在本說明書中，「預防及/或治療」的術語，應從最廣義解釋為除了預防上述疾病的發病及發病後上述疾病的治療之外，還包括抑制上述疾病的發展、改善或減輕上述疾病的病狀、預防上述疾病的再發等，而在任何意義上都不能作局限性解釋。
本發明藥品的給藥途徑沒有特別限制，可以選擇口服或非口服的任何給藥途徑。作為本發明的藥品，可以直接使用按上述說明的方法製造的膠狀貴金屬分散物或乾燥狀態的貴金屬微粒。在水中或有機溶媒中，或者在水與有機溶媒的混合物中製造的金屬微粒是以膠狀存在的，把這種膠狀的貴金屬分散物作為本發明的藥品，可以直接使用。另外，把貴金屬微粒聚集起來，形成團狀的水性懸浮劑，作為本發明藥品使用也可以。進而，想要除去溶媒時，經加熱等操作，除去溶媒可以獲得乾燥狀態的微粒。經其操作所獲的乾燥微粒，也可以作為本發明藥品使用。清涼飲料水，含鉑微粒的水(如「白金玄水」、アイノベツクス株式會社)、急性腸胃炎或慢性腸胃黏膜炎的治療藥，鉑·鈀膠體製劑(「內服用漿料(パプラ一ル)」，株式會社東洋厚生製藥所)等，也可以作為本發明藥品使用。
本發明的藥品可以作為用該行業眾所周知的方法，能夠製造的口服或非口服用藥品的成分給藥。適合於口服的藥品成分可舉出，如片劑、膠囊劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、液劑、糖漿劑等。適合於非口服的藥品成分可舉出，如注射劑、點滴劑、栓劑、吸入劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、軟膏劑、乳劑、經皮吸收劑、經黏膜吸收劑及貼敷劑等。上述藥品成分，可以與有效成分貴金屬微粒同時，用一種或兩種以上的製劑添加物製造。作為製劑用的添加物，可以舉出，如賦形劑、分解劑或輔助分解劑、結合劑、潤滑劑、塗敷劑、色素、稀釋劑、基質(主藥)、溶解劑或輔助溶解劑、等滲劑、pH調節劑、穩定劑、噴劑、粘合劑等。從事該行業者可以按照藥品成分適當選擇它們。
本發明藥品的給藥量沒有特別限制，可以根據疾病種類、預防或治療目的、患者年齡、體重、症狀等適當選擇。例如，口服的情況下，成人每天服用的貴金屬微粒重量，可以在0.001～1,000mg的範圍內。
實施例下面用實施例對本發明作進一步具體說明，但本發明的範圍，並不限定於下述的實施例。
例1在連接著丙烯冷卻管和三通旋塞閥的100ml雙口茄底燒瓶中，加入聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮(和光純藥株式會社制，0.1467g)，用23ml蒸餾水溶解開。把此溶液攪拌10分鐘後，加入在蒸餾水中溶解有氯鉑酸(H2PtCl6·6H2O，和光純藥株式會社制)的1.66×10-2M溶液(2ml)，再攪拌30分鐘。反應裝置內換成氮氣，加入特級乙醇25ml，保持在氮氣氣氛下，在100℃條件下，進行了兩小時回流。測定反應液的UV，確認了鉑離子峰值的消失和由於金屬固體特有的散射峰值的飽和，結束了還原反應。把有機溶劑減壓餾去，製造含有鉑微粒(平均粒徑為2.4±0.7nm)的鉑膠體。在下面的實施例中，這種鉑膠體用PVP-Pt表示。同樣，用聚丙烯酸鈉(アルドリツチ社制，對應於Pt，為125倍單位)代替聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)，製造了平均粒徑為2.0±0.4nm的鉑膠體。在下面的實施例中，這種鉑膠體用PAA-Pt表示。
例2對6～8周齡的B6SJL-TgN(SODIG93A)Gur小鼠(患肌肉萎縮性側索硬化症的試驗小鼠)，任意給與0.66μM、0.066μM或6.6nM上述鉑膠體(PVP-Pt)，進行飼養。大約從16周開始，在用普通水飼養的對照組小鼠中，發現肌肉萎縮性側索硬化症的典型症狀，後腿變得不能動，前腿只能爬了。另一方面，給與鉑膠體的小鼠中，證實根據給藥量，上述症狀有所改善。給藥量為6.6nM的小鼠組中的小鼠，雖然發現行走時後腿不太靈等異常，但是可以行走了。給藥量為0.066μM的小鼠組中的小鼠，雖然發現後腿發抖，但是能很快站立起來，給藥量為0.66μM的小鼠組中的小鼠，沒有發現症狀，具有和正常小鼠同樣的行走能力。
例3對3周齡及7周齡的B6SJL-TgN(SODIG93A)Gur小鼠，給與0.5μM上述鉑膠體(PVP-Pt，用量為鉑給藥量)，用紅外線傳感器測定接收到的小鼠移動次數。移動次數少，意味著由於肌肉萎縮性側索硬化症發病造成運動量降低。把用水取代鉑膠體給藥的B6SJL-TgN(SODIG93A)Gur小鼠，作為比較組(病態小鼠)，與正常小鼠進行了比較。用7周齡小鼠實驗的結果，如圖1所示。給與本發明藥品的組中，由肌肉萎縮性側索硬化症發病造成運動量的降低得以抑制。
例4把大白鼠(日本Charles River(チヤ一ルス·リバ一)公司，LEW/CrJ系，100～130g，7周齡)在5天的檢疫期間和其後8天的馴化期間後，用於實驗。大白鼠在室溫20～26℃、溼度為40～70％、明暗各12小時的條件下，用固體飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業株式會社)，以自由攝餌的方式，進行飼養。把引起炎症的試劑(Mycobacteriumbutyricum，Difco)，用流動石蠟，製成濃度為1.0mg/0.1mL的懸浮液在醚麻醉下，用裝有27G針頭(結合菌素皮內試驗針)的聚丙烯制一次性注射器，注射到左側後腿腳掌皮內。引起炎症的試劑在給藥開始之日的給藥之前，按0.1mg/只，注射。
把本發明藥品，即上述鉑膠體(PAA-Pt)用裝有25G針頭的聚丙烯制一次性注射器，注射到尾靜脈內。注射次數為一天一次，注射開始之日為給藥一天，給藥期為20天。給藥量為0.05μmol/kg、0.5μmol/kg、5μmol/kg。作為對照，把生理鹽水，同樣，注射到尾靜脈內。
大白鼠每組為10隻，在給藥1，2，4，7，9，11，14，16，18天之前，和剖驗日，用大白鼠後腿腳掌浮腫容積測定裝置(TK-101CMP，有限公司Unicom)，測定了兩側後腿腳掌容積。用下式，從給藥1天及各測定日的腳掌容積，計算出浮腫率。浮腫率(Δ％)＝(各測定日的腳掌容積(mL)-給藥1天的腳掌容積(mL))÷給藥1天的腳掌容積(mL)×100在剖驗日，用醚之類麻醉，從腹部大動脈放血致死後，把兩條後腿在大腿骨中央切斷，用20％中性緩衝福馬林固定。固定後，用軟X線攝影裝置(SOFROM SRO-505C，株式會社SOFROM)拍攝軟X線照片。骨損傷情況，通過觀察描圖機上照射的軟X線膠片，給損傷程度，記分。得分，根據下面的判定標準，對跟骨、跗骨、中足骨及脛骨進行判斷，求出四個部位的總分。骨損傷分數0正常1輕度骨損傷、密度降低2中度骨損傷、密度降低3重度骨損傷及變形在圖2中顯示出本發明藥品對浮腫率的效果。在圖3中顯示出本發明藥品對骨損傷的效果。證實了本發明藥品對浮腫及骨損傷有良好的治療效果。從病理上看，雖然在炎症細胞對患部的浸潤上，沒有發現給藥組與對照組之間的差別，但是在浮腫、化膿、骨損傷等組織損傷情況方面發現給藥組與對照組比較，有顯著改善。
例5對兔子(北山レベス株式會社。Kb1Jw(SPF)系，2.00～2.80kg、12周齡)進行5天檢疫及兩天以上的馴化，進行體重測定和一般狀態的觀察，把一般狀態及體重變化沒有發現異常的兔子，用於實驗。兔子在室溫20～26℃、溼度40～70％、明暗各12小時的條件下，按每天100g的比例，給與固體飼料(RC4，オリエンタル酵母工業株式會社)進行飼養。
對13～16周齡的兔子按30mg/mL/kg，從耳廓注射戊巴比妥鈉，麻醉後固定於背位。把氣管插管插入氣管後，連接到人工呼吸器(NEW ENGLANDINSTRUMENTS INC.，141A)，(設定條件40～60次/分、20～30mL/次，根據麻醉狀況，在麻醉範圍內調整)，維持呼吸。血壓是用與插入大腿動脈的動脈插管連結的壓力傳感器(TP-300T，日本光電工業株式會社)，傳導至畸變壓力放大器(AP-601G，日本光電工業株式會社)及血壓測定裝置(AP-611G，日本光電工業株式會社)，記錄在記錄器(WT-645G，日本光電工業株式會社)上。心電圖(第2誘導)是由針電極誘導至生物電放大器(AB-621G，日本光電工業株式會社)，記錄在記錄器(WT-645G，日本光電工業株式會社)。
在實施試驗兔子的第4肋骨和第5脅骨之間打開胸腔。切開胸包膜，使心臟露出胸腔，用帶針的縫合線(3/8圓形圓針，日本商事株式會社)結紮左冠狀動脈(LCA)，進行30分鐘的閉鎖(缺血)。閉鎖30分鐘後，拆開結紮的縫合線(為能夠隨時結紮LCA，縫合線原封不動留在胸腔內)，開放血管(再次供血)。60分鐘後縫合胸部，把兔子放回到飼養室內。
開放約48小時後，用戊巴比妥進行上述同樣的麻醉後，從兔子的頸大動脈處放血使動物死亡。開胸摘出心臟，把心臟放到生理鹽水中洗淨。結紮洗淨心臟的LCA，從大動脈的切口處灌入1～1.5mL左右的0.5％伊凡斯藍進行染色。染色後，進行切片，對心臟只進行左心室切片，使心肌平行於心底部距心突部以5mm間隔進行切片，(每隻兔子6個切片)，切片後放入裝有1％TTC磷酸緩衝液的燒杯中，在設定37℃的恆溫槽中加溫10分鐘。加溫後，給切片的心肌拍片，分成非缺血部分(伊凡斯藍染色部分A)、缺血部非梗塞部分(伊凡斯藍非染色部分中的TTC染色部分B)、及梗塞部分(伊凡斯藍非染色部分中的TTC非染色部分；C)，分別測定其重量。從測得的重量算出，缺血領域重量(B+C的6片總量)對整個左心室重量(A+B+C的6片總量)的比例，及梗塞領域重量(C的6片總量)對缺血領域重量的比例。1％TTC磷酸緩衝液的調製，是把磷酸緩衝片溶解於注射液中形成磷酸緩衝液，並使TTC為1w/v％。0.5％伊凡斯藍的調製，是把伊凡斯藍溶解於注射液中，使其成為0.5w/v％。
用生理鹽水稀釋PAA-Pt並注射到靜脈中。於再供血前5分鐘，從大腿靜脈一次給藥(0.5μg/kg)，繼續給藥到再供血結束時，持續給藥(0.5μg/kg/hr)。一次注射量為0.1mL/kg，持續給藥為1mL/kg/hr。另外，再供血結束後，經過24小時再度一次注射藥劑。作為對照，把生理鹽水與上述給藥組進行同樣的一次給藥及持續給藥(一次給藥量為0.1mL/kg，持續給藥量為1mL/kg/hr)。結果如表1所示。從表1的結果中可以證實，本發明的藥品，可有益減少心肌缺血再供血障礙典型病例中的梗塞部分及缺血部分。特別是在給與5μmol/kg組中，具有極其顯著的作用。
例6對大白鼠(日本Charles River公司，CrJCD(SD)IGS系，140～210g，雄性6周齡)進行5天檢疫之後再用兩天馴化後，用於實驗。大白鼠在室溫20～26℃、溼度40～70％、明暗各12小時的條件下，用固體飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業株式會社)經自由攝餌，進行飼養。把本發明藥品上述的鉑膠體(PAA-Pt)用裝有25G注射針的丙烯制一次性注射器，在尾靜脈內(2mL/kg)，一天注射一次，或一天一次口服(5mL/kg)。同樣，作為對照，在尾靜脈內注射生理鹽水。
取試驗體，於30分鐘後放入束縛用的不鏽鋼製籠(4.5×4.5×18cm、10連串)中，放在23℃±1的水槽中，浸泡至胸部呈劍狀突起。水浸束縛7小時後用頸椎脫臼的方法使大白鼠安樂死，把胃摘出。把摘出的胃，用生理鹽水10mL填充其內部，再將其用1％的福馬林浸泡，固定到第二天。固定後，沿大彎切開，在生理鹽水中輕輕洗滌後，測定其潰瘍的長度。計算短徑/長徑中的長徑，把總和作為其個體的值。
用潰瘍的長徑，算出各個組平均值±標準誤差(mm)。顯著誤差檢定是比較每個給藥途徑媒介組和PAA-Pt組，F測定後，同方差的情況下，進行Student的t檢定，非同方差的情況下，進行Aspin-Welch的t檢定。有意標準以不滿5％為有意，分不滿5％(P＜0.05)和不滿1％(P＜0.01)，表示。束縛3小時中，給與生理鹽水組的潰瘍直徑(平均值)為19.86mm(標準偏差8.41mm)，給與PAA-Pt組的潰瘍直徑(平均值)為7.27mm(標準偏差2.57mm，p＝0.00566353)。而束縛7小時中，給與生理鹽水組的潰瘍直徑(平均值)為43.88mm(標準偏差11.96mm)，給與PAA-Pt組的潰瘍直徑(平均值)為19.84mm(標準偏差7.50mm，p＝0.00191338)。
表1
*p＜0.05對於Vehicle有顯著誤差(Student的t測定)例7用BALB/c系小鼠，每組4隻，用新喹啉酮系合成抗菌藥洛美沙星(ロメフロキサシン)(LFLX，以引起光促作用而著稱)，研究本發明藥品對光促作用引起皮炎的作用(Tokura，Y.等，J.Immunol.，160，pp.3719-3728，1998；Watanabe，H.等，J.Biol.Chem.，279，pp.1676-1683，2004)。用UVA(12J/cm2)對給與LFLX2mg/0.2ml(i.p.)的小鼠，進行腹部剃毛部分照射，起光促作用。在含2％羧基乙烯基聚合物的水溶液中，加入1mM的PAA-Pt，製成凝膠狀軟膏，從光促作用的第2天至第5天(在第5天光照射後塗敷)按0.3g/ear，塗敷於耳廓兩側。對陽性對照組，只塗敷2％(w/w)羧基乙烯基聚合物。在第5天把2mg/0.2ml的LFLX給藥至腹腔內(i.p.)，用UVA(20J/cm2)，照射兩耳廓。對非光促作用組，在第5天只給與2mg/0.2ml(i.p.)的LFLX和用UVA(20J/cm2)照射。其結果是照射24小時後(第6天)塗敷鉑膠體組中，與陽性對照組比較，耳廓腫脹明顯為輕度。再觀察用UVA(20J/cm2)照射第10天的發紅現象，塗敷鉑膠體組中耳廓的紅斑、腫脹明顯地減輕。(圖4)。
表2
*p＜0.001(n＝8)例8用BALB/c系小鼠，每組4～6隻，在試驗開始的第1天及第2天，把1％TCSA(3，3』，4』，5-四氯水楊醯替苯胺、橄欖油-丙酮(1∶4)混合物中)100μl塗敷於小鼠的背部剃毛處，用UVA(16J/cm2)照射塗敷處，起光促作用(Suzuki，K.等，J.Dermatol.Sci.，23，pp.138-144，2000)。從光促作用的第2天開始至第5天(第5天在光照射後塗敷)，在耳廓兩側塗敷0.3g/ear，在耳廓上半抗原塗敷。作為陽性對照，只塗敷2％(w/w)羧基乙烯基聚合物。第5天，在小鼠兩耳的其它部分塗敷40μl的0.1％TCSA，以40釐米的距離照射UVA(16J/cm2)。對於非光促作用組，在第5天只進行40μl的0.1％TCSA塗敷和UVA(16J/cm2)的照射。照射24小時後，測定耳朵的厚度。其結果，在鉑膠體塗敷組中，和陽性對照組比較，光接觸皮炎反應輕。
表3
*p＜0.05 v.s.陽性對照例9把Kb1jw系兔子(SPF、雄性、體重1.80～2.70kg、北山ラベス株式會社)安排5天的檢疫，然後再進行9天的馴化，進行飼養，在這期間要進行3次體重測定及每天進行一般狀態的觀察。飼料使用固體飼料(RC4，オリエンタル酵母工業株式會社)。然後，用0.5％膽固醇飼料(含有0.5％膽固醇、3％花生油、3％椰子油的飼料)進行14天的馴化飼養。選出總膽固醇值上升良好的兔子，分成4組，每組10隻，使分組那一天的體重和總膽固醇的平均值基本相等。使兔子在室溫20～26℃、溼度40～70％、明暗各12小時(照明上午6時～下午6時)、換氣次數12次/小時(用過濾器除菌的新鮮空氣)的飼養室內進行飼養。用鋁製的籠子(W350×D580×H350mm、安裝有自動消毒及自動給水裝置)個別飼養。給餌量整個期間為100g/只/天。飲水量，通過自來水用自動給水裝置自由攝取。
用生理鹽水稀釋PAA-Pt，用裝有23G針頭的聚丙烯制一次性注射器(テルモ株式會社)，每天一次注射到耳廓靜脈內。注射時間為70天(10周)。膽固醇負荷前、開始用藥前、用藥4周、7周、及10周後，從前一天開始，讓其絕食18小時，從耳廓動脈抽到採血管內(テルモ株式會社、VP-AS054)約4mL血，用冷卻離心機(CF 8DL、日立工機株式會社)對離心分離(約4℃、3000rpm、15分鐘)的血清，進行總膽固醇(TC、COD·POD法)、甘油三酸酯(TG、GPO·HDAOS法)、HDL-C(直接法)及過氧化脂質(LPO、八木別法)的測定。
給藥期滿的第二天，在戊巴比妥鈉(戊巴比妥鈉注射液，大日本製藥株式會社)麻醉下，開腹，從腹部大動脈放血致死後，開胸，進行剖驗記錄。之後，摘出大動脈(從大動脈起始部髂骨動脈)，用10％中性緩衝福馬林固定後，進行oil Red o染色。染色後的大動脈，用數位照相機(Finepix S1 Pro，富士照相膠捲株式會社)拍攝，計算出紅色染色部位對應於圖象解析的整個大動脈面積的比例。用所得的數值算出各組平均值±標準差。顯著誤差審定在媒介組和給藥組中進行，危險率不足5％作為有意的審定法，經Bartlett檢定後，同方差的情況下用Dunnett檢定；非同方差的情況下，用Steel檢定。給與生理鹽水組中，動脈硬化損傷域(％)的平均值為45.5％(p＝13.5)。給與鉑膠體組中，動脈硬化損傷域(％)的平均值，在給與0.005μmol/kg組中為18.7％(p＝6.7)；在給與0.05μmol/kg組中為19.8％(p＝4.0)；在給與0.5μmol/kg組中為19.2％(p＝4.1)。
工業上利用的可能性本發明藥品，作為預防及/或治療肌肉萎縮性側索硬化症和阿耳茨海默病等神經變性疾病、類風溼性關節炎等風溼性疾病、心肌梗塞等缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化、高血脂的藥品，是有用的。
權利要求
1.預防及/或治療神經變性疾病、風溼性疾病、缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化、高血脂的藥品，其中，含有貴金屬或貴金屬的合金微粒作為有效成分。
2.根據權利要求1所述的藥品，其特徵在於所述的藥品是治療神經變性疾病的。
3.根據權利要求2所述的藥品，其特徵在於所述藥品治療的神經變性疾病是肌肉萎縮性側索硬化症、阿耳茨海默病或帕金森氏病。
4.根據權利要求1所述的藥品，其特徵在於所述的藥品是治療風溼性疾病的。
5.根據權利要求4所述的藥品，其特徵在於所述藥品治療的風溼性疾病是類風溼性關節炎。
6.根據權利要求1所述的藥品，其特徵在於所述的藥品是治療缺血性心臟病的。
7.根據權利要求6所述的藥品，其特徵在於所述藥品治療的缺血性心臟病是急性期的心肌梗塞。
8.根據權利要求1所述的藥品，其特徵在於所述的藥品是治療應激性潰瘍的。
9.根據權利要求8所述的藥品，其特徵在於所述藥品治療的應激性潰瘍是應激性胃潰瘍或應激性十二指腸潰瘍。
10.根據權利要求1所述的藥品，其特徵在於所述的藥品是治療皮炎的。
11.根據權利要求1所述的藥品，其特徵在於所述的藥品是治療動脈硬化的。
12.根據權利要求1～11項所述的藥品，其特徵在於所述的貴金屬是選自釕、銠、鉑中的一種或兩種以上的貴金屬。
13.根據權利要求1～11項所述的藥品，其特徵在於所述的貴金屬是鉑。
14.根據權利要求1～13項所述的藥品，其特徵在於所述的貴金屬微粒是平均粒徑為10nm以下的鉑膠體。
全文摘要
本發明公開了一種預防及/或治療選自肌肉萎縮性側索硬化症和阿耳茨海默病等神經變性疾病、類風溼性關節炎等風溼性疾病、心肌梗塞等缺血性心臟病、應激性潰瘍、皮炎、動脈硬化及高血脂的藥品，作為有效成分，含有鉑等貴金屬或含貴金屬合金微粒(例如鉑膠體)的藥品。
文檔編號A61P25/00GK1750838SQ20048000453
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月18日 優先權日2003年2月20日
發明者宮本有正, 吉田秀明, 梶田昌志, 清水宏, 清水忠道 申請人:席堤克株式會社