用於酶漂白食品的新穎酶的製作方法

2023-08-10 03:10:01 2

專利名稱：用於酶漂白食品的新穎酶的製作方法
專利說明用於酶漂白食品的新穎酶 本發明涉及適用於食品(其具有提高的白度)製備方法的新穎酶、該酶提高食品的至少一部分的白度的用途、用於製備食品的方法(其中使用所述酶)和獲得的食品。
在一些類型的食品中，食品至少一部分為白色是人們期望的，例如在乳製品(例如乳酪、乳清、黃油和乳粉)中和在基於麵粉的產物(例如麵包和麵條)中。
然而，這類食品的原料或中間體可能包含色素，這可引起食品為米色到黃色。這類色素的實例是類胡蘿蔔素(胡蘿蔔素和葉黃素)和黃酮。
例如在白麵包中，人們期望看到白色的碎屑。更白的碎屑可通過使用酶(例如過氧化氫酶、過氧化物酶、酯酶和/或脂肪氧化酶)獲得，參閱例如′Oxido-reductases and Lipases as Dough-Bleaching Agent′by P.Gelinas et al，Cereal Chem，75(6)，810-814(1998)。提到的所有酶都對碎屑具有漂白效應。目前，烘焙工業主要使用酶活性的大豆粉，其含有脂肪氧化酶。大豆粉中的脂肪氧化酶由於自由基和其他活性氧的作用，能夠漂白小麥麵粉色素，所述自由基和其他活性氧在脂肪氧化酶氧化脂肪酸時形成。該反應稱作共氧化(co-oxidation)。在大豆粉中存在三種脂肪氧化酶L1、L2和L3，其中L2和L3具有最佳的漂白活性(W.Grosch，G.Laskawy and F.Weber，J.Agric.Food Chem 24(1976)，456)。大豆粉不僅含有脂肪氧化酶，還含有漂白效應所必需的脂肪酸，導致改善的漂白效應。
使用大豆作為脂肪氧化酶來源的缺點在於目前大部分大豆是被遺傳修飾的(GMO)。因為全世界的消費者偏好於使用非GMO來源的麵包改良添加劑，所以非常需要大豆脂肪氧化酶的替代方案。除了來自大豆的脂肪氧化酶L2和L3之外的其它已知酶具有下述缺點它們的表現不如來自大豆的脂肪氧化酶好。在實踐中，為了獲得期望的白度，將這些酶與輔助因子或其他酶組合以達到期望的碎屑白度水平。過氧化物酶通過分子氧非酶地催化不飽和化合物(例如不飽和脂肪酸)的氧化(CE.Eriksson et.al.JAOS48(1971)442)。這些被氧化的脂肪酸產生自由基，所述自由基可能與麵粉色素反應，以與脂肪氧化酶反應產物相似的方式產生顏色更淺的產物。
本發明的目的是提供適用於製備食品的新穎酶，所述食品的至少一部分的白度被提高。
令人驚奇地發現根據本發明的漂白酶能夠將色素直接轉化為導致白度提高的形式。這些酶可以以多種形式顯示它們對色素的直接漂白效應。例如，它們可通過例如氫化將色素中的不飽合鍵飽和來直接轉化色素，或它們可直接切割色素形成降解產物。術語直接是指酶作用於色素，色素自身作為底物。不明確排除使用輔助因子來達成轉化。
另外發現根據本發明的漂白多肽能夠直接切割色素(所謂的切割酶)。根據本發明的合適切割酶是能夠切割類胡蘿蔔素(胡蘿蔔素和葉黃素)和黃酮的酶。類胡蘿蔔素可以以兩種不同方式被切割，中心的和偏心的。類胡蘿蔔素中心切割導致形成類視黃醇(C20-化合物)。偏心切割可產生更多樣性的化合物，例如脫落酸。能夠中心切割類胡蘿蔔素的酶為例如EP-A-1031623和J.Lintig and K.Vogt(2000)J.Biol.Chem.275，11915中描述的例如β-胡蘿蔔素15，15′-單加氧酶(EC 1.14.99.36)。該酶先前已知為β-胡蘿蔔素15，15′-雙加氧酶＝EC 1.13.11.21。
使用能夠中心切割的酶的另一好處在於形成類視黃醇。這些是視覺的關鍵成分，β-胡蘿蔔素被切割為兩分子的視黃醛。該視黃醛可以被修飾為視黃醇，也稱作維生素A。能夠偏心切割類胡蘿蔔素的酶為9-順-環氧類胡蘿蔔素雙加氧酶(例如X.Qin and J.A.D.Zeevaart(1999)，Proc.Nat.Acad.Science，96，15354)和β-胡蘿蔔素9′，10′-雙加氧酶(例如Kiefer et al.(2001)，J.Biol.Chem.287，14110)。
該目的通過本發明中公開的新穎酶達成。
在第一方面，本發明涉及經分離的多肽，其具有漂白活性和一種或多種選自以下的特徵 1)根據SEQ ID NO08-12任一的經分離的多肽或其任一的功能等價物； 2)經分離的多肽，其可通過在適當的宿主細胞例如Aspergillus niger中表達下述物質獲得根據SEQ ID NO01-07任一的多核苷酸，或其任一的功能等價物，或包含所述多核苷酸或其任一功能等價物的載體，和 3)多肽，其至少包含SEQ ID NO13-17之一。
術語「具有漂白活性的多肽」在此處和下文中定義為能夠降解β-胡蘿蔔素的多肽或能夠漂白食品的多肽。β-胡蘿蔔素降解可以通過例如本專利申請的「材料和方法」章節中公開的至少一種方法測量，例如根據Zorn的方法或根據Aziz的方法。優選地，根據本發明的多肽在Aziz和Zorn測定法中均顯示漂白活性。漂白食品的能力可以通過將產物A(其中被研究的多肽用於其製備中)的白度與產物B(其與產物A的區別僅在於所研究的多肽未用於其產物中)的白度視覺地或通過已知的反射測定法比較來測定，其中在被研究的多肽具有漂白活性時，產物A的b因子會比產物B的b因子更接近0。
更優選地，根據本發明的多肽能夠降解β-胡蘿蔔素(如根據Zorn所測定的)並且能夠漂白食品(如通過反射測量法測量b因子所測定的)。最優選地，在被漂白的食品具有不規則的表面結構(例如麵包屑)的情況下，根據本發明的多肽能夠降解β-胡蘿蔔素(如根據Zorn所測定的)，因為此時反射測量方法不那麼可靠。
在優選的實施方案中，本發明提供經純化的多肽。根據本發明的多肽包括由根據本發明的多核苷酸編碼的多肽。特別優選的是根據SEQ ID NO08-12的多肽活其任一的功能等價物。
包含根據本發明的多肽的融合蛋白也屬於本發明的範圍內。本發明還提供根據本發明的多肽的製造方法。
為了避免疑惑；SEQ ID NO01-07是指包含SEQ ID NO01、SEQ IDNO02、SEQ ID NO03、SEQ ID NO04、SEQ ID NO05、SEQ ID NO06和SEQ ID NO07的DNA組；SEQ ID NO08-12是指包含SEQ ID NO08、SEQ ID NO09、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的蛋白質序列組；SEQ ID NO13-18是指包含SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16和SEQ ID NO17的蛋白質序列組。另外，術語caroase-01、caroase-02、caroase-03、caroase-04、caroase-05(整組被稱作「caroase-01-05」)用於表示分別具有SEQ ID NO08-12的多肽。
第二方面，本發明提供具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列在高嚴格度條件下優選地與根據SEQ ID NO01-07之任一的序列雜交。因此，本發明提供核酸，所述核酸與根據SEQ ID NO01-07的序列約55％、優選地65％、更優選地70％、進一步更優選地75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在更優選的實施方案中，本發明提供這類經分離的多核苷酸，其可得自真菌，優選地得自絲狀真菌，特別是優選Marasmius，例如M.scorodonius。
在一個實施方案中，本發明提供經分離的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO08-12中所示的胺基酸序列或其任一的功能等價物。
在另一優選的實施方案中，本發明提供經分離的多核苷酸，其編碼根據SEQ ID NO08-12的多肽或其任一的功能等價物的至少一個功能結構域。
在優選的實施方案中，本發明提供根據SEQ ID NO01-07的漂白酶基因。在另一優選的實施方案中，本發明提供編碼漂白酶的多核苷酸或這些多肽中任一的變體或片段，所述漂白酶的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO08-12中。
在另一優選的實施方案中，本發明提供包含編碼序列的多核苷酸(優選SEQ ID NO01-07的多核苷酸序列)，所述編碼序列編碼根據本發明的多肽。
第三方面，本發明還涉及包含根據本發明的多核苷酸序列的載體，和可用於擴增或檢測本發明DNA的引物、探針和片段。
在優選的實施方案中，提供一種載體，其中根據本發明的多核苷酸序列與調節序列功能性連接，所述調節序列適用於在合適的宿主細胞(如細菌或絲狀真菌，優選Marasmius例如M.scorodonius、Aspergillus例如A.niger或A.oryzae)中表達所編碼的胺基酸序列。本發明還提供用於製備本發明多核苷酸和載體的方法。
第四方面，本發明還涉及重組產生的宿主細胞，其含有本發明的異源或同源多核苷酸。
在另一實施方案中，本發明提供重組的宿主細胞，其中本發明過氧化物酶的表達被顯著提高，或其中過氧化物酶的活性被提高。
在另一實施方案中，本發明提供重組產生的宿主細胞，所述宿主細胞含有本發明的異源或同源DNA，其中所述細胞能夠生產本發明的功能性過氧化物酶，優選能夠過表達(overexpress)本發明過氧化物酶的細胞，例如包含提高的本發明基因拷貝數的Aspergillus菌株。
第五方面，本發明還涉及本發明的漂白多肽在任何工業方法中的用途，優選如本文所述的用途。
根據本發明的多肽 本發明提供經分離的多肽，其具有根據SEQ ID NO08-12中任一的胺基酸序列，以及可通過在適當的宿主中表達SEQ ID NO01-07多核苷酸獲得的胺基酸序列。另外，包含上述多肽功能等價物的肽或多肽也包含在本發明中。上述肽共同包含在術語「根據本發明的多肽」中。
術語「肽」和「寡肽」在此處和下文中被認為是同義的(如通常所認為的)，每個術語可以按照上下文的需要互換使用表示通過肽鍵偶聯的至少兩個胺基酸鏈。詞語「多肽」在本文中用於含有多於七個胺基酸殘基的鏈。本文的所有寡肽和多肽式從左到右、從氨基端到羧基端書寫。本文使用的胺基酸單字母代碼為本領域公知並可見於Sambrook，et al.(MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
「經分離的」多肽或蛋白質表示從其天然環境中取出的多肽或蛋白質。例如，在宿主細胞中表達的重組產生的多肽和蛋白質被認為是分離的，其為通過任何合適的技術被實質純化的天然或重組多肽，所述技術如例如Smith and Johnson，Gene 6731-40(1988)中公開的單步純化方法。
根據本發明的caroase-01-05漂白酶或其功能等價物可通過公知的方法從重組細胞中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優選地，使用高效液相色譜(″HPLC″)用於純化。
本發明的多肽包括天然純化的產物、化學合成過程的產物和通過重組技術從原核或真核宿主(包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中生產的產物。根據重組生產過程中所使用的宿主，本發明的多肽可以被糖基化或未糖基化。另外，本發明的多肽也可包括原始的改良甲硫氨酸殘基，在一些情況下是宿主介導過程的結果。
功能等價物 術語「功能等價物」和「功能變體」在本文中可交換使用。caroase01-05DNA的功能等價物是編碼多肽的經分離DNA，所述多肽顯示與本文定義的caroase 01-05 Marasmius scorodonius漂白酶中至少一個至少相同或更好的漂白活性。本發明caroase 01-05多肽的功能等價物是下述多肽，所述多肽顯示與本文定義的caroase 01-05 Marasmius scorodonius漂白酶中至少一個至少相同或更好的漂白活性。
功能性蛋白質多肽等價物可僅含有SEQ ID NO08-12中任一個的一種或多種胺基酸的保守性取代，或這些中任一個的非必需胺基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需胺基酸是SEQ ID NO08-12任一個中可被改變而不顯著改變生物學功能的殘基。例如，在本發明caroase 01-05蛋白質中保守的胺基酸殘基被預測為特別不適合改變。另外，根據本發明的caroase01-05蛋白質和其他過氧化物酶中保守的胺基酸不太可能適合改變。
術語「保守取代」旨在表示一種取代，其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基取代。這些家族是本領域公知的，並包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電的極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶β分支側鏈的胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
功能性核酸等價物可典型地含有沉默突變或不改變所編碼多肽生物功能的突變。因此，本發明提供編碼caroase 01-05蛋白質的核酸分子，它的對特定生物學活性不必需的胺基酸殘基有所改變。這類caroase 01-05蛋白質與SEQ ID NO08-12任一的胺基酸序列不同，但仍保持至少一種生物學活性。在一個實施方案中，經分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與SEQ ID NO08-12任一種已知的胺基酸序列至少約55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源的基本同源的胺基酸序列。
例如，涉及如何製造表型沉默胺基酸取代的指導在Bowie，J.U.et al.，Science 2471306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在兩種主要的途徑用於研究胺基酸序列對改變的耐受。第一種方法依賴於進化的過程，其中突變被自然選擇接受或拒絕。第二種方法使用基因工程在被克隆基因的特定位點引入胺基酸改變，選擇或篩選以鑑定維持功能性的序列。如作者所述，這些研究顯示蛋白質對胺基酸取代驚人地耐受。作者還指出改變很可能在蛋白質的某些位置被允許。例如，大部分內陷的胺基酸殘基需要非極性的側鏈，而通常很少保留表面側鏈的特徵。其他這類表型沉默突變描述於上文Bowie et al和其中所引的參考文獻中。
編碼與SEQ ID NO08-12任一蛋白質同源的caroase 01-05蛋白質的經分離核酸分子可以如下產生向根據SEQ ID NO01-07的編碼核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，使得一個或多個胺基酸取代、缺失或插入被引入所編碼的蛋白質中。這類突變可通過標準技術被引入，例如定向誘變和PCR介導的誘變。
術語「功能等價物」也包括M.scorodonius caroase 01-05蛋白質的直向同源物。M.scorodonius caroase 01-05蛋白質的直向同源物是可從其他菌株或物種中分離並具有相似或相同生物活性的蛋白質。這類直向同源物可容易地被鑑定，因為包含與SEQ ID NO08-12任一個基本同源的胺基酸序列。
如本文所定義的，術語「基本同源」是指第一胺基酸或核苷酸序列含有足夠數量或最小數量的與第二胺基酸或核苷酸序列相同或等價(例如具有類似的側鏈)的胺基酸或核苷酸，從而所述第一和第二胺基酸或核苷酸序列具有共同的結構域。例如，含有下述共同結構域的胺基酸或核苷酸序列在本文被定義為足夠相同，所述共同結構域具有約55％，優選65％，更優選70％，進一步更優選75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性或更多。
編碼其他caroase 01-05家族成員的核酸(其因此具有與SEQ ID NO01-07不同的核苷酸序列)也屬於本發明的範圍。另外，編碼來自不同物種caroase 01-05的核酸(其因此具有與SEQ ID NO01-07不同的核苷酸序列)屬於本發明的範圍。
對應於本發明caroase 01-05 DNA變體(例如天然等位變體)和同源物的核酸分子可根據它們與本文公開的caroase 01-05核酸分子的同源性，使用本文公開的DNA或其合適片段作為雜交探針，根據標準雜交技術優選地在高嚴格度雜交條件下分離。
除了天然存在的caroase 01-05序列的等位變體外，本領域技術人員會了解可通過突變技術將改變引入SEQ ID NO01-07的核苷酸序列中，從而導致caroase 01-05蛋白質的胺基酸序列中的改變而不顯著改變caroase 01-05蛋白質的功能。
在本發明的另一方面，提供經改進的caroase 01-05蛋白質。經改進的caroase 01-05蛋白質是其中至少一種生物學活性被改進的蛋白質。這類蛋白質可通過向caroase 01-05編碼序列的全部或部分隨機引入突變(例如通過飽和誘變)來獲得，得到的突變體可被重組表達並篩選其生物活性。例如，本領域提供用於測量過氧化物酶酶活性的標準測定法，從而改良的蛋白質可容易地被選擇。
在優選的實施方案中，caroase 01-05蛋白質分別具有根據SEQ ID NO08-12任一的胺基酸序列。在另一實施方案中，caroase 01-05多肽與根據SEQ ID NO08-12的胺基酸序列基本上分別同源，並分別保持根據SEQ IDNO08-12的多肽的至少一種生物活性，但是因為天然突變或如上所述的誘變而在胺基酸序列上有所不同。
在另一優選的實施方案中，caroase 01-05蛋白質具有由經分離的核酸片段編碼的胺基酸序列，所述核酸片段能夠與根據SEQ ID NO01-07的核酸雜交，優選在高嚴格度雜交條件下雜交。
因此，caroase 01-05蛋白質是下述蛋白質，所述蛋白質包含與SEQ IDNO08-12任一所示的胺基酸序列至少約55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更多同源的胺基酸序列，並保持根據SEQ ID NO08-12任一的多肽的至少一種功能活性。
在本發明的另一方面。多肽包含至少一個SEQ ID NO13-17中所示的序列。優選地，根據本發明的多肽包含至少兩個SEQ ID NO13-17中所示的序列。最優選地，多肽包含SEQ ID NO13-17中所示的全部序列。
也可例如通過篩選本發明蛋白質突變體(例如截短突變體)的組合文庫的過氧化物酶活性來鑑定本發明蛋白質的功能等價物。在一個實施方案中，通過在核酸水平組合誘變產生變體的多樣化文庫。變體多樣化文庫可如下產生例如將合成的寡核苷酸酶連接為基因序列從而可能的蛋白質序列的簡併集合可作為個體多肽被表達，或者作為更大的融合蛋白質組(例如噬菌體展示)被表達。存在多種方法可被用於從簡併寡核苷酸序列產生本發明多肽的可能變體文庫。用於合成簡併寡核苷酸的方法為本領域已知(參閱例如Narang(1983)Tetrahedron 393；ltakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；ltakura et al.(1984)Science 1981056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，本發明多肽編碼序列的片段文庫可被用於產生多肽的多樣化群體，用於篩選隨後的變體選擇。例如，編碼序列片段的文庫可如下產生用核酸酶在每個分子僅發生一次切割的條件下處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段、將雙鏈DNA變性、將DNA變性形成雙鏈DNA(其可包括來自不同切割產物的正義/反義對)、通過用S1核酸酶處理從重新形成的雙鏈體去除單鏈部分，和將得到的片段文庫連接為表達載體。通過該方法可產生表達文庫，所述文庫編碼感興趣的蛋白質不同尺寸的N-末端和中間片段。
本領域已知若干技術用於篩選通過截短點突變產生的組合文庫中的基因產物，和篩選cDNA文庫中具有選定特性的基因產物。用於篩選大基因文庫的最廣泛使用的技術(其適合高通量分析)典型地包括將基因文庫克隆進可複製的表達載體中、用得到的載體文庫轉化適當的細胞，和在下述條件下表達組合基因，所述條件下所期望的活性的檢測有利於載體的分離，所述載體編碼其產物被檢測的基因。回歸總體誘變(REM)——一種增強文庫中功能突變體頻率的技術——可與鑑定本發明蛋白質變體的篩選測定法組合使用(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
除了所示的caroase 01-05基因序列(其中，caroase-01是SEQ ID NO01或02；caroase-02是SEQ ID NO03或4；caroase-03是SEQ ID NO05；caroase-04是SEQ ID NO06和caroase-05是SEQ ID NO07)外，本領域技術人員應當明白可能導致caroase蛋白質胺基酸序列改變的DNA序列多態性可存在於給定的種群中。這類遺傳多態性可存在於來自不同群體或同一群體(由於天然等位突變)的細胞中。等位突變體也可包括功能等價物。
根據本發明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為用於PCR反應的探針或引物作用。
根據本發明的核酸無論它們是否編碼功能或非功能的多肽，均可用作雜交探針或聚合酶鏈式反應(PCR)引物。不編碼具有caroase 01-05活性的多肽的本發明核酸分子的用途包括，但不限於(1)從cDNA文庫(例如來自除M.scorodonius之外的其他生物)分離編碼caroase 01-05蛋白質的基因或其等位變體；(2)與分裂中期染色體圖片原位雜交(例如FISH)，提供caroase 01-05基因的精確染色體定位，如Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述；(3)Northern印跡分析，檢測特定組織和/或細胞中caroase 01-05 mRNA的表達，和(4)探針和引物，其可用作診斷工具來分析給定生物學(例如組織)樣品中核酸的存在，所述核酸能夠與caroase 01-05探針雜交。
本發明還包括獲得caroase 01-05基因功能等價物的方法。這類方法包括獲得包括經分離核酸的被標記探針，所述核酸編碼根據SEQ ID NO08-12任一序列的全部或部分或其任一的變體；用被標記的探針在允許所述探針與文庫中核酸片段雜交的條件下篩選核酸片段文庫，從而形成核酸雙鏈體；和從任何標記的雙鏈體中的核酸片段製備全長基因序列，獲得與caroase 01-05基因相關的基因。
在一個實施方案中，本發明的caroase 01-05核酸與示出的核酸序列(分別是caroase-01為SEQ ID NO01或02；caroase-02為SEQ ID NO03或04；caroase-03為SEQ ID NO5；caroase-04為SEQ ID NO06和caroase-05為SEQ ID NO07)或其任一的補體為至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源。
在另一優選的實施方案中，本發明的caroase 01-05多肽與SEQ ID NO08-12任一分別所示的胺基酸序列為至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源。
多核苷酸 本發明提供編碼漂白酶(過氧化物酶)的多核苷酸，所述漂白酶暫時被稱作caroase 01-05，其具有SEQ ID NO08-12的胺基酸序列或其任一的功能等價物。編碼caroase 01-05的基因的序列通過擴增得自Marasmiusscorodonius的cDNA獲得。具有分別編碼caroase-01和caroase-02的SEQID NO02和SEQ ID NO04的序列是被挑出來的基因的最優化版本，其中已發生密碼子最優化。密碼子最優化可根據本領域技術人員已知的方法使用，並特別適用於促進基因在宿主細胞中的表達。本發明提供包含caroase01-05過氧化物酶編碼基因的多核苷酸序列。因此，本發明涉及經分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO01-07的核苷酸序列或其任一的功能等價物。Marasmius scorodonius中SEQ ID NO01-07具有漂白活性的發現非常驚人，特別是由於該序列與已知的漂白酶具有非常低的同源性。
更具體地，本發明涉及經分離的多核苷酸，其可在嚴格條件下(優選地在高嚴格度條件下)與SEQ ID NO01-07的多核苷酸雜交。有利地，這類多核苷酸可得自真菌，優選地得自絲狀真菌，特別是得自Marasmiusscorodonius。更具體地，本發明涉及具有SEQ ID NO01-07核苷酸序列的經分離的多核苷酸。
此處和下文中使用術語「基因」和「重組基因」是指可從染色體DNA中分離的核酸分子，其包括編碼蛋白質(例如M.scorodonius漂白酶)的開放讀碼框。基因可包括編碼序列、非編碼序列、內含子和調節序列。此外，基因是指本文定義的經分離的核酸分子。
本發明的核酸分子(如具有SEQ ID NO01-07核苷酸序列或其功能等價物的核酸分子)可使用標準的分子生物學技術和本文提供的序列信息被分離。例如。使用SEQ ID NO01-07核酸序列的全部或部分作為雜交探針，可使用標準雜交和克隆技術(例如如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，andManiatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989中所述)分離本發明的核酸分子。
另外，可使用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)分離包括SEQ ID NO01-07全部或部分的核酸分子，所述引物根據SEQ ID NO01-07中包含的序列信息被設計。
可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用適當的引物根據標準PCR擴增技術擴增本發明的核酸。這樣擴增的核酸可被克隆進適當的載體並通過DNA序列分析表徵。
另外，對應於本發明核苷酸序列或與之雜交的寡核苷酸可通過標準合成技術(例如使用自動DNA合成儀)製備。
在優選的實施方案中，本發明的經分離核酸分子包含SEQ ID NO01-07中顯示的核苷酸序列。該DNA包含分別編碼根據SEQ ID NO08-12的M.scorodonius caroase 01-05多肽的序列。
在另一優選的實施方案中，本發明的經分離核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO01-07所示核酸序列的補體或這些核苷酸序列的功能等價物。
與另一核苷酸序列互補的核酸分子是與另一核苷酸序列充分互補使得其能夠與另一核苷酸序列雜交形成穩定雙鏈體的核酸分子。
本發明的一個方面涉及經分離的核酸分子(其編碼本發明的多肽或其功能等價物，如生物活性片段或結構域)以及足夠用作用於鑑定編碼本發明多肽的核酸分子的雜交探針的核酸分子，和這類核酸分子的片段，所述片段適合用作PCR引物用於擴增或突變核酸分子。
「經分離的多核苷酸」或「經分離的核酸」是與兩個編碼序列均不緊鄰的DNA或RNA，而在所述DNA或RNA來源的生物的天然存在基因組中，所述編碼序列與所述DNA或RNA緊鄰(一個位於5』端，一個位於3』端)。因此，在一個實施方案中，經分離的核酸包括與編碼序列緊鄰的一些或所有5』非編碼(例如啟動子)序列。該術語因此包括例如被整合進載體中、自主複製質粒或病毒中、或原核生物或真核生物基因組DNA中、或作為不依賴於其他序列的獨立分子(例如通過PCR產生的或經限制性內切核酸酶處理的cDNA或基因組DNA)存在的重組DNA。其還包括是雜合基因部分的重組DNA，所述雜合基因編碼額外的多肽，所述多肽基本不含細胞材料、病毒材料、或培養基(當通過重組DNA技術生產時)、或化學前體或其他化學品(當化學合成時)。另外，「經分離的核酸片段」是天然不作為片段存在的和在天然狀態下不會發現的核酸片段。
本文使用術語「多核苷酸」或「核酸分子」旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優選是雙鏈DNA。核酸可以使用寡核苷酸類似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成。這類寡核苷酸可用於例如製備核酸，所述核酸具有改變的鹼基配對能力或提高的核酸酶抗性。
本發明的另一實施方案提供了經分離的核酸分子，所述核酸分子對caroase 01-05核酸分子(例如caroase 01-05核酸分子各自的編碼鏈)是反義的。本文所述核酸分子的互補鏈也包括在本發明範圍內。
序列錯誤 本文提供的序列信息不應當狹義地理解為要求包括錯誤鑑定的鹼基。本文公開的特定序列可容易地用於從真菌(特別是M.scorodonius)中分離完整基因，所述完整基因隨後可容易地被進行進一步的序列分析，從而鑑定序列錯誤。
除非另有說明，本文通過測序DNA分子測定的所有核苷酸序列都使用自動DNA測序儀測定，本文測定的由DNA分子編碼的多肽的所有胺基酸序列都通過將如上測定的DNA序列翻譯來預測。因此，如本領域針對通過該自動化途徑測定的任何DNA序列所已知的，本文測定的任何核苷酸序列可含有一些錯誤。通過自動化測定的核苷酸序列與所測序的DNA分子的實際核苷酸序列典型地至少約90％相同，更典型地至少約95％到至少約99.9％相同。可通過其他途徑(包括本領域公知的手動DNA測序法)更精確地測定實際地序列。如本領域還已知的，被測定的核苷酸序列中與實際序列相比的單個插入或缺失會在核苷酸序列翻譯中引起讀碼框位移，從而從該插入或缺失開始，由所測定的核苷酸序列編碼的預測胺基酸序列會與所測序DNA分子編碼的實際胺基酸序列完全不同。
本領域技術人員能夠鑑定這類錯誤鑑定的鹼基並知道如何改正這類錯誤。
核酸片段、探針和引物 根據本發明的核酸分子可僅包含SEQ ID NO01-07中所示核酸序列的部分或片段，例如可用作探針或引物的片段，或編碼caroase 01-05蛋白質部分的片段。從克隆caroase 01-05基因和cDNA測定的核苷酸序列允許產生探針和引物，所述探針和引物被設計為用於鑑定和/或克隆其他caroase01-05家族成員，以及來自其他物種的caroase 01-05同源物。探針/引物典型地包含基本上純淨的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含核苷酸序列的區域，所述區域在高嚴格度條件下優選地與SEQ ID NO01-07中所示核苷酸序列或其任一的功能等價物的至少約12或15個，優選地約18或20個，優選地約22或25個，更優選地約30、35、40、45、50、55、60、65或75個或更多的連續核苷酸雜交。
基於caroase 01-05核苷酸序列的探針可被用於檢測例如在其他生物中編碼相同或同源蛋白質的轉錄物或基因組caroase 01-05序列。在優選的實施方案中，探針還包含與其結合的標籤基團，例如所述標籤基團可以是放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子。這類探針也可被用作診斷測試試劑盒的部分，用於鑑定表達caroase 01-05蛋白質的細胞。
同一性&同源性 術語「同源性」或「同一性百分比」在本文可互換使用。就本發明的目的而言，其在本文定義為為了測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，就最佳比較的目的將序列進行比對(例如可向第一胺基酸或核酸序列中引入缺口用於與第二胺基酸或核酸序列最佳比對)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是兩序列分享的相同位置數的函數(即同一性％＝相同位置/位置總數(即重疊位置)×100)。優選地，兩個序列長度相同。
技術人員應當知道下述事實可獲得若干種不同的電腦程式來測定兩個序列之間的同源性。例如，可通過使用數學算法完成兩個序列之間序列比較和同一性百分比的測定。在優選的實施方案中，用Needleman andWunsch(J.MoI.Biol.(48)444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權重和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個胺基酸序列之間的同一性百分比，所述算法已被整合進GCG軟體包(可得自http://www.accelrys.com/solutions/bioinformatician/)的GAP程序中。技術人員會理解所有這些不同的參數會產生稍微不同的結果，但是使用不同的算法時兩個序列之間的總體同一性百分比不會顯著改變。
還在另一實施方案中，用GCG軟體包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口權重和1、2、3、4、5或6的長度權重測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。在另一實施方案中，用E.Meyers and W.Miller(CABIOS，411-17(1989)的算法，使用PAM120重量殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的同一性百分比，所述算法已被整合進ALIGN程序(2.0版)中(可得自http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。
本發明的核酸和蛋白質序列可進一步被用作「查詢序列」針對公開資料庫進行搜索，來例如鑑定其他的家族成員或相關序列。這類搜索可使用例如Altschul，et al.(1990)J.MoI.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序進行(分值＝100，字長＝12)來獲得與本發明caroase 01-05核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可用XBLAST程序進行(分值＝50，字長＝3)來獲得與本發明caroase 01-05蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了就比較的目的獲得有缺口的比對，可使用如Altschul et al.，(1997)NucleicAcids Res.25(17)3389-3402中所述的Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。參閱http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
雜交 本文使用術語「雜交」旨在描述用於雜交和洗滌的條件，在所述條件下彼此至少約55％，至少約40％，至少約70％，更優選地至少約80％，進一步更優選地至少約85％到90％，更優選地至少95％同源的核苷酸序列典型地保持與彼此雜交。
這類雜交條件的優選的、非限制性實例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃下雜交，然後在1X SSC，0.1％SDS中50℃下(優選地在55℃下，優選地在60℃下，進一步更優選地在65℃下)洗滌一次或多次。
高嚴格度條件包括例如在68℃下5x SSC/5x Denhardfs溶液/1.0％SDS中雜交和在0.2x SSC/0.1％SDS中室溫下洗滌。或者洗滌可在42℃進行。
技術人員會知道應用於嚴格和高嚴格度雜交條件的條件。涉及這類條件的額外指導在本領域是容易獲得的，例如見Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；andAusubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley& Sons，N.Y.)。
當然，僅與Poly A序列(例如mRNA的3』端Poly(A)尾)或T(或U)殘基的互補串雜交的多核苷酸不包括在用於與本發明核酸的一部分特異雜交的多核苷酸中，因為這類多核苷酸會與含有Poly(A)串或其補體的任何核酸分子(例如實際上任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。
從其他生物獲得全長DNA 在典型的途徑中，可篩選從其他生物(例如絲狀真菌，特別是來自於Marasmius種)構建的cDNA文庫。
例如，可通過Northern印跡分析篩選Marasmius菌株中同源的caroase01-05多核苷酸。通過檢測與本發明多核苷酸同源的轉錄物，可使用本領域技術人員熟知的標準技術從分離自適當菌株的RNA構建cDNA文庫。或者可使用能夠與本發明caroase 01-05多核苷酸雜交的探針篩選全基因組DNA文庫。
可例如通過進行PCR(其使用以本文所述核苷酸序列為基礎設計的兩個簡併寡核苷酸引物池)分離同源的基因序列。
反應模板可以是通過反轉錄mRNA獲得的cDNA，所述mRNA從已知能表達或被預測能表達本發明多核苷酸的菌株中製備。PCR產物可以被亞克隆並測序，以確保擴增的序列代表了新的caroase 01-05核酸序列或其功能等價物的序列。
可使用PCR片段通過多種已知方法分離全長cDNA克隆。例如，被擴增的片段可以被標記並用於篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫。或者被標記的片段可被用於篩選基因組文庫。
也可使用PCR技術從其他生物分離全長cDNA序列。例如可按照標準方法從適當的細胞或組織來源分離RNA。可使用寡核苷酸引物對RNA進行反轉錄反應用於起始第一鏈合成，所述寡核苷酸引物對被擴增片段的5』端是特異的。
然後可使用標準的末端轉移酶反應對得到的RNA/DNA雜交體「加尾)」(例如用鳥嘌呤)，所述雜交體可以用Rnase H消化，然後開始第二鏈合成(例如用Poly-C引物)。因此，可容易地分離被擴增片段上遊的cDNA序列。關於有用的克隆策略的總數，參閱例如Sambrook et al.，上文；和Ausubel et al.，上文。
載體 本發明的另一方面涉及載體，優選地涉及表達載體，所述載體含有編碼caroase 01-05蛋白質或其功能等價物的核酸。本文使用術語「載體」是指能夠轉運其所連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可連接額外的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區段可被連接進病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加體哺乳動物載體)通過引入宿主細胞被整合進宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起被複製。另外，某些載體能夠指導與它們可操作連接的基因的表達。這類載體在本文中稱作「表達載體」。通常，重組DNA技術中使用的表達載體常常是質粒的形式。術語「質粒」和「載體」在本文可互換使用，因為質粒是載體最常應用的形式。然而，本發明旨在包括具有等價功能的其它形式的表達載體，如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
本發明的重組表達載體以適合核酸在宿主細胞中表達的形式包含本發明的核酸，這意味著重組表達載體包括以要用於表達的宿主細胞為基礎所選擇的一個或多個調節序列，所述調節序列與待表達的核酸序列可操作地連接。在重組表達載體中「可操作地連接」旨在表示感興趣的核苷酸序列與調節序列以允許核苷酸序列表達的方式連接(例如當載體被引入宿主細胞中時，在體外轉錄/翻譯體系中或在宿主細胞中)。術語「調節序列」旨在包括啟動子、增強子和其他表達調控元件(例如多腺苷酸化信號)。這類調節序列描述於例如Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。調節序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列組成型表達的序列，和僅在某一宿主細胞中指導核苷酸序列表達的序列(例如組織特異調節序列)。本領域技術人員應當明白表達載體的設計可取決於如下因素待轉化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白質表達水平等。本發明的表達載體可被引入宿主細胞中，從而生產由本文所述的核酸編碼的蛋白質或多肽(例如caroase 01-05蛋白質，caroase 01-05蛋白質的突變體形式，其片段、變體或功能等價物，融合蛋白等)。
本發明的重組表達載體可以被設計為用於在原核或真核細胞中表達caroase 01-05蛋白質。例如，caroase 01-05蛋白質可以在真菌細胞、細菌細胞如E.coli、昆蟲細胞(使用杆狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。合適的宿主細胞在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中進一步被討論。或者重組表達載體可以被體外轉錄和翻譯，例如使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。
本發明中有用的表達載體包括來自染色體、附加體和病毒的載體，例如來自細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如杆狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉錄病毒)的載體和來自其組合的載體(如來自質粒和噬菌體遺傳元件的載體，如粘粒和噬菌粒)。
DNA插入物可與合適的啟動子(如噬菌體λPL啟動子，E.coli lac、trp和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和逆轉錄病毒LTR的啟動子，僅列出一些)可操作地連接。其他合適的啟動子應是技術人員已知的。在特定的實施方案中，優選使用能夠在原核生物或絲狀真菌中指導過氧化物酶高表達水平的啟動子。這類啟動子是本領域已知的。表達構建體可含有用於轉錄起始、終止的位點和(在被轉錄的區域中)用於翻譯的核糖體結合位點。由構建體表達的成熟轉錄物的編碼部分應包含位於待翻譯多肽起點的轉錄起始AUG和適當地位於末端的終止密碼子。
載體DNA可通過常規的轉化或轉染技術被引入原核或真核細胞中。本文使用術語「轉化」和「轉染」旨在表示用於將外源核酸(例如DNA)引入宿主細胞的多種本領域認可的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉導、侵染、脂質轉染、陽離子脂質介導的轉染或電穿孔。用於轉化或轉染宿主細胞的合適方法可見於Sambrook，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其他實驗室手冊。
對穩定的轉染哺乳動物細胞而言，已知取決於所使用的表達載體和轉染技術，只有一小部分細胞可以將外源DNA整合進它們的基因組中。為了鑑定和選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標記(例如抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細胞。優選的可選擇標記包括賦予藥物(如G418、潮黴素和甲氨喋呤(methatrexate))抗性的標記。編碼可選擇標記的核酸可在編碼caroase 01-05蛋白質的相同載體上被引入宿主細胞，或可在單獨的載體上被引入。可通過藥物選擇來鑑定被引入的核酸穩定地轉染的細胞(例如引入了可選擇標記基因的細胞會存活，而其他細胞會死亡)。
原核生物中蛋白質的表達通常在E.coli中使用含有組成型或誘導型啟動子的載體完成，所述啟動子指導融合或非融合蛋白質的表達。融合載體對其中被編碼的蛋白質添加大量胺基酸(例如添加至重組蛋白質的氨基端)。這類融合載體典型地為三個目的服務1)提高重組蛋白質的表達；2)提高重組蛋白質的溶解度；和3)通過在親和純化中作為配體來幫助重組蛋白質的純化。通常在融合表達載體中，在融合部分的接點和重組蛋白中引入蛋白水解切割位點，使得能夠從融合部分分離重組蛋白，隨後純化融合蛋白。這類酶及其同源的識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。
如所指出的，表達載體應優選地含有可選擇標記。這類標記包括用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，和用於在E.coli和其他細菌中培養的四環素或氨苄青黴素抗性。適當宿主的代表性實例包括細菌細胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium；真菌細胞如酵母；昆蟲細胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；動物細胞如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；和植物細胞。用於上述宿主細胞的適當培養基和條件是本領域已知的。
載體中，優選在細菌中使用的是可得自Qiagen的pQE70、pQE60和PQE-9；可得自Stratagene的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A和可得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。載體中優選的真核載體是可得自Stratagene的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1和pSG；和可得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。技術人員應當容易地知道其他合適的載體。
在已知的細菌啟動子中，用於本發明的包括E.coli lacl和lacZ啟動子，T3和T7啟動子，gpt啟動子，lambdaPR、PL啟動子和trp啟動子，HSV胸苷激酶啟動子，早期和晚期SV40啟動子，逆轉錄病毒LTR啟動子如Rous肉瘤病毒(″RSV″)的啟動子和金屬硫蛋白啟動子如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。
可通過向載體中插入增強子序列提高高等真核生物對編碼本發明多肽的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約從10到300bp，其作用於提高啟動子在給定宿主細胞類型中的轉錄活性。增強子的實例包括SV40增強子(其位於複製起點後側bp 100到270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點後側的多瘤增強子，和腺病毒增強子。
為了將經翻譯的蛋白質分泌進內質網腔中、壁膜間隙中或細胞外環境中，可將適當的分泌信號整合進表達的多肽中。該信號對多肽可以是內源的，或它們可以是異源信號。
可以以修飾的形式(如融合蛋白)表達多肽，並可不僅包括分泌信號，還包括額外的異源功能區。因此例如可向多肽N端添加額外的胺基酸(特別是帶電胺基酸)區以促進純化時或隨後的操作和儲存時在宿主細胞中的穩定性和持久性。還可向多肽添加肽殘基以便於純化。
宿主細胞 在另一實施方案中，本發提供了一種細胞，所述細胞為例如含有本發明核酸的經轉化宿主細胞或重組宿主細胞。「經轉化細胞」或「重組細胞」是通過重組DNA技術將本發明核酸引入其中(或引入其祖先中)的細胞。原核和真核細胞例如細菌、真菌、酵母等均被包括。
合適宿主細胞的實例為Microcystis，Lepista例如L.irina，Cyathus例如C.pallidus，Ganoderma例如G.applanatum，Ischnoderma例如I.Benzoinum，Marasmius例如M.scorodonius，Trametes例如T.versicolor的T.suaveolens，Cryptococcus例如C.laurentii，Hypomyces例如H.odoratus或Phaffia例如P.rhodozyma，Phanerochaete例如P.chrysosporium，Lentinula例如L.edodes，Coprinus例如C.cinereus，Gloeophyllum例如G.trabeum，Ophiostoma例如O.piliferum，Aspergillus例如A.niger、A.oryzae、A.nidulans，Thermomyces例如T.lanuginosa，Sporotrichum例如S.thermophile，Aureobasidium例如A.pullulans，Amorphotheca例如A.resinae，Leucosporidium例如L.scottii，Cunninghamella例如C.elegans。
特別優選的是來自絲狀真菌，特別是Aspergillus(例如Aspergillusoryzae或Aspergillus niger)和Marasmius(例如Marasmius scorodonius)的細胞，或來自酵母如Pichia(例如Pichia Pastoris)的細胞，或來自細菌的細胞。
可選擇下述宿主細胞，所述宿主細胞調節被插入序列的表達，或以特異的、所期望的方式修飾和加工基因產物。蛋白質產物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進蛋白質發揮最佳功能。
多種宿主細胞具有用於蛋白質和基因產物翻譯後加工和修飾的特徵性和特異的機制。分子生物學和/或微生物學領域技術人員熟悉的適當細胞系或宿主體系可以被選擇，以確保所表達的外源蛋白質的所期望的和正確的修飾和加工。為此，可使用具有下述細胞機制(cellular machinery)的真核宿主細胞，所述細胞機制用於適當地加工原始轉錄物、糖基化和磷酸化基因產物。這類宿主細胞是本領域公知的。
宿主細胞還包括，但不限於哺乳動物細胞如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡叢細胞系。如果需要，根據本發明的多肽可通過被穩定轉染的細胞系生產。公眾可獲得大量適用於穩定轉染哺乳動物細胞的載體，用於構建這類細胞系的方法也是公眾已知的，例如在Ausubel et al.(上文)中。
根據本發明的多肽在工業方法中的用途 本發明的另一方面包括本發明的多肽或其功能等價物(下文稱作漂白酶)在工業方法中的用途，例如用作去汙劑、酶石洗滌方法或食物(例如烘焙產品或乳製品)生產。
本發明的多肽可被作為酶製劑使用，或由能夠生產所述酶的微生物原位生產。酶製劑可來自多種來源，例如來自植物、動物和微生物。優選地，所述酶製劑來自微生物，因為微生物允許以受控的方式以工業規模獲得所述酶。可通過選定的細菌菌株的經典發酵過程，或通過發酵過表達本發明多肽的微生物獲得來自微生物的酶製劑。所述微生物可以是細菌、真菌或酵母。用作非經典發酵中宿主細胞的合適微生物的實例參見上面對宿主細胞的討論。
酶製劑也可包含其他合適的酶，如例如氧化還原酶、澱粉酶、脂肪分解酶、水解酶。已經驚人地發現氧化還原酶(例如己糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、麥芽糖氧化酶或葡萄糖氧化酶)的組合特別地對本發明漂白酶的酶活性具有協同效應。氧化還原酶可得自不同的來源，包括微生物。優選地使用來自真菌來源的氧化還原酶，例如來自絲狀真菌。合適的氧化還原酶是可得自例如Aspergillus種(如Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶。本發明因此還涉及本發明多肽與氧化還原酶的新穎酶組合。
如果應用中存在氧化還原酶對其有活性的底物，則使用本發明的酶製劑的應用中該效應被進一步增強。如果所述底物不存在，則其也可以被添加至方法中。這類底物的實例是在使用己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶時添加葡萄糖。本發明因此也涉及新穎的組合物，所述組合物包含酶製劑(其含有本發明多肽的)和氧化還原酶以及所述氧化還原酶的底物。
本發明還涉及新穎的酶組合和新穎的組合物在下文所述的本發明食品生產方法中的用途。
令人驚奇的是，我們發現根據本發明的多肽或其功能等價物可被用於提高食品的至少一部分的白度。優選地，本發明的漂白多肽被用於以下的食物生產方法中。用於生產食品的方法(其中所述食品的中間體形式包含色素)包括以下述用量添加至少一種本發明的多肽，與其生產中未添加所述酶的食品比，所述用量有效提高了食品的至少一部分的白度。
食品的中間體形式在本文被定義為生產過程中獲得食品最終形式之前產生的任何形式。中間體形式可包含所使用的個體原料和/或其混合物和/或與添加劑和/或操作助劑的混合物，或其隨後被加工的形式。
本發明的多肽以有效用量被添加。技術人員可通過改變酶劑量並測量色素降解和/或最終食品的白度提高而容易地確定該有效用量。如果所述酶能夠轉化β-胡蘿蔔素，則酶的有效用量可以按照β-降解單位來表達(例如Aziz或Zorn單位，參閱「材料和方法」) 可以從至少一種原料製造食品，所述原料為植物來源，如小麥麵粉。後者已知含有色素如類胡蘿蔔素(胡蘿蔔素和葉黃素)和黃酮，它們導致烘焙出的麵包的碎屑顏色。或者，這些色素可來自除植物原料以外的其他來源，例如來自乳。類胡蘿蔔素的實例是帶有胡蘿蔔素主鏈的其他物質，特別是帶有β-胡蘿蔔素或辣椒紅素主鏈，更特別地是α-和β-胡蘿蔔素、葉黃質、番茄紅素、百合黃素、辣椒紅素、玉米黃素、堇黃素(violaxanthin)、蝦青素、角黃素(canthaxanthin)、黃黃素(luteoxanthin)、新黃素和各自的脫-類胡蘿蔔素。
本發明方法的優選食品是從小麥麵粉和/或來自其他穀物來源麵粉烘焙的麵包和其他烘焙產品。例如，對於烘焙的食品麵包而言，中間體形式包括例如小麥麵粉，其與其他麵包成分如水、鹽、酵母和麵包改良組合物的原始混合物，混合的生麵團，揉過的生麵團，發酵的生麵團和部分烘焙的生麵團。如果酶能夠轉化β-胡蘿蔔素，則將酶以下述用量加入小麥麵粉和/或來自其他穀物來源的麵粉或加入與其他麵包成分的任何原始混合物中，所述用量給予每千克麵粉1和5000之間Zorn單位，優選地每千克麵粉5和1000之間Zorn單位，更優選地每千克麵粉10和500之間Zorn單位，最優選地每千克麵粉25和250之間Zorn單位。所述酶也可以與麵包改良混合物一起或作為其中的部分被添加，所述混合物是與其他生麵團和/或本領域已知的麵包改良操作助劑的混合物，所述麵包改良操作助劑例如是本領域已知的一種或多種酶，例如澱粉酶如α-澱粉酶、β-澱粉酶、澱粉葡萄糖酶、防腐麥芽糖α-澱粉酶，脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶，氧化酶如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、漆酶、吡喃糖氧化酶、碳水化合物氧化酶，半纖維素酶如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶，纖維素分解酶如內葡聚糖酶(如纖維素酶)、纖維二糖水解酶，蛋白酶和/或本領域已知的化學操作助劑如還原和氧化劑(例如脫落酸、穀胱甘肽)、乳化劑(例如DATEM)等等。
在一些類型的麵條中，白色產物是人們所期望的。例如對麵粉而言，中間體形式包括例如小麥麵粉，其與水、鹽和其他麵條成分的原始混合物，混合的生麵團和最終麵條產物，所述最終麵條產物可以是新鮮的、幹的、煮好的、蒸好的和/或油炸的。
食品也可以是乳製品。乳製品是指以乾燥固體計含有至少10wt％，優選地至少30wt％，更優選地至少50wt％，進一步更優選地至少70wt％或最優選至少80wt％的來源於乳的成分，優選牛乳。來源於乳的成分為例如脂肪、蛋白質例如乳清乾酪凝乳和酪蛋白等。乳(特別是牛乳)可天然地含有有色化合物，如類胡蘿蔔素，例如β胡蘿蔔素。
白度對例如乳酪、黃油、乳粉或乳清產物具有重要的作用。例如對於乳酪如Feta、Mozzarella、Ricotta和藍乳酪(例如Danish Blue、Roquefort或Gorgonzola)而言，白度被認為是所期望的。在山羊或綿羊乳至少部分地被牛乳取代的乳酪中，乳酪的白度會成為問題，因為牛乳中存在β-胡蘿蔔素。
對於一些乳酪而言，天然有色劑如胭脂樹紅或β-胡蘿蔔素被用作食物著色劑。然而，該著色劑也會存在於乳清中。當乳清被進一步加工為例如嬰兒配方時，乳清產品的顏色是不期望的。對於食品軟乳酪而言，中間體產物包括例如乳和乳酪凝乳。
可通過視覺或通過例如掃描的反射測定法來完成產物白度的測量。在反射測定法中，顏色用三個參數來定量L-因子(黑＝0到白＝100)、a-因子(綠＝-60到紅＝+60)和b-因子(藍＝-60到黃＝+60)。如果是類胡蘿蔔素，則所生產的產物的b-因子優選地儘可能接近0，優選地在10和0之間，更優選地在5和0之間，進一步更優選地低於1，最優選地低於0.5。另一方面，本發明提供可通過前文所述的本發明方法獲得的食品。這些食品特徵在於與通過下述生產方法獲得的食品相比至少部分具有顯著提高的白度，所述方法不包括添加一種或多種能夠轉化中間體產物中色素的酶。
另一方面，本發明提供能夠轉化色素的酶用於漂白食品(例如基於麵粉或來自乳的產物)的用途。令人驚奇的是發現這些酶可有利地用作家居去汙劑中的汙漬去除劑。特別地，所述酶被證明對去除棉和合成(例如聚酯)織物上的有色汙漬(例如草漬、咖啡和茶漬)非常有效。另外，所述酶還可用於酶石漂白方法中，例如將藍色牛仔的錠藍染料漂白至所期望的水平。
材料和方法 測量β-胡蘿蔔素的轉化 根據Aziz測量β-胡蘿蔔素降解 可根據A.Ben Aziz(1971)，Phytochemistry 10，1445將酶活性測定為β-胡蘿蔔素轉化活性。一個酶單位定義為每分鐘轉化1微克β-胡蘿蔔素的酶量(也稱作Aziz單位)。
根據Zorn測量β-胡蘿蔔素降解 也可根據Zorn et al(2003)，Appl.Microbiol.Biotechnol.62331-336將酶活性測定為β-胡蘿蔔素轉化活性。一個酶單位定義為每分鐘轉化1微摩爾β-胡蘿蔔素的酶量(也稱作Zorn單位)。如下進行測定將1.5ml含酶樣品在樣品池中27℃下預孵育5分鐘，然後加入100μl β-胡蘿蔔素儲存溶液(參閱下文)。必要時，用檸檬酸/磷酸鹽緩衝液pH 5.5(該緩衝液通過將43ml 0.1M檸檬酸與56ml 0.2M Na2PO4溶液混合製備)稀釋濃縮的培養上清液。使用分光光度計在溫度受控的試池架(cell holder)中在450nm和27℃下監控吸光度在15分鐘內的降低。檢查曲線的線性，用曲線的線性部分根據以下等式計算酶活性 酶活性[mU/ml]＝(ΔE×Vt)×106/(Vs×d×ε) 其中U＝上文定義的酶活性；ΔE＝450nm下每分鐘吸光度的降低；Vt＝樣品池中的總體積(ml)；Vs＝樣品池中的樣品體積(ml)；ε＝β-胡蘿蔔素的消光係數，其為95,000M-1cm-1；d＝樣品池厚度(cm)] 可以通過將Aziz單位除以β-胡蘿蔔素的分子量(＝536.85)將Aziz酶單位轉化為Zorn單位。
製備β-胡蘿蔔素儲存溶液 如下製備β-胡蘿蔔素儲存溶液將5mg β-胡蘿蔔素和500mgTween-80溶解於50ml二氯甲烷中。在旋轉蒸發器中在40℃和800mbar下將二氯甲烷蒸發。當幾乎所有二氯甲烷被蒸發時，加入30ml水，殘餘的二氯甲烷在旋轉蒸發器中、最後在氮氣流中排出。過濾得到的溶液並用水在有刻度的燒瓶中補充至50ml。溶液在冷藏(冰箱)中保存，僅穩定若干天。
漂白食品 如Gelinas，Cereal Chem.75，810-184(1998)所述從碎屑或生麵團中抽提類胡蘿蔔素後測定漂白。如Gelinas(1998)所述通過從麵包屑中抽提總脂質測定類胡蘿蔔素。
食品白度可通過視覺測定或通過反射測定法測定。視覺檢查可通過將添加了漂白酶的食品與未添加漂白酶的對照比較來進行。反射測定法可通過在彩色掃描儀(Hewlett Packard ScanJet ADF)上掃描食品來進行。這些數據可使用LabSMART(LabSMART，LLC，Logan Utah，USA)程序分析。
實施例1 得自Marasmius scorodonius的β-胡蘿蔔素轉化酶的培養及活性測定 如Zorn et al.(2003)所述培養得自Marasmius scorodonius的β-胡蘿蔔素轉化酶caroase-1和caroase-2並測定其活性。為此，使用來自Marasmiusscorodonius培養物的菌絲體(得自Centraal Bureau voor Schimmelcultures-Utrecht，荷蘭，保藏號CBS 137.83)接種補充有乳化的β-胡蘿蔔素的瓊脂平板。將平板在24℃下孵育14天。用菌絲體接種含100ml標準營養溶液(SNL，含有30g/升葡萄糖·H2O；4.5g/升天冬醯胺·H2O；1.5g/升KH2PO4；0.5g/升MgSO4；3.0g/升酵母提取物；1ml/升滅菌的微量元素溶液，其含有5mg/l CuSO4*5aq、80mg/l FeCl3*6aq、90mg/l ZnSO4*7aq、30mg/l MnSO4*1aq和40mg/l EDTA；滅菌前用1N NaOH將pH調節至6.0)的300ml燒瓶，在150rpm的搖床中於24℃下孵育7天。檢查預培養物不含細菌汙染物，通過Ultra Turrax勻化並用於接種主要培養物(500ml Erlenmeyer燒瓶中250ml)。第二天起每天取出2ml樣品，離心去除菌絲體，在分光光度計測定法中測量活性。培養4天後，每升無細胞上清液的β-降解活性大約為0.3Zorn單位。
實施例2 H2O2對得自M.scorodonius的β-胡蘿蔔素轉化酶caroase-1和caroase-2活性的影響 如上所述在體外β-胡蘿蔔素降解試驗中測定10微升20mM過氧化氫(H2O2)的影響。使用含有caroase-1和caroase-2的M.scorodonius濃縮培養上清液。存在H2O2時β-胡蘿蔔素降解活性從4.3提高至10.9mU。使用熱滅活酶時，完全沒有觀察到β-胡蘿蔔素降解。這清楚地說明H2O2刺激β-胡蘿蔔素降解酶的β-胡蘿蔔素降解活性。
實施例3 Aspergillus niger葡萄糖氧化酶(GOX)對得自M.scorodonius的caroase-1和caroase-2活性的影響 將50微升濃縮的M.scorodonius培養上清液與1290微升50mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.5)混合。加入160微升500mM的葡萄糖溶液，將混合物在27℃調節5分鐘。Aspergillus niger葡萄糖氧化酶得自Fluka。通過添加0-2微升的葡萄糖氧化酶儲存液(100U/ml，對應於0-200mU GOX的活性)和100微升β-胡蘿蔔素溶液(如上文「材料和方法」中所述製備)起始反應。在27℃下記錄10分鐘450nm處吸光度降低(表1)。
表1在存在50mM葡萄糖和多種劑量GOX時使用濃縮的M.scorodonius培養上清液降解β-胡蘿蔔素 在第二組實驗中，改變葡萄糖的濃度而保持葡萄糖氧化酶活性的量不變。因此，將50微升濃縮的M.scorodonius培養上清液與1434到1290微升50mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.5)混合，加入16-160微升的500mM葡萄糖溶液(表2)。將混合物在27℃保持5分鐘，通過添加0-1微升GOX(對應於0到100mU的活性)和100微升β-胡蘿蔔素溶液起始反應。
表2在存在多種濃度的葡萄糖和100mU劑量的葡萄糖氧化酶時使用濃縮的M.scorodonius培養上清液降解β-胡蘿蔔素 空白樣品(50mM葡萄糖，100mU GOX，不添加培養上清液)中未觀察到β-胡蘿蔔素降解。
這些實驗闡明存在葡萄糖時，GOX的存在強烈地刺激M.scorodonius濃縮上清液對β-胡蘿蔔素的降解。
實施例4和比較例A、B和C 小狗麵包(Pup loaf)烘焙測試 在標準的烘焙方法中，小狗麵包由200g小麥麵粉(160g小麥麵粉(

-Meneba，荷蘭)和40克小麥麵粉(

Meneba，荷蘭)的混合物)、1.4g

乾酵母(DSM Bakery Ingredients，Delft，荷蘭)、4g鹽、50ppm抗壞血酸、4ppm真菌α-澱粉酶

P500(DSM FoodSpecialties，Delft，荷蘭)、60ppm真菌半纖維素酶

HS2000(DSM Food Specialties，Delft，荷蘭)和表3所示數量的β-胡蘿蔔素降解酶和116ml水在多葉攪拌機(pin mixer)中攪拌6分15秒製成。生麵團溫度為28℃。混合後直接將生麵團分為各150g的兩塊，弄圓，在30℃的醒發室中醒發45分鐘，成形並裝盤。在30℃最後醒發70分鐘後，將麵團在225℃烘焙20分鐘。
在封閉盒中室溫下儲存24小時後，由烘焙師評價碎屑品質和烘焙的麵包的顏色；如表4中所示在抽提麵包屑後測定類胡蘿蔔素的量。
表3.酶劑量(表達為每200克麵粉的Zorn單位) 表4.麵包中類胡蘿蔔素含量和視覺鑑定 從表4可以得出結論通過向生麵團中添加本發明的漂白酶，類胡蘿蔔素被降解，導致更白的碎屑。本發明方法的效率優於所使用的大豆酶脂肪氧化酶2，並至少等於或優於使用酶活性大豆粉。
實施例5 製備小乳酪 如Shakeel-Ur-Rehman et al.(Protocol for the manufacture of miniaturecheeses in Lait，78(1998)，607-620)所述生產小乳酪。通過在36℃加熱30分鐘對原料牛乳巴氏消毒。將經巴氏消毒的乳轉移至廣口塑料離心瓶(每瓶200ml)中並冷卻至31℃。然後向離心瓶中每200ml經巴氏消毒的乳中加入0.72ml的起子培養物DS 5LT1(DSM Gist B.V.，Delft，荷蘭)，使乳熟化20分鐘。然後加入CaCl2(每200ml成熟的乳中加入132μL的1mol.L-1溶液)，隨後加入促凝劑(每ml 0.04IMCU)。如果試驗涉及使用caroase-01和caroase-02，則將該酶與促凝劑一起添加。
將乳溶液在31℃保持40-50分鐘，直到形成凝塊。用拉長鋼絲的切刀將凝塊手工切開，結構上間隔1cm。允許其癒合2分鐘，然後溫和攪拌10分鐘。之後持續攪拌凝乳/乳清混合物下，在30分鐘內將溫度逐漸上升至39℃。達到pH 6.2後，在室溫下以1,700g將凝乳/乳清混合物離心60分鐘。將乳清的水分排乾並在水浴中保持在36℃。每15分鐘將乳清倒置，直到pH降至5.2-5.3，然後在1,700g室溫下離心20分鐘。進一步排乾乳清水分後，通過掃描測定乳酪漂白。漂白酶caroase-01和caroase-02的使用產生了更白的乳酪。
序列表
帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司
用於酶漂白食品的新穎酶
24866WO
17
PatentIn version 3.1
1
1536
DNA
Marasmius scorodonius
1
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2
1534
DNA
人造序列

針對A.niger宿主最優化的密碼子
2
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1542
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Marasmius scorodonius
3
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4
1543
DNA
人造序列

針對A.niger宿主最優化的密碼子
4
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1527
DNA
Marasmius scorodonius
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cagcgtgtac ctgaattcga caaattcctg caagaccacg ctcttaacat gccgaatatg900
acatctgaac aaggtgctga gctcctaggc tccaggatgg tggggcgatg gaaaagtggt960
gctccaatcg atctcactcc gttggtcgat gacccggagt tggctgctga ccctcagcga1020
aataacaact tcgacttttc tgacgccacg aatcagacac gttgcccttt ctctgctcat1080
atccgtaaga ctaacccgcg cgctgatctt gggggtattg ataacttccc gacgcgtcac1140
ataatccgag cgggaattcc atatggaccc gaagttaccg acgctgaaaa agcgtcaaat1200
agctctagca cagaccctag tctggagcgt ggtctggcgt ttgtggccta tcagtctaat1260
atcaagaacg cattcgtatt ccttcaacag acttgggttg ataatgcgaa cttctttagg1320
accaacactg gggcagatcc tatcataggt accctgtcga acaagaacgg caatctcccc1380
aacacgcctc gtaatgttag cggtctggat cctaacaatc ccaccggccc ccccaccgaa1440
atcgaccttg actttgttgt ttctcgtggt ggagaatact tcttttcgcc ctccctttcc1500
gcgatcagga ctgtgctttc agtctag1527
6
1542
DNA
Marasmius scorodonius
6
atgaagcttt tttctgcctc cgtttttgct gctatcgtcg ctagtcacta tgcgtcagcg60
actgcccaca tcagggctcc caatgtgaag ccaaggagga caaactcact tctgattact120
ccccctcaac agcctccgct tccatctgct caacaggctg caagtgcctc tagcagtgct180
ggcttgaatc tcaccgacat tcagggtgat attctgatcg gcatgaagaa gaacaaggaa240
ctattcttct tcttcagtgt caccgacgca gctactttca aggctaagct gggatccgac300
attcttggac taatcacatc caccgatcag ctacttgcta atgatactca gcctgtcacg360
gctgtcaacg tcactttctc tagcactggc ctcaaggcat tgggtatcac agatgatctg420
aaggatcctg tcttcgaggc cggaatgctc agcaacgcag tgagcgactt gagcgatcca480
gggaccggca attgggtccc tgggtttgtc ggcaccagtg ttcatggcgt tttcctactt540
gcatcggaca ccattgacaa tgtaaacacc gagctggcca acatccaaac catttcgaat600
ggctcgatca cggagattca tcgtttacaa ggggaggctc gacccggtga ccagcaaggt660
cacgaacact ttggattcat ggatggaatc agtaacccgg ccgttgatgg atttacacct720
ccagcggaaa taagacctgg acaagcttta attccgcctg gtatcatgct tctcggagag780
gcaaacgaca cttttcagaa tgatcgtcct ccgtgggcca aagatggttc cttccttgtc840
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aacatgccga atatgacatc cgagcaaggc gctgatctcc ttggtgccag gattgtagga960
cgatggaaaa gtggtgctcc tattgacctc actccgttgg tcgatgaccc agtgttggct1020
gctgacaatc agcgaaataa caacttcgac ttttctgtcg ccacgaatca gacacgttgc1080
cctttctctg ctcatatccg caaggctaac ccgcgcggcg atcttggggg tattaataaa1140
ttcccaaacc aacacataat ccgagcggga attccgtatg gacccgaagt taccgacgct1200
gaaaaagcgt caaatagctc tagcactgac cctagtctgg agcgtggtct ggcgtttgtg1260
gcctatcagt ctaatatcca gaacggattc gtattccttc aaaagaattg ggttgataat1320
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7
1536
DNA
Marasmius scorodonius
7
agtatgcggc tcacttacct tcccttgttt gcgggcatcg ccatccagtc tgcatgtgcc60
tttccaaact tctctaagtc ttccatatta aagcctcgta ggacgaactc cctactaatc120
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gctattctcc ctcttatcgc ctcgacgcaa cagctgcttg ctgttgccag ccagcctacc360
accgctgtca accttgcctt ctcccaaacc ggattgaatg cgctggggct tgctgctcaa420
ggcttggggg actccctctt tgccagtggt cagttcagcg gtgcacagag tctcggcgac480
ccgggaacct cgaactgggt ccaagcgttc gctggtacag gcatacatgg tgtcttcctt540
ctcgcatcgg ataccgtcga caacgtgaat gccgagctgt cgcaaatcca gtccatcttg600
ggaacctcca tcactgaggc gtaccgcctt cagggtgagg ctcgtcccgg cgatcagcaa660
ggccacgaac atttcggatt catggacgga atcagcaacc ctgccatcga cggattctcc720
actgcgctgc ctggtcaagc cgttctcagt cccggacttt tcctgctagg agaggacggc780
gatggttcct cgtcttcgcg tccgtcttgg gcaaaggacg gctctttcct tgctttccgc840
cagcttcaac agcgtgtccc agagttcaac aagttcctcg ctgacaacgc tgcgctaaca900
cagggtaacg ctgatcttct cggtgcccga atgatgggac ggtggaaatc tggtgctccg960
gtcgaccttg cccccaccgc ggatgatgtt gatctcgcta atgaccccca aaggaacaac1020
aacttcaact ttacccacgc cggtttcacc gagaccactg acgaaactca ctgccccttc1080
tccgctcaca tccgtaagac gaaccctcga tcggacttca acccccagaa caccaacaac1140
cacatcatcc gtgctggtat tccttacgga cctgaagtca ctgacgctga agcctcatcc1200
aacacgtcca gcacggacgc tagcctcgag cgtggcttgg ctttcgttgc ataccaatcg1260
aacattggca acggcttcgc attccttcaa caggcttggg ttgacaacgc aaacttcttc1320
ttcggaaaga ccaccccacc tggtgttgac cccatcatcg gctcggttgc tgcgcagaac1380
aacttcgccc ccaacggtcc ccgtcctgtg tccggacttg accccacaga ttcgaccaag1440
atcgtcacca taaacaccga cttcgtctct tctcgtggag gagaatactt cttctccccc1500
tcgctctctg cgatccagaa cacgctttct gtttga 1536
8
510
PRT
Marasmius scorodonius
8
Met Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ile Gln Ser
1 5 10 15
Ala Cys Ala Phe Pro Asn Phe Ser Lys Ser Ser Ile Leu Lys Pro Arg
20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Asn Pro Asp Ala Gln Pro Asp Leu Pro
35 40 45
Thr Ala Lys Gln Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ser Val Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
65 70 75 80
Met Phe Phe Phe Phe Ser Ile Ala Asp Ala Ala Ala Phe Lys Ser His
85 90 95
Leu Gly Ser Ala Ile Leu Pro Leu Ile Thr Ser Thr Gln Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Val Ala Ser Gln Pro Thr Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Gln
115 120 125
Thr Gly Leu Asn Ala Leu Gly Leu Ala Ala Gln Gly Leu Gly Asp Ser
130 135 140
Leu Phe Ala Ser Gly Gln Phe Ser Gly Ala Gln Ser Leu Gly Asp Pro
145 150 155 160
Gly Thr Ser Asn Trp Val Gln Ala Phe Ala Gly Thr Gly Ile His Gly
165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Val Asp Asn Val Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Ser Gln Ile Gln Ser Ile Leu Gly Thr Ser Ile Thr Glu Ala Tyr Arg
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe
210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr
225 230 235 240
Ala Leu Pro Gly Gln Ala Val Leu Ser Pro Gly Leu Phe Leu Leu Gly
245 250 255
Glu Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Arg Pro Ser Trp Ala Lys Asp
260 265 270
Gly Ser Phe Leu Ala Phe Arg Gln Leu Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe
275 280 285
Asn Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ala Ala Leu Thr Gln Gly Asn Ala Asp
290 295 300
Leu Leu Gly Ala Arg Met Met Gly Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Val
305 310 315 320
Asp Leu Ala Pro Thr Ala Asp Asp Val Asp Leu Ala Asn Asp Pro Gln
325 330 335
Arg Asn Asn Asn Phe Asn Phe Thr His Ala Gly Phe Thr Glu Thr Thr
340 345 350
Asp Glu Thr His Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro
355 360 365
Arg Ser Asp Phe Asn Pro Gln Asn Thr Asn Asn His Ile Ile Arg Ala
370 375 380
Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala Glu Ala Ser Ser Asn
385 390 395 400
Thr Ser Ser Thr Asp Ala Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala
405 410 415
Tyr Gln Ser Asn Ile Gly Asn Gly Phe Ala Phe Leu Gln Gln Ala Trp
420 425 430
Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Phe Gly Lys Thr Thr Pro Pro Gly Val
435 440 445
Asp Pro Ile Ile Gly Ser Val Ala Ala Gln Asn Asn Phe Ala Pro Asn
450 455 460
Gly Pro Arg Pro Val Ser Gly Leu Asp Pro Thr Asp Ser Thr Lys Ile
465 470 475 480
Val Thr Ile Asn Thr Asp Phe Val Ser Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe
485 490 495
Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Gln Asn Thr Leu Ser Val
500 505 510
9
513
PRT
Marasmius scorodonius
9
Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His
1 5 10 15
Tyr Ala Ser Ala Thr Ala His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg
20 25 30
Arg Thr Ser Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro
35 40 45
Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
65 70 75 80
Leu Phe Phe Phe Phe Ser Val Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Asp Ile Leu Gly Leu Ile Thr Ser Thr Asp Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Asn Asp Thr Gln Pro Val Thr Ala Val Asn Val Ala Phe Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Asp Gly Leu Lys Asp Pro Val
130 135 140
Phe Glu Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro
145 150 155 160
Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ser Val His Gly
165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Asn Thr Glu Pro
180 185 190
Ala Asn Ile Gln Thr Ile Leu Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ile His Arg
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe
210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Val Asp Gly Phe Thr Pro
225 230 235 240
Pro Ala Glu Ile Arg Pro Gly Gln Ala Leu Ile Pro Pro Gly Ile Met
245 250 255
Leu Leu Gly Glu Ala Asn Asp Thr Phe Gln Asn Asp Arg Pro Pro Trp
260 265 270
Ala Lys Asp Gly Ser Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Ala
275 280 285
Pro Glu Phe Asn Lys Phe Leu Gln Asp His Ala Leu Asn Met Pro Asn
290 295 300
Met Thr Ser Glu Gln Gly Ala Asp Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gly
305 310 315 320
Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp
325 330 335
Pro Val Leu Ala Ala Asp Asn Gln Arg Asn Asn Asn Phe Asp Phe Ser
340 345 350
Asp Ala Thr Asn Gln Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys
355 360 365
Ala Asn Pro Arg Gly Asp Leu Gly Gly Ile Asn Lys Phe Pro Asn Gln
370 375 380
His Ile Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala
385 390 395 400
Glu Arg Ala Ser Agn Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly
405 410 415
Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile Gln Asn Gly Phe Val Phe
420 425 430
Leu Gln Lys Asn Trp Val Asp Asn Thr Asn Phe Phe Arg Pro Gly Thr
435 440 445
Gly Ala Asp Pro Leu Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Ser Gly Thr Asp
450 455 460
Ala Pro Asn Thr Pro Arg Val Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Asn Ala
465 470 475 480
Thr Ser Thr Ile Glu Ile Asp Ile Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly
485 490 495
Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Arg Thr Val Leu Ser
500 505 510
Val
10
508
PRT
Marasmius scorodonius
10
Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His
1 5 10 15
Tyr Val Ser Gly Thr Thr His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg
20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro
35 40 45
Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
65 70 75 80
Leu Phe Phe Phe Phe Ser Ile Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Asp Ile Leu Glu Leu Ile Thr Ser Thr Asn Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Val Ala Thr Gln Pro Ile Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Val Lys Asp Asp Leu Asn Asp Thr Val
130 135 140
Phe Asp Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro
145 150 155 160
Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ala Val His Gly
165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Leu Asp Asn Val Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Ala Asn Ile Gln Thr Ile Leu Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ile His Arg
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe
210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr
225 230 235 240
Arg Leu Pro Gly Gln Ala Leu Leu Pro Pro Gly Leu Met Phe Leu Gly
245 250 255
Glu Ala Asn Asp Thr Val Ser Arg Pro Pro Trp Ala Lys Asp Gly Ser
260 265 270
Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe Asp Lys
275 280 285
Phe Leu Gln Asp His Ala Leu Asn Met Pro Asn Met Thr Ser Glu Gln
290 295 300
Gly Ala Glu Leu Leu Gly Ser Arg Met Val Gly Arg Trp Lys Ser Gly
305 310 315 320
Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp Pro Glu Leu Ala Ala
325 330 335
Asp Pro Gln Arg Asn Asn Asn Phe Asp Phe Ser Asp Ala Thr Asn Gln
340 345 350
Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro Arg Ala
355 360 365
Asp Leu Gly Gly Ile Asp Asn Phe Pro Thr Arg His Ile Ile Arg Ala
370 375 380
Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala Glu Lys Ala Ser Asn
385 390 395 400
Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala
405 410 415
Tyr Gln Ser Asn Ile Lys Asn Ala Phe Val Phe Leu Gln Gln Thr Trp
420 425 430
Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Arg Thr Asn Thr Gly Ala Asp Pro Ile
435 440 445
Ile Gly Thr Leu Ser Asn Lys Asn Gly Asn Leu Pro Asn Thr Pro Arg
450 455 460
Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Asn Pro Thr Gly Pro Pro Thr Glu
465 470 475 480
Ile Asp Leu Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe Phe Ser
485 490 495
Pro Ser Leu Ser Ala Ile Arg Thr Val Leu Ser Val
500 505
11
513
PRT
Marasmius scorodonius
11
Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His
1 5 10 15
Tyr Ala Ser Ala Thr Ala His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg
20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro
35 40 45
Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
65 70 75 80
Leu Phe Phe Phe Phe Ser Val Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Asp Ile Leu Gly Leu Ile Thr Ser Thr Asp Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Asn Asp Thr Gln Pro Val Thr Ala Val Asn Val Thr Phe Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Asp Asp Leu Lys Asp Pro Val
130 135 140
Phe Glu Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro
145 150 155 160
Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ser Val His Gly
165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Asn Thr Glu Leu
180 185 190
Ala Asn Ile Gln Thr Ile Ser Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ile His Arg
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe
210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Val Asp Gly Phe Thr Pro
225 230 235 240
Pro Ala Glu Ile Arg Pro Gly Gln Ala Leu Ile Pro Pro Gly Ile Met
245 250 255
Leu Leu Gly Glu Ala Asn Asp Thr Phe Gln Asn Asp Arg Pro Pro Trp
260 265 270
Ala Lys Asp Gly Ser Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Val
275 280 285
Pro Glu Phe Asn Lys Phe Leu Gln Asp His Ala Leu Asn Met Pro Asn
290 295 300
Met Thr Ser Glu Gln Gly Ala Asp Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gly
305 310 315 320
Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp
325 330 335
Pro Val Leu Ala Ala Asp Asn Gln Arg Asn Asn Asn Phe Asp Phe Ser
340 345 350
Val Ala Thr Asn Gln Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys
355 360 365
Ala Asn Pro Arg Gly Asp Leu Gly Gly Ile Asn Lys Phe Pro Asn Gln
370 375 380
His Ile Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala
385 390 395 400
Glu Lys Ala Ser Asn Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly
405 410 415
Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile Gln Asn Gly Phe Val Phe
420 425 430
Leu Gln Lys Asn Trp Val Asp Asn Thr Asn Phe Phe Arg Pro Gly Thr
435 440 445
Gly Val Asp Pro Leu Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Ser Gly Thr Asp
450 455 460
Ala Pro Asn Thr Pro Arg Val Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Asn Ala
465 470 475 480
Thr Ser Thr Ile Glu Ile Asp Ile Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly
485 490 495
Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Arg Thr Val Leu Ser
500 505 510
Val
12
510
PRT
Marasmius scorodonius
12
Met Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ile Gln Ser
1 5 10 15
Ala Cys Ala Phe Pro Asn Phe Ser Lys Ser Ser Ile Leu Lys Pro Arg
20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Asn Pro Asp Ala Gln Pro Asp Leu Pro
35 40 45
Thr Ala Lys Gln Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ser Val Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
65 70 75 80
Met Phe Phe Phe Phe Ser Ile Ala Asp Ala Ala Ala Phe Lys Ser His
85 90 95
Leu Gly Ser Ala Ile Leu Pro Leu Ile Ala Ser Thr Gln Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Val Ala Ser Gln Pro Thr Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Gln
115 120 125
Thr Gly Leu Asn Ala Leu Gly Leu Ala Ala Gln Gly Leu Gly Asp Ser
130 135 140
Leu Phe Ala Ser Gly Gln Phe Ser Gly Ala Gln Ser Leu Gly Asp Pro
145 150 155 160
Gly Thr Ser Asn Trp Val Gln Ala Phe Ala Gly Thr Gly Ile His Gly
165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Val Asp Asn Val Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Ser Gln Ile Gln Ser Ile Leu Gly Thr Ser Ile Thr Glu Ala Tyr Arg
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe
210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr
225 230 235 240
Ala Leu Pro Gly Gln Ala Val Leu Ser Pro Gly Leu Phe Leu Leu Gly
245 250 255
Glu Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Arg Pro Ser Trp Ala Lys Asp
260 265 270
Gly Ser Phe Leu Ala Phe Arg Gln Leu Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe
275 280 285
Asn Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ala Ala Leu Thr Gln Gly Asn Ala Asp
290 295 300
Leu Leu Gly Ala Arg Met Met Gly Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Val
305 310 315 320
Asp Leu Ala Pro Thr Ala Asp Asp Val Asp Leu Ala Asn Asp Pro Gln
325 330 335
Arg Asn Asn Asn Phe Asn Phe Thr His Ala Gly Phe Thr Glu Thr Thr
340 345 350
Asp Glu Thr His Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro
355 360 365
Arg Ser Asp Phe Asn Pro Gln Asn Thr Asn Asn His Ile Ile Arg Ala
370 375 380
Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala Glu Ala Ser Ser Asn
385 390 395 400
Thr Ser Ser Thr Asp Ala Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala
405 410 415
Tyr Gln Ser Asn Ile Gly Asn Gly Phe Ala Phe Leu Gln Gln Ala Trp
420 425 430
Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Phe Gly Lys Thr Thr Pro Pro Gly Val
435 440 445
Asp Pro Ile Ile Gly Ser Val Ala Ala Gln Asn Asn Phe Ala Pro Asn
450 455 460
Gly Pro Arg Pro Val Ser Gly Leu Asp Pro Thr Asp Ser Thr Lys Ile
465 470 475 480
Val Thr Ile Asn Thr Asp Phe Val Ser Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe
485 490 495
Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Gln Asn Thr Leu Ser Val
500 505 510
13
20
PRT
Marasmius scorodonius
13
Gly Leu Asn Leu Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys
1 5 10 15
Lys Asn Lys Glu
20
14
22
PRT
Marasmius scorodonius
14
Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe Gly Phe Met Asp
1 5 10 15
Gly Ile Ser Asn Pro Ala
20
15
17
PRT
Marasmius scorodonius
15
His Ile Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Glu
16
12
PRT
Marasmius scorodonius
16
Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile
1 5 10
17
19
PRT
Marasmius scorodonius
17
Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ile
權利要求
1.一種經分離的多肽，其具有漂白活性和選自以下的一種或多種特徵
a.根據SEQ ID NO08-12任一的經分離的多肽或其任一的功能等價物；
b.經分離的多肽，其可通過在適當的宿主細胞例如Aspergillus niger中表達下述物質獲得根據SEQ ID NO01-07任一的多核苷酸，或其任一的功能等價物，或包含所述多核苷酸或其任一功能等價物的載體，和
c.多肽，其至少包含SEQ ID NO13-17之一。
2.根據權利要求1的根據SEQ ID NO08-12的經分離多肽或其任一的功能等價物，所述功能等價物與SEQ ID NO08-12至少55％同源。
3.根據權利要求1的根據SEQ ID NO08-12的經分離多肽或其任一的功能等價物，所述功能等價物與SEQ ID NO08-12至少65％同源。
4.根據權利要求1-3中任一項的經分離多肽，所述多肽可得自Marasmius scorodonius。
5.一種經分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠與根據SEQ ID NO01-07的多核苷酸或其功能等價物雜交。
6.根據權利要求5的經分離寡核苷酸，所述寡核苷酸在高嚴格度條件下能夠與根據SEQ ID NO01-07的多核苷酸或其功能等價物雜交。
7.根據權利要求5或6的經分離多核苷酸，所述多核苷酸可得自真菌，優選地得自絲狀真菌。
8.根據權利要求7的經分離多核苷酸，所述多核苷酸可得自Marasmius，優選地得自M.scorodonius。
9.一種經分離的多核苷酸，其編碼根據權利要求1的多肽。
10.一種經分離的多核苷酸，其編碼根據SEQ ID NO08-12的多肽或其功能等價物的至少一個功能結構域。
11.一種經分離的多核苷酸，其包含根據SEQ ID NO01-07的核苷酸序列或其功能等價物。
12.根據SEQ ID NO01-07的經分離的多核苷酸。
13.一種載體，其包含根據權利要求5到12中任一項的多核苷酸序列。
14.根據權利要求13的載體，其中根據權利要求5到12中任一項的所述多核苷酸序列與調節序列可操作地連接，所述調節序列適用於所述多核苷酸序列在合適的宿主細胞中的表達。
15.根據權利要求14的載體，其中所述合適的宿主細胞是絲狀真菌或細菌。
16.一種用於製造根據權利要求5到12任一項的多核苷酸或根據權利要求13到15任一項的載體的方法，包括步驟培養用所述多核苷酸或所述載體轉化的宿主細胞，從所述宿主細胞分離所述多核苷酸或所述載體。
17.一種經分離的多肽，所述多肽能夠通過在適當的宿主細胞中表達根據權利要求5-12中任一項的多核苷酸或根據權利要求13-15中任一項的載體來獲得。
18.一種重組的漂白酶，其包含caroase 01-05多肽的功能結構域。
19.一種用於製造根據權利要求1到4或17任一項的多肽的方法，包括步驟用根據權利要求5到12任一項的經分離多核苷酸或根據權利要求13到15任一項的載體轉化合適的宿主細胞，在允許所述多核苷酸表達的條件下培養所述細胞，和可選地從所述細胞或培養基中純化所編碼的多肽。
20.一種重組的宿主細胞，其包含根據權利要求5到12中任一項的多核苷酸或根據權利要求13到15中任一項的載體。
21.一種重組的宿主細胞，其表達根據權利要求1到4或17中任一項的多核苷酸。
22.根據權利要求1到4或17中任一項的多肽的用途，用於與未使用多肽的食品相比提高食品的至少一部分的白度。
23.一種用於生產食品的方法，其中所述食品的中間體形式包含色素，所述方法包括以下述用量添加根據權利要求1到4或17中任一項的至少一種多肽，所述用量有效地將所述色素直接轉化為下述形式，所述形式導致與其生產時未添加所述多肽的食品相比，食品的至少一部分的白度提高。
24.根據權利要求23的方法，其中所述食品由麵粉製成，優選地由小麥麵粉製成。
25.根據權利要求23的方法，其中食品是乳製品。
26.根據權利要求23到25中任一項的方法，其中色素是類胡蘿蔔素。
27.根據權利要求23到26中任一項的方法，其中添加酶，所述酶是來自微生物的酶製劑或由能夠生產所述酶的微生物原位生產的酶製劑。
28.根據權利要求27的方法，其中添加酶，所述酶是來自細菌、真菌或酵母或由它們原位生產的酶製劑。
29.根據權利要求28的方法，其中所述真菌屬於Marasmius屬，優選地屬於Marasmius scorodonius。
30.根據權利要求23-29中任一項的方法，其中在生產食品時還額外地添加氧化還原酶。
31.能夠通過根據權利要求23到30中任一項的方法獲得的食品。
32.根據權利要求1到4或17中任一項的多肽直接將色素轉化為下述形式的用途，所述形式導致食品的至少一部分的白度提高。
33.根據權利要求1到4或17中任一項的多肽用於去汙劑或酶石漂白過程的用途。
全文摘要
本發明涉及根據caroase01-05的新穎的多肽或它們中任一的任何功能等價物，其適用於製備具有提高的白度的食品的方法；所述酶用於提高至少食品一部分的白度的用途；用於製備食品的方法，其中使用所述酶；和所獲得的食品。
文檔編號C12N9/00GK101223270SQ200680025579
公開日2008年7月16日 申請日期2006年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者霍爾格·佐恩, 馬諾拉·希爾本恩, 巴貝爾·胡爾斯旦, 拉夫·幹特爾·貝爾格, 萊克斯·博爾德, 羅埃爾弗·伯恩哈德·梅瑪 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司