利用自身真皮成纖維細胞修補皮膚和軟組織缺損的製作方法

2023-08-09 23:32:46

專利名稱：利用自身真皮成纖維細胞修補皮膚和軟組織缺損的製作方法
1.發明領域本方法涉及人類受治者皮膚和軟組織缺損，包括皺紋。更具體而言，它著重於一種可用於非外科技術中的可增加真皮或皮下組織體積的新材料。通過注射自身細胞懸液，本發明提供了下臨近(subadjacent)組織體積長期增加，而不具有現有材料的缺點。2.發明背景將一種材料(即注射劑)注入體內尤其是臉部來獲得美容效果可追溯到十九世紀末。例如通過注射石蠟來糾正輪廓缺陷在「一戰」前得到短期接受。但是併發症的存在，長期效果不理想使這種做法遭到放棄。可注射的矽氧烷的獲得使這一過程從本世紀六十年代起重演。特製的醫用矽氧烷溶液，例如Dow Corning MDX 4.4011，在實驗的基礎上在美國多個獲準的測試中心得到使用。對矽氧烷的局部和全身性反應，注射物的遷移，局部組織斷裂，已經限制了矽氧烷注射方法的應用。雖然這種方法的最初提議者仍然用有限的受治者來繼續他們的實驗計劃，但這種方法不可能被更多的外科和內科醫生接受。參見Matton，G.等發表於1985年Aesthetic Plastic Surgery 9卷133-140頁及Spira，M.和Rosen，T.發表於1993年Clin.Plastic Surgery 20卷181-9頁的綜述。
注射非生物材料的不良效果促使人們嘗試利用外源蛋白，尤其是牛膠原來作為注射物。雖然未加工的牛膠原給人體注射免疫原性太強，但如果病人經過預先篩選，排除了那些免疫反應性的病人，用酶降解去除牛膠原氮端或碳端肽，產生的「無末端膠原(atelocollagen)」的材料還是可以限量使用。製備和利用這些產品的描述可見美國專利3,949,073和4,424,208及4,488,911。該產品按35mg/ml及65mg/ml以ZYDERM牌無末端膠原溶液銷售。雖然它在世界範圍廣泛使用-例如在1987年美國有二十萬以上的人使用該產品，但在使用ZYDERM時，有90％以上的受治者產生抗牛抗體，大約1-3％的受治者產生明顯的免疫併發症。參見Delustro，F.等發表於1987年Plastic and reconstructive Surgery 79卷581頁的文章。
溶液態無末端膠原已證明不能完全令人滿意，因為該材料在幾周到幾月的時間裡會被受試者從注射部位吸收不被宿主材料替換。雖然有人考慮過用重複注射等方法，但這些方法因為牛無末端膠原產生免疫反應，其成本較高，病人抵制等原因而實際上應用有限。為了克服這些限制，牛無末端膠原可進一步加工先用戊二醛交聯，然後用細篩濾過並剪切。製備和利用這些產品的描述可見美國專利4,582,640和4,642,117。相應產品以ZYPLAST牌的交聯牛無末端膠原出售。交聯所期望提供的優點-增加對宿主降解的抵抗，也因產品粘性的增加而有所抵銷。粘性的增加，尤其是粘性不規則(團塊現象)使該產品更難以使用，甚至在某些方面無法使用。舉例可見美國專利5,366,498。
更為甚者，一些調查報告稱ZYPLAST和ZYDERM相比，注射效果的持久性僅有很少甚至沒有增加。它的注射效果的持續時間最多4-6月。參見Matti，B.A.和NIcolle，F.V.發表於1990年Aesthetic PlasticSurgery 14卷227-34頁以及Ozgentas，H.E.等發表於1994年Ann PlasticSurgery 33卷171頁的文章。大多數施治者的實驗結果表明4-6周以後，該注射物吸收很明顯。
牛膠原產品的免疫原性限制了人體使用，促使一些人考慮從胎盤中(舉例可見美國專利5,002,071和手術樣品中(舉例可見美國專利4,969,912以及5,332,802)提取人膠原。因為人膠原和牛膠原經受同樣的降解過程，需要進一步的交聯和其它化學修飾。
完全由受試者樣品衍生的人類膠原是可以製做，現以AUTOLOGENTM牌出售。無明顯證據表明注射人膠原比牛膠原產生的效果更持久。而且，利用自身的經加工的膠原也局限於整容外科手術的受治者。因為其製備起始材料是這個手術過程中取出的。明顯地，雖然自身的經加工的膠原消除了牛膠原的免疫原性，但它和牛膠原一樣不能保證長期治療效果。而且，它局限於動過手術的受治者。
另有人注射了一種明膠粉末和ε-氨基己酸以及受治者的血漿的混合物(稱作「FIBERELTM」)，作為無末端膠原的替代品來增加下臨近真皮組織。此為多中心試驗結果，參見1987年美國皮膚學會雜誌，16卷1155-62頁。
FIBRELTM增加軟組織的作用看起來部分依賴於誘導瘢痕性，炎性反應。參見Gold，M.H.發表於1994年J.Dermatologic Surg.Oncol.20卷586-90頁的文章。FIBRALTM的治療報告稱它們對部分病人有效，舉例可見Millikan，L.等發表於1991年J.Dermatologic Surg.Oncol.17卷223-29頁等文章。但因有團塊現象且效果不持久，FIBRELTM也不理想。FIBRELTM的應用也因伴隨注射的不適而受限，另外醫生們也發現它製備繁瑣。
總而言之，沒有一個現有的非生物可注射材料可以完全令人滿意地增加近鄰真皮和軟組織。
注射無末端膠原不能獲得長期的治療效果，使用FIBREL存在很多問題，這促使一些人去獲得並注射(移植)活體脂肪組織去增加下臨近真皮組織和軟組織的體積。把脂肪組織手術去除，然後手術重新植入人體，對於糾正大缺損可起到很好的效果---舉例可見McKinney，P.和Pandya.S.發表於1994年Anesthetic Plastic Surgery 18卷383-5頁以及Davies，R.E.等發表於1995年Arch of Otolaryngology--Head NeckSurgery 12195-100的文章。但是，需要通過注射來放置移植物的修補，其效果註定不容樂觀---可見Eresk，R.A.等發表於1991年PlasticReconstructive Surgery 87卷219-27頁的文章。因此，雖然對其效果有正面報導---舉例可見於Hambley，R.M和Carruthers，J.A.發表於1992年J.Derm.Surgery Oncol.18卷963-8頁的文章，該方法的創立者承認，對於大多數開業醫生而言，該技術的效果並不令人滿意---可見Lewis，C.M.發表於1993年J.Aesthetic Plastic Surgery 17卷109-12頁的文章。醫生和病人常碰到的問題有效果不可預測；團塊現象---它使這個操作不宜於治療細小的皺紋；注射後一段時期內局部極度腫脹---這一般持續4-6周。3.發明概述本發明提供了一種將自身真皮成纖維細胞注射到缺損附近的真皮和皮下組織而糾正受治者皮膚美容整容方面缺損的方法。可用這種方法糾正的典型缺損有皮紋(rhytid)，皮膚擴張紋(stretch mark)，凹陷性瘢痕，非創傷性皮膚凹陷，普通粉刺瘢痕，唇發育不良。依照本方法，注射細胞是和受治者組織相容的，它是經過傳代在細胞培養系統中擴增而得到的。在一個優選實施方案中，移植的細胞為真皮成纖維細胞，它來自受治者活體樣品培養物。
本發明還提供一種方法可使傳代的成纖維細胞基本上沒有培養基中存在的免疫原性蛋白，以便用於糾正皮膚缺損。該方法一個步驟是將擴增的成纖維細胞在無蛋白培養基中孵育一段時間。4.發明詳述本方法部分基於這樣的認識理想的用於增加缺損下臨近真皮和皮下組織體積的材料應該是正常情況下存在於真皮組織中的活細胞。該方法還基於這樣的認識通過在注射前幾周從受治者得到活體樣品，然後培養來可提供大量所需類型自身細胞。該方法進一步還基於這樣的認識經過這樣的組織培養擴增，自身細胞會含有一定量的抗原性蛋白，但是只要依照本申請的指導進行，這種蛋白可在注射前去除。4.1可注射細胞懸液的獲得方法本發明可以通過注射任何可擴大培養的未分化的中胚層細胞來進行。因為真皮成纖維細胞易於獲得且易於培養，而且是真皮及其下鄰近組織正常成分，因此在一個優選實施方案中，用它來注射。
真皮成纖維細胞培養從2×5mm全層活體皮膚樣品開始。因為移植外科醫師和免疫學家所熟知的同種異型排斥反應，培養的成纖維細胞與宿主組織相容甚為關鍵。從待修正其皮膚缺損的受治者獲得一塊活體樣品，並從它開始培養成纖維細胞可確保組織相容性一致。
開始培養前，將活體樣品在抗生素和抗真菌試劑中多次漂洗，然後小心地去除表皮和皮下脂肪組織----以便得到的培養物基本上沒有非成纖維細胞；將真皮用手術刀或手術剪儘量切開。樣品切片逐個用鑷子置於一個幹玻璃培養皿上。待其貼壁5-10分鐘後，緩慢加入少量培養液，注意不要吹起貼壁的組織塊。孵育24小時後，再添加一些培養基。用T-25培養瓶開始培養時，培養液的起始量是1.5-2.0ml。從活體樣品建立細胞系通常需要2-3周，到時候細胞就可以從最初的培養瓶中取出擴增。
在培養的早期階段，組織塊需要保持貼附在培養皿底部。脫離的組織塊需要重新植入新培養瓶中。依照這方面專業人員熟知的技術，組織培養物短暫暴露於EDTA-胰蛋白酶可以刺激成纖維細胞的生長。暴露應該短暫到不足以使成纖維細胞從皿底脫離。當培養物建立起來而快達到融合時，成纖維細胞可以採樣凍存。凍存寧早勿晚，因為正常成纖維細胞的傳代次數是有限的。
這些成纖維細胞可保存在任何適於保存成纖維細胞的培養液中。應用含70％生長液，20％(V/V)胎牛血清，10％二甲基亞碸(DMSO)的培養液效果就不錯。融化的細胞可以用來做傳代培養，然後用於同一受治者，免除了重新採樣品的不便。
任何從活組織檢查樣品中擴增真皮成纖維細胞培養方法，都可以用於本發明來擴增細胞。為這方面專業人員所熟知的方法，可參見R.I.Freshney主編的《動物細胞培養實用方法指南》(英國牛津IRL出版社1987年出版)以及R.I.Freshney主編的《動物細胞培養基本技術手冊》(紐約Alan R.Liss公司出版)。這些書做為以參考文獻併入該申請。
任何適合做原代成纖維細胞培養的培養液都可應用。大多數情況下，培養液中添加0.5％-20％(V/V)的血清來加快成纖維細胞的生長。血清濃度越高，細胞生長更快。在一個優選實施方案中，血清是胎牛血清，加到終濃度為10％。例如可以用高葡萄糖DMEM作培養液，添加2mM穀氨醯氨，110mg/L的丙酮酸鈉，10％(V/V)胎牛血清和抗生素(即形成「完全培養基」)。
細胞可以胰蛋白酶消化後在新培養瓶傳代，例如一瓶細胞可以分做三瓶來養。三底T-150型培養瓶有450平方釐米的培養面積，可以用於該發明。一個三底T-150型培養瓶可以接種6×106個細胞，長滿可有1.8×107個細胞。通常5-7天後細胞可以長滿，這時生長液換成無血清完全培養基；然後細胞孵育在---也就是保持在30-40℃至少6小時，12小時以上更好。最好是在37℃無蛋白培養基中孵育16-18小時。細胞培養在無血清培養液中培養，基本上可以去除細胞所帶的衍生於牛血清蛋白的蛋白質。這些蛋白對人體是免疫原性的，如果存在於注射物中，可以產生變態反應。
無血清培養結束後，將細胞從培養瓶中用胰蛋白酶/EDTA消化下來，通過離心重懸徹底洗滌。最終懸於等體積注射用等張鹽水中以備註射。六個三底T-150型培養瓶可以長滿可以收穫108細胞，這最多少可以做成大約1.0毫升懸液。
或者是，只要在配製成懸液的18個小時內被注射，這些細胞被轉移到4℃。細胞懸浮於等體積的完全培養基中用於運送，除了缺乏酚紅pH指示劑，用受試者血清代替胎牛血清。細胞可在到運送培養基中吸出和注射。
重懸細胞的鹽水或者運送用培養基的體積，要求並不嚴格。它取決於實施者打算注射的細胞數量，待治療缺損的大小和數目，受治者對治療效果要求的迫切性等因素。實施者可以讓細胞懸液的體積大一些，這樣在每個注射部位注射的細胞相應就會少一些。5.4.2用於獲得細胞粘稠懸液的變通方法本發明提供了一種製備注射用細胞懸液的變通方法，適用於真皮修復需要大量材料的情況。加厚嘴唇，治療鼻唇褶和皮下缺損就可遇到這種情況。
變通方法和上面描述的方法在細胞培養到106以前是一樣的。在直徑100mm的培養皿中，加入2ml受體的血漿和50-100單位(通常是50μl)的自身凝血酶，使其底部形成血漿凝塊，處理以後可以形成一個細胞培養面。將懸於3-5ml的1×106個培養成的真皮成纖維細胞接種於凝塊表面，在完全培養基中繼續培養7天。到7天時，完全培養基換成無血清培養基。在某種操作方法中，以一小時的間隔換兩次培養基，然後將細胞在無血清培養基中繼續培養14-16小時可以獲得滿意的效果。在無血清培養基中孵育完成後，凝塊可以吸入注射器，隨時注射。
在本發明一個變通實施方案中，成纖維細胞不做成懸液，而是以完整凝塊形式或者用手術刀切成所需形狀來使用。在真皮擦傷時，這種接種有成纖維細胞的凝塊表面做為受治者的真皮的覆蓋物。5.4.3將細胞用於受治者利用這個領域的專業人士使用ZYDERM和ZYPLAST時所用的同樣技術，本發明的懸液可以用來治療皮膚缺損。細胞懸液可以用來替代無末端膠原，而且具有以上開列的優點。關於利用可注射性材料來增厚缺損下真皮和皮下組織的代表性的教程可以見於外科學文獻Gonzales，U.M.發表於1992年Aesthetic Plastic Surgery 16卷231-4頁，Nicolle，F.V發表於1985年Aesthetic Plastic Surgery 9卷159-62頁以及Pieyre，J.M.發表於1985年Aesthetic Plastic Surgery 9卷153-54頁的文章。這些文獻的全部內容作為參考文獻引入該申請。
本發明的一個方案，可以用來治療細微的面部皺紋，方法如下先用酒精處理待治療區，然後將之牽拉成平面；取一注射器，裝滿細胞懸液，安上30ga的針頭，儘量表淺地將針頭刺入該區---夾角的方向並不關鍵---輕輕加壓，進行真皮內注射，直到可以看到局部輕微發白，注射多個地方。
在其它實施方案中，注射物可以放入口周匝肌來治療唇發育不良，也可以放入皮下組織來治療深部皮下缺損。
在一個變通方案中，以將真皮打磨到中層或深層來治療大片粉刺瘢痕。將一塊合成纖維細胞的血凝塊修整後覆蓋到剝露的表面，讓接種成纖維細胞的一面緊貼暴露的真皮層。所用的血凝塊然後用外科包裹劑Xeroform，Adaptic或者其它任何非閉合性外科包裹材料覆蓋。5.臨床實驗總結六個有不同真皮缺損的病人用以上方法進行了治療，診斷是笑紋(鼻唇褶)，兩個病人；口周放射紋，兩個病人；眉間皺紋；凹陷性瘢痕；唇發育不良；光化性頰紋。
每個病人先給預前臂測試劑量1.0ml細胞懸液。兩個病人發生了輕微的紅斑，但沒有其它反應的跡象。三周以後，在真皮缺損區進行了總劑量為1.0ml細胞懸液的治療性注射。再四周以後進行劑量1.0ml的第二次治療性注射。僅有唇發育不良病人採用第二次注射來治療同一缺損，而其它病人在每個治療區僅注射一次。
有的病人有很輕的紅斑，沒有即刻的全身或局部不良反應，注射後病人立刻就可以工作。每個病人，都立刻可見到疾病狀況改善。
伴隨注射，病人僅有很輕微的不適。這種不適據報告輕於注射牛無末端膠原。病人對治療表示滿意，渴望更進一步治療其它缺損。一些對治療不知情的病人的親友也反映病人的真皮缺損得到了糾正。雖然觸診可察覺到一些治療跡象，但是肉眼看不見皮膚治療的痕跡。
在注射後六個月的實驗期間，沒有遲發性局部或全身不良反應。沒有病人出現包塊或不規則和不平整現象。最有意義的是，經過注射後六個月的觀察，治療效果沒有減弱。這段時間中，牛無末端膠原預期應該已吸收。相反，一些可以長期隨訪的病人還可見到治療效果隨時間延長而增加。長期治療效果的遲發性提示注射的成纖維細胞是代謝活躍的，可以在注射部位產生額外的細胞外基質。
這裡所描述的具體方案是作為該發明的某一方面的一個範例而描述的，本發明的範圍不局限於此，功能相當的方法和成分也包括在此發明範圍內。的確，在此文中所描述的之外的本發明的多種修改對於本領域技術人員來說，從上面的描述中顯而易見的。這些改良是試圖包括在所附的權利要求中的。這裡所有引用的文獻作為參考文獻引入該申請。
權利要求
1.一種可用來在人類受試者中長期增加受治者皮下或真皮組織的方法，它包括a)提供基本上沒有免疫原性蛋白的經過傳代的自身真皮成纖維細胞；b)確認容易靠增加下臨近皮下和真皮組織來改善的缺損；c)把有效體積的懸液注射到缺損下臨近組織使其加厚。
2.權利要求1的方法，其中缺損指皮膚紋，皮膚擴張紋，凹陷性瘢痕，非創傷性皮膚凹陷或者嘴唇發育不良。
3.權利要求1的方法，其中懸液還包括足以形成可注射膠的有效量的人纖維蛋白。
4.權利要求3的方法，其中可注射膠包括凝血酶激活的自身血漿。
5權利要求1的方法，還包括下列步驟a)採集受治者真皮活體樣品；b)將從活體樣品得到的真皮成纖維細胞在含0.5-20％非人血清的培養基中傳代，以提供基本上無脂肪細胞，角質細胞和細胞外基質的成纖維細胞；c)將傳代的真皮成纖維細胞在無血清培養基中於30-40℃孵育至少6小時；以及d)將孵育的成纖維細胞用蛋白水解酶消化以懸浮成纖維細胞。
6.包括以下內容的一種修復受治者真皮缺損的裝置a)一種皮下注射器，它有一個注射腔，腔內有一個推桿，腔有一個出口和外界相通；b)一種懸液包括1)從受治者獲得的成纖維細胞---該成纖維細胞基本上沒有非成纖維細胞細胞，也基本上沒有對該受治者有免疫原性的蛋白；以及2)一種藥學上可以接受的載體溶液---該懸液置於注射器腔內；以及c)一種安在注射器出口的皮下針頭。
7.一種權利要求6的設備的製做方法，包括以下部分a)採取受治者真皮活體樣品；b)使真皮活體樣品中的真皮成纖維細胞在含0.5-20％非人類血清的培養液傳代，以提供基本上沒有成纖維細胞以外細胞的真皮成纖維細胞；c)將傳代的真皮成纖維細胞在30-40℃用無血清培養液孵育最少6小時；d)將孵育過的細胞暴露於蛋白水解酶以懸起成纖維細胞；以及e)在懸起的成纖維細胞中加入藥學上可以接受的載體溶液來形成一種懸液，將該懸液置於注射器腔。
8.一種治療普通粉刺後遺症的方法，它包括以下步驟a)提供一種接種真皮成纖維細胞的凝塊，這種真皮成纖維細胞來自該受治者，基本上沒有成纖維細胞以外的細胞，並且該凝塊不含對該受治者有免疫原性的蛋白；b)將粉刺後遺症部位剝露到中層或深層真皮；以及c)將該凝塊施於剝露部位，讓接種成纖維細胞的一面貼近真皮。
全文摘要
本申請涉及一種修補受治者皮下組織或真皮缺損的方法。這種方法內容包括從受治者活體樣品培養真皮成纖維細胞,然後用這種基本上無免疫原性蛋白的製劑去修補皮下或真皮組織。這種方法可用於修補皺紋,皮膚擴張紋,凹陷性瘢痕,非創傷性皮膚凹陷以及嘴唇增厚美容。
文檔編號A61Q19/08GK1198090SQ96197270
公開日1998年11月4日 申請日期1996年7月3日 優先權日1995年7月28日
發明者小·W·K·波斯 申請人:埃索拉根技術有限公司