一種赤芍注射液及其製備方法

2023-08-10 10:11:26 1

專利名稱：一種赤芍注射液及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種赤芍注射液，同時本發明還涉及該赤芍注射液的製備方法。
背景技術：
赤芍為傳統常用中藥，來源於毛茛科植物芍藥Paeonia Lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veilchii Lyncn的乾燥根。收載於《中華人民共和國藥典》2000年版一部，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，臨床用於溫毒發斑、吐血衄血、目赤腫痛、肝鬱脅痛、經閉通經、跌扑損傷等症。近年來的藥理研究表明，赤芍具有保護心臟、增加冠脈血流量、抗血栓形成及動脈粥樣硬化、鎮靜鎮痛、抗炎抗菌、抗氧化等多方面藥理作用。植物化學研究結果表明，赤芍的主要有效成分為芍藥苷、芍藥內酯苷、羥基芍藥苷等單萜類化合物。目前臨床上使用的赤芍注射液為水醇法製備的小水針，有效成分含量低，質量不夠穩定，影響了治療效果。臨床上迫切需要有效成分含量高、質量穩定、有效期長、療效高的赤芍注射液。

發明內容
本發明的目的在於提供一種有效成分含量高、療效高、質量穩定、有效期長的赤芍注射液，包括小水針和大輸液，該注射液可用於肌肉注射、靜脈注射或靜脈滴注。
本發明的另一目的在於提供該赤芍注射液的製備方法。
本發明提供的一種赤芍注射液，其基本組成為每升注射液中含有100～2500克赤芍、0.3～50克注射用藥用輔料，其餘為注射用水。
本發明所使用的原料—赤芍，符合《中國藥典》2000年版一部赤芍項下有關的各項規定。本發明所採用的注射用藥用輔料為甘露醇、氯化鈉、山梨醇、葡萄糖、果糖、亞硫酸氫鈉中的一種或幾種。
本發明提供的赤芍注射液的製備方法，包括以下三個步驟(1)提取取赤芍藥材，切片，每次用4～12倍量60～80％的乙醇回流提取2～4次，每次0.5～3小時，合併提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇並濃縮至相對密度為1.15～1.25的濃縮液，加入2～5倍量的水，攪拌均勻，冷藏12～72小時，高速離心，上清液減壓濃縮至相對密度1.25～1.30的清膏，加乙醇使含醇量至80～85％，攪勻，冷藏12～48小時，濾取上清液加氨水調pH至8.0，冷藏12～48小時，濾過，濾液減壓回收乙醇並濃縮至相對密度為1.05～1.18的濃縮液，得提取液；(2)純化取上述提取液，採用正丁醇萃取法或大孔樹脂柱層析法製得純化物；(3)配製取上述純化物，加注射用水溶解，調pH至5.0～5.5，加熱煮沸5～10分鐘，冷藏，濾過，濾液用截留分子量3000的超濾膜超濾，取濾液加注射用水和注射用藥用輔料，攪拌溶解，調pH至6.0～7.0，用0.22um的微孔濾膜濾過，濾液灌封、滅菌、質檢，即製得本發明注射液。
上述製備方法中所述的正丁醇萃取法是取提取液，每次用等體積的正丁醇萃取，共萃取3～6次，合併萃取液，減壓回收、乾燥，即得純化物；所述的大孔樹脂柱層析法是取提取液，加到大孔吸附樹脂層析柱上，先用提取液重量10～50倍的水洗脫，棄去洗脫液，再用提取液重量10～50倍的10～30％乙醇洗脫，收集此洗脫液，減壓回收、濃縮、乾燥，即得純化物。所述的注射用藥用輔料為甘露醇、氯化鈉、山梨醇、葡萄糖、果糖、亞硫酸氫鈉中的一種或幾種。
本發明製備的赤芍注射液有很好的穩定性，經穩定性試驗研究表明有效期長達2.1年，大大超過目前赤芍注射液1.5年的有效期；澄明度、色澤、pH值、熱源、刺激性等指標均符合《中國藥典》有關注射劑的規定。可用於肌肉注射、靜脈滴注或靜脈注射給藥。本發明藥物具有使用方便、起效迅速、生物利用度高、效果確切等優點，經藥效學試驗表明本發明能明顯改善腦梗塞大鼠的行為障礙，減小腦梗塞面積，顯著降低梗塞腦組織含水量，減輕腦組織的脂質過氧化損傷，提高小鼠腦耐急性缺氧的能力，對腦梗塞具有良好的治療作用。
實驗分組與給藥(1)假手術組；(2)模型(溶劑治療)組；(3)本發明注射液iv小劑量組；(4)本發明注射液iv中劑量組(5)本發明注射液iv大劑量組；(6)丹參注射液iv治療組。
於造模後30min與12h分別按各劑量給藥一次。
觀察指標(1)神經病學評分存活鼠再灌注24h後，觀察大鼠行為學變化，進行神經病學評分。
參考Zea Longa的5分制評分標準0分，無神經損傷症狀；1分，不能完全伸展對側前爪；
2分，向外側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。
(2)腦梗塞範圍的測定進行上述兩項指標測定後大鼠斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦幹後切成5片，以紅四氮唑(TTC)染色。正常組織經染色後呈紅色，梗塞組織呈白色。計算梗塞組織重量佔總腦重的百分比作為梗塞範圍。
(3)腦含水量測定神經病學評分後，快速斷頭取鼠大腦。一部分分別稱左右腦半球溼重，置100℃烤箱烘乾至恆重，按以下公式計算腦組織含水量，腦組織含水量(％)＝(溼重-乾重)/溼重×100％。
(4)腦組織生化指標的測定將部分動物取腦組織進行均漿測定腦組織中SOD、LPO含量。
(5)病理檢查另一部分10％福馬林中固定，經脫水、包埋、切片、染色等步驟製備組織切片，進行病理組織學檢查。1.2結果1.2.1一般觀察經過腦梗塞的大鼠麻醉清醒後即有偏癱樣症狀出現。主要表現為不同程度的手術對側前肢內收，肩內旋，肌張力降低，推右肩向對側移動，抵抗阻力降低，甚至有些動物還出現不停地向一側轉圈現象。表1顯示，與模型組(生理鹽水治療)比較，術後24h的行為評分本發明各劑量治療組和丹參治療組均有明顯低的行為學評分，統計分析有顯著差異(P＜0.01)。術後模型組動物的一般狀態較差，活動減少，大多數動物體重有所下降，而各治療組動物一般狀況均有明顯的改善。
選取各實驗組前8隻大鼠進行神經病學評分，iv本發明注射液高、中組大鼠與模型組比較，大鼠的行為障礙明顯地改善(P＜0.01)，有些動物幾乎完全恢復正常。假手術組動物行為無異常(見表1)。
表1 本發明注射液對大鼠大腦中動脈梗塞後的神經病學評分影響(x±s)組別 劑量n 神經病學評分(g/kg)假手術 - 10 0模型 - 9 1.6±0.77丹參 10ml/kg8 0.8±0.75*本發明 8 8 0.5±0.32**4 9 0.6±0.57**2 9 0.9±0.83*與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0011.2.2大鼠腦梗塞範圍的觀察及本發明注射液對梗塞範圍的影響由表2可以看出，腦缺血再灌注24h後腦組織梗塞程度明顯，梗塞面積佔總腦面積的36.68±10.51％。本發明注射液和丹參注射液給藥後，使腦梗塞面積百分比明顯下降。假手術組動物未見腦梗塞發生。
表2 本發明注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用(x±s)組別 n 劑量(g/kg) 梗塞面積(％)模型組 9 036.68±10.51丹參組 810ml/kg 13.32±4.77***本發明 8 219.96±7.28**本發明 8 412.13±7.45***本發明 9 88.05±2.51***與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。1.2.3腦含水量從表3可以看出，各組大鼠未梗塞的左側大腦的溼重，乾重均無明顯的差別；而對於梗塞的右側腦組織，模型組腦含水量顯著高於假手術組；本發明注射液大劑量組和中劑量組則顯著低於模型對照組，而與假手術組接近，本發明注射液小劑量組的腦含水量雖有降低趨勢，但與模型對照組相比無統計學意義，丹參注射液治療組也有降低腦含水量的作用。
表3腦梗塞大鼠腦含水量的比較(x±s，n＝8)組別 劑量 左腦 右腦(g/kg) 溼重(mg) 乾重(mg) 含水量(％)溼重(mg) 乾重(mg) 含水量(％)假手術 784.6±34.2 180.1±10.9 77.0±0.93793.1±55.2 182.8±17.9 77.0±0.93模型組 813.1±20.6 187.1±11.8 77.0±1.32838.1±64.2 171.6±12.1 79.5±0.73**丹參10ml/kg 813.6±41.5 186.9±14.8 77.0±1.01862.6±29.6 181.8±10.3 78.3±1.37#本發明2 814.9±39.9 188.1±18.1 76.9±1.43847.1±42.8 179.0±5.51 78.7±0.29本發明4 826.0±37.9 189.8±10.7 77.0±1.14833.0±53.7 179.5±11.9 78.4±1.05#本發明8 835.1±38.8 190.8±18.9 77.2±1.35865.8±45.9 193.0±15.0 77.7±0.88##與假手術組比較，**P＜0.01； 與模型組比較#P＜0.05，##＜0.01。1.2.4腦組織超氧化物岐化酶、脂質過氧化物水平的變化造模後24h觀察，模型組大鼠腦組織LPO含量均較正常組顯著增高，SOD含量顯著降低。丹參組及本發明注射液大、中劑量組與模型組比較，LPO含量均降低；本發明注射液組SOD含量均增高。提示本發明注射液能升高組織SOD含量，降低LPO水平，從而減輕腦組織的脂質過氧化損傷。見表4。
表4 本發明注射液對大鼠腦勻漿SOD、LPO含量的影響(x±s)組 別 LPO(nmol/100mg.Pro) SOD(U/mg.Pro)正常對照組256.11±88.21 17.36±2.31*模型組378.88±105.78 13.12±3.98丹參組292.23±85.87* 20.61±3.83**本發明大劑量組249.11±96.28**25.43±4.25**本發明中劑量組293.09±48.39**20.31±3.61**本發明小劑量組311.26±144.39 19.25±3.57*1.2.5大鼠腦梗塞後組織形態學變化及本發明注射液的影響大鼠經腦梗塞術後24h，病灶側腦表面蒼白、無光，腦表面血管較對側充血，血管數目也有所增多，位於嗅束和大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈顏色變暗。術後48h病灶側腦組織水腫明顯，隨時間延長逐漸出現軟化。在光鏡下觀察腦組織切片，可見大腦中動脈內有血栓形成，血栓成分主要是血小板、紅細胞和纖維蛋白，表現為混合血栓的特徵。腦組織主要呈缺血性改變，隨時間延長，缺血軟化灶範圍和深度有所增加。假手術組無明顯病理改變。
經本發明治療後的動物，肉眼即可見大腦中動脈較對照組動物紅潤，組織切片示血栓明顯減輕甚至完全溶解。腦組織缺血程度減輕，只有小片軟化灶。而丹參組的動物，血栓也明顯減輕。各實驗組大腦組織病理學改變如下假手術組神經元及腦實質細胞結構基本正常，細胞核未見腫脹，核仁清楚，虎斑清晰可見，細胞周圍間隙略擴大，毛細血管內有輕微充血，呈輕度變性水腫改變。
模型(生理鹽水治療)組左側大腦半球結構基本正常，呈輕度水腫改變；右側見神經元及腦實質細胞周圍間隙明顯擴大，細胞核腫脹明顯，核仁模糊，腦實質內有出血，毛細血管周圍間隙擴大，成變性，壞死，出血改變。
丹參注射液組左側腦細胞結構未見異常，僅見細胞周圍間隙略增大，呈輕度變形，水腫表現。右側神經元及細胞核輕度腫脹，核仁不清，腦實質細胞周圍間隙增大，毛細血管周圍有少量滲出性出血，呈變性，水腫及出血改變。
本發明注射液大劑是量組左側腦細胞結構未見異常，細胞周圍間隙略增寬，呈輕度變形改變。右側神經元及腦實質細胞、毛細血管周圍間隙略增大，神經元細胞核輕度腫脹，核仁清楚，可見較多胞質細胞增生現象。呈變性，水腫改變。
本發明注射液中劑是量組左側腦細胞結構未見異常，細胞周圍間隙略增大，呈輕度變形改變。右側神經元及腦實質細胞、毛細血管周圍間隙略增大，神經元細胞核輕度腫脹，核仁不見，可見較多膠質細胞增生，呈變性，水腫改變。
本發明注射液小劑量組左側腦細胞結構未見異常，細胞周圍間隙略增大。神經元及腦實質細胞、毛細血管周圍間隙略增大，細胞輕度水腫，核仁不清，毛細血管內有充血，周圍間隙增大，呈變性，水腫改變。2.對小鼠急性腦出血的影響昆明種小鼠50隻，體重18-22g，隨機分成5組，每組10隻，用藥組分別iv給予本發明注射劑4g/kg，8g/kg，16g/kg；陽性對照組丹參注射液20ml/kg，生理鹽水組iv等容量的5％葡萄糖注射液。連續給藥3d，末次給藥後30min將小鼠逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭後至張口喘氣停止時間、張口次數以及凝血時間。結果見表5。
結果表明，本發明注射液各劑量組給藥後均能明顯延長小鼠斷頭張口次數及呼吸時間，凝血時間也延長，以本發明低劑量組最為顯著。表明本發明可提高小鼠腦耐急性缺氧的能力，改善腦能量代謝，並且具有活血化瘀之功效。
表5 本發明注射液對小鼠急性腦缺血以及凝血時間的影響(n＝10)劑量 張口呼吸連續時間組別張口次數 凝血時間(s)(g/kg) (s)5％葡萄糖注射液 - 11.8±2.0 14.2±2.3 49.6±16.5本發明低劑量組4 16.1±3.3**17.9±2.7**86.1±61.2**本發明中劑量組8 13.9±2.6*19.1±2.2**75.1±19.1*本發明高劑量組 16 14.8±3.4*19.2±1.8**76.2±16.3*丹參組 20ml/kg 14.8±3.4*19.7±3.0**60.1±21.2*與5％葡萄糖注射液組比較，*P＜0.05，**P＜0.01以上實驗結果表明，本發明對腦梗塞具有良好的的治療作用。
權利要求
1.一種赤芍注射液，其基本組成為每升注射液中含有100～2500克赤芍、0.3～50克注射用藥用輔料，其餘為注射用水。
2.根據權利要求1所述的赤芍注射液，其特徵在於所述的注射用藥用輔料為甘露醇、氯化鈉、山梨醇、葡萄糖、果糖、亞硫酸氫鈉中的一種或幾種。
3.權利要求1所述的赤芍注射液的製備方法，該方法包括以下三個步驟(1)提取取赤芍藥材，切片，每次用4～12倍量60～80％的乙醇回流提取2～4次，每次0.5～3小時，合併提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇並濃縮至相對密度為1.15～1.25的濃縮液，加入2～5倍量的水，攪拌均勻，冷藏12～72小時，高速離心，上清液減壓濃縮至相對密度1.25～1.30的清膏，加乙醇使含醇量至80～85％，攪勻，冷藏12～48小時，濾取上清液加氨水調pH至8.0，冷藏12～48小時，濾過，濾液減壓回收乙醇並濃縮至相對密度為1.05～1.18的濃縮液，得提取液；(2)純化取上述提取液，採用正丁醇萃取法或大孔樹脂柱層析法製得純化物；(3)配製取上述純化物，加注射用水溶解，調pH至5.0～5.5，加熱煮沸5～10分鐘，冷藏，濾過，濾液用截留分子量3000的超濾膜超濾，取濾液加注射用水和注射用藥用輔料，攪拌溶解，調pH至6.0～7.0，用0.22um的微孔濾膜濾過，濾液灌封、滅菌、質檢，即製得本發明注射液。
4.根據權利要求3所述的赤芍注射液的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的正丁醇萃取法是取提取液，每次用等體積的正丁醇萃取，共萃取3～6次，合併萃取液，減壓回收、乾燥，即得純化物。
5.根據權利要求3所述的赤芍注射液的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的大孔樹脂柱層析法是取提取液，加到大孔吸附樹脂層析柱上，先用提取液重量10～50倍的水洗脫，棄去洗脫液，再用提取液重量10～50倍的10～30％乙醇洗脫，收集此洗脫液，減壓回收、濃縮、乾燥，即得純化物。
全文摘要
本發明公開了一種赤芍注射液，它是以中藥赤芍為原料經醇提、正丁醇萃取或大孔樹脂柱層析純化後，加入適量注射用藥用輔料和注射用水製備而成，包括小水針和大輸液。本發明穩定性好、有效期長，可用於肌肉注射、靜脈注射或靜脈滴注。經藥效學試驗表明本發明能明顯改善腦梗塞大鼠的行為障礙，減小腦梗塞面積，顯著降低梗塞腦組織含水量，減輕腦組織的脂質過氧化損傷，提高小鼠腦耐急性缺氧的能力，對腦梗塞具有良好的治療作用。
文檔編號A61K9/08GK1481882SQ0313994
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月25日 優先權日2003年7月25日
發明者秦吉興 申請人:秦吉興